1、 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养一、无菌技术一、无菌技术 无菌技术：是将微生物分离、转接及培无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时防止被其它微生物污染的技术。养时防止被其它微生物污染的技术。 1 1、对使用的器皿及用具的灭菌、对使用的器皿及用具的灭菌 2 2、对培养基的灭菌、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物生物) )。 3 3、无菌的环境、无菌的环境 （1 1）在操作过程中的无菌要求：接种、）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操分离
2、过程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。作）。 （2 2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操作。使用甲醛、紫外线、进行操作。使用甲醛、紫外线、75%75%的乙的乙醇等进行预处理及其他的必要措施。醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3 3）如进行好氧培养需对空气进行处理，）如进行好氧培养需对空气进行处理，实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中使用空气过滤器过滤空气。气，工业中使用空气过滤器过滤空气。二、微生物的分离方法二、微生物的分离方法 1 1、平皿划线分离法、平皿划线分离法 将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中，将灭好菌
3、的琼脂培养基倒入培养皿中，凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培养基的表面上进行划线，经培养后形成菌养基的表面上进行划线，经培养后形成菌落。菌落在划线开始处较密集，在划线的落。菌落在划线开始处较密集，在划线的结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达到分离的目的。到分离的目的。 划线的方法有：连续划线法、扇形划线划线的方法有：连续划线法、扇形划线法、方格划线法和平行划线法。法、方格划线法和平行划线法。 特点：快速、方特点：快速、方便。便。 分区划线适用于分区划线适用于浓度较大的样品；浓度较大的样品；连续划线适用于连续划线适用于浓度
4、较小的样品；浓度较小的样品；连续划线连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片划线分离后平板上显示的菌落照片 2 2、稀释分离法、稀释分离法 （1 1）液体稀释法）液体稀释法（1 1）液体稀释法）液体稀释法 首先将待分离的样品进行连续稀释首先将待分离的样品进行连续稀释, ,目的是得到高度稀释的效果目的是得到高度稀释的效果, ,使一支试管使一支试管中分配不到一个微生物。如果经过稀释中分配不到一个微生物。如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长后的大多数试管中没有微生物生长, ,那么那么有微生物生长的试管得到的培养物可能有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培就是由一个微
5、生物个体繁殖而来的纯培养物。养物。 这种方法适合于细胞较大的微生物。这种方法适合于细胞较大的微生物。（2 2）稀释倒平板法）稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释，首先将待分离的样品进行连续稀释，取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对于热敏感菌不适用），培养到平板上长出于热敏感菌不适用），培养到平板上长出单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通常仅张在平板的表面，对于与营养琼脂混常仅张在平板的表面，对于与营养琼脂混合的样品菌落通常出现在平板的表面和内合
6、的样品菌落通常出现在平板的表面和内部。部。（3 3）涂布平板法）涂布平板法 将经过稀释的样品滴加入已制好并灭将经过稀释的样品滴加入已制好并灭好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将菌液均匀菌液均匀 的涂抹在整个平板上