1、2022年6月3日星期五1第六章第六章 发酵工业的种子制发酵工业的种子制备备2022年6月3日星期五2本章内容：本章内容： 一、种子制备原理与技术一、种子制备原理与技术 二、影响种子质量的因素二、影响种子质量的因素 三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施 四、种子制备的放大原理与四、种子制备的放大原理与技术技术2022年6月3日星期五3一、种子制备原理与技术1、优良种子应具备的条件、优良种子应具备的条件生长活力强，延迟期短；生长活力强，延迟期短；生理状态稳定；生理状态稳定；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；无杂菌污染，保证纯种发酵；无杂菌污染，保证纯
2、种发酵；适应性强，生产能力稳定。适应性强，生产能力稳定。2022年6月3日星期五42、种子罐级数的确定、种子罐级数的确定 种子扩大的级数：种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大制备种子需逐级扩大培养的次数培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。常而造成的发酵波动。2022年6月3日星期五5 确定方法确定方法菌种的性质菌种的性质( (如菌种传代后的稳定性如菌种传代后的稳定性) )瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝
3、繁殖速瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度度发酵罐中种子培养液的最低接种量发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比种子罐与发酵罐的容积比生产规模生产规模随工艺条件的改变作适当的调整随工艺条件的改变作适当的调整2022年6月3日星期五63、种子质量的判断方法、种子质量的判断方法v通常检测的培养液中参数通常检测的培养液中参数pHpH是否在种子要求的范围之内是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染有无杂菌污染 v其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾其他参数，如接种前酶活、种子
4、罐的溶氧和尾气等气等 2022年6月3日星期五74、种子制备、种子制备v步骤：步骤：斜面培养基中活化；斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐种子转种至发酵罐2022年6月3日星期五8种子制备过程种子制备过程v实验室种子制备阶段：实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培
5、养养等或液体摇瓶培养 v生产车间种子制备阶段：生产车间种子制备阶段：种子罐扩大种子罐扩大培养培养 2022年6月3日星期五92022年6月3日星期五102022年6月3日星期五11实验室种子制备 v无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。v菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体培养基培养孢子。迅速，可用固体培养基培养孢子。v菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法。摇瓶液体培养法。v不产孢子的菌种，
6、保藏基础上，在一定温不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可。度下活化即可。2022年6月3日星期五12v种子扩大培养阶段种子扩大培养阶段液体培养法：液体培养法：液体试管、三角瓶摇床液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。振荡或回旋式培养。表面培养法：表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。培养。固体培养法：固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。瓶、培养皿等麸皮培养。2022年6月3日星期五13生产车间种子制备 v实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐进行扩大培养。v种子罐培
7、养一获得足够的菌种数量，二种子罐培养一获得足够的菌种数量，二种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵环境。分和培养条件，使菌体适应发酵环境。 2022年6月3日星期五14v种子罐级数越少，越有利于简化工艺种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。常而造成的发酵波动。 v但考虑能否在一定时间内获得优质、但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求。足量的种子以满足发酵的需求。2022年6
8、月3日星期五1515L15L种子发酵罐种子发酵罐2022年6月3日星期五16实验室准备阶段实验室准备阶段生产车间阶段生产车间阶段放罐，后处理放罐，后处理产品产品2022年6月3日星期五175、种龄与接种量、种龄与接种量v 接种龄接种龄 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。且会降低产量。2022年6月3日星期五18放射形土壤杆菌多糖（放射形土壤杆菌多糖（A
9、RPSARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响 2022年6月3日星期五19v大量地接入培养成熟的菌种的优点：大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率发酵周期，提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会有利于减少染菌机会2022年6月3日星期五20接种量接种量v接种量：接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例的体积的比例 v接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老接种量过多，菌丝生长过快、
10、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足细胞增加等，发酵后劲不足v接种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而接种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。且易造成染菌。 v以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据。以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据。v接种量的大小直接影响发酵周期。接种量的大小直接影响发酵周期。2022年6月3日星期五21在放射形土壤杆菌多糖（在放射形土壤杆菌多糖（ARPSARPS）发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响 2022年6月3日星期五22本章内容：本章内容： 一、种子制备原理与技术一、种子制备原理与技术 二、影响种子质量的因素
11、二、影响种子质量的因素 三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施 四、种子制备的放大原理与四、种子制备的放大原理与技术技术2022年6月3日星期五23二、影响种子质量的因素v原材料质量原材料质量v培养温度培养温度v湿度湿度v通气与搅拌通气与搅拌v斜面冷藏时间斜面冷藏时间v培养基培养基vpHpH2022年6月3日星期五241.1.原材料质量原材料质量v原材料质量波动引起种子质量不稳定。原材料质量波动引起种子质量不稳定。v原材料质量波动的主要原因：原材料质量波动的主要原因：无机离子无机离子含量不同（微量元素含量不同（微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能能刺激孢子的形成
12、，磷含量太多或太少也刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。会影响孢子的质量）。 2022年6月3日星期五25例例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。质量的影响也不同。例例2：制备霉菌用的制备霉菌用的大大(小小)米米，其产地、颗粒大小、均匀程，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。度不同，孢子质量也不同。 例例3：蛋白胨蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。加工原料不同，对孢子影响也不同。 例例
13、4：琼脂琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子质量的变化。质量的变化。 例例5：水质水质的硬度、污染程度对生产均有影响。的硬度、污染程度对生产均有影响。2022年6月3日星期五262 2、培养温度、培养温度 v温度过低，菌种生长发育缓慢温度过低，菌种生长发育缓慢v温度过高会使菌丝过早自溶温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于在制备土霉素生产种子过程中，高于3737培养时，培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降
14、低等现象。2022年6月3日星期五273、湿度、湿度v湿度低，孢子生长快；湿度低，孢子生长快；v湿度大，孢子生长慢湿度大，孢子生长慢 制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。状，孢子稀少。 在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。2022年6月3日星期五28 4、通
15、气与搅拌、通气与搅拌 v足够的通气量，以保证菌种代谢正常，足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。提高种子的质量。 v搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。染菌机会，增加能耗。v丝状微生物不宜剧烈搅拌。丝状微生物不宜剧烈搅拌。2022年6月3日星期五29例如例如: 青霉素生产，将通气充足和不足情况青霉素生产，将通气充足和不足情况下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相差差1
16、倍。倍。 但也有例外但也有例外 例如：例如：土霉素生产中，一级种子罐的通土霉素生产中，一级种子罐的通气量小对发酵有利。气量小对发酵有利。2022年6月3日星期五305、斜面冷藏时间、斜面冷藏时间 v对孢子的生产能力有较大影响对孢子的生产能力有较大影响 v冷藏时间越长，生产能力下降越多冷藏时间越长，生产能力下降越多 链霉素生产中，斜面孢子在链霉素生产中，斜面孢子在66冷藏两冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低1818，冷藏冷藏3 3个月的降低个月的降低3535。 2022年6月3日星期五316、培养基、培养基v培养种子的目的：培养种子的目的：扩大培养，增加细
17、胞数量；扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。丝快速生长。2022年6月3日星期五32v有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近应考虑与发酵培养基的主要成分相近。种子
18、培养基特点种子培养基特点2022年6月3日星期五337 7、pH pH v选择最适种子培养选择最适种子培养pHpH的原则是获得的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量。最大比生长速率和适当的菌量。v培养最后一级种子的培养基的培养最后一级种子的培养基的pHpH应应接近于发酵培养基的接近于发酵培养基的pHpH，以便种子，以便种子能尽快适应新的环境。能尽快适应新的环境。 2022年6月3日星期五34本章内容：本章内容： 一、种子制备原理与技术一、种子制备原理与技术 二、影响种子质量的因素二、影响种子质量的因素 三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施 四、种子制备的放大原理与四、种子制备的放大原理
19、与技术技术2022年6月3日星期五35三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施 v菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株，测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮。并及时对退化菌种进行复壮。 v提供适宜的生长环境提供适宜的生长环境v种子无杂菌检查，保证纯种发酵。种子无杂菌检查，保证纯种发酵。 种子液生化分析项目主要有：营养基质的消种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、耗速度、pHpH变化、溶氧变化、色泽和气味等。变化、溶氧变化、色泽和气味等。2022年6月3日星期五36本章内容：本章内容： 一、种子制备原理与技术一、种子制备原理与技术
20、二、影响种子质量的因素二、影响种子质量的因素 三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施 四、种子制备的放大原理与四、种子制备的放大原理与技术技术2022年6月3日星期五37四、种子制备的放大原理与技术四、种子制备的放大原理与技术v1 1、细菌发酵时的种子扩大培养：、细菌发酵时的种子扩大培养：v细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的的是为了获得大量的活力强的种子是为了获得大量的活力强的种子 ；v种龄对于生芽孢的种子尤其重要种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接。若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期。长迟滞期。 2022年
21、6月3日星期五38梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种子扩大培养的程序梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种子扩大培养的程序 举举 例：例： 2022年6月3日星期五392、酵母发酵时的种子扩大培养、酵母发酵时的种子扩大培养v酿酒酵母的扩大培养酿酒酵母的扩大培养 最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为为1010，并控制繁殖条件与酿造时一致。，并控制繁殖条件与酿造时一致。 现代的流程中，接种量为现代的流程中，接种量为1%1%或更低，控或更低，控制的条件也与酿造时不同。制的条件也与酿造时不同。2022年6月3日星期五
22、40面包酵母时的种子扩大培养的程序面包酵母时的种子扩大培养的程序 2022年6月3日星期五413、丝状真菌发酵的种子扩大培养、丝状真菌发酵的种子扩大培养 丝状真菌既可以利用孢子，也可丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵。罐进行发酵。 2022年6月3日星期五42在固化的培养基上产生孢子在固化的培养基上产生孢子“滚瓶滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生技术应用于产黄青霉的孢子生产产在固体培养基上产生孢子在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产生孢子在液体深层培养基中产生孢子
23、v 1）利用孢子作为接种物利用孢子作为接种物 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气条件下，培养基中含氮是在通气条件下，培养基中含氮是在0.050.050.10.1（w/vw/v）之间时，可以产生大量的孢子。）之间时，可以产生大量的孢子。 2022年6月3日星期五432）丝状真菌的菌丝体作为接种物）丝状真菌的菌丝体作为接种物 v不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种为接种物，如生产赤霉素的菌种藤仓赤霉。藤仓赤霉。v问题：难以获得均一的接种物。问题：难以获得均一的接种物。 v接种前将菌丝打成碎片，形成大量的接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点。菌丝段，它具有大量的生长点。 2022年6月3日星期五444、放线菌发酵时的种子扩大培养、放线菌发酵时的种子扩大培养v斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子。子。v可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子。可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子。
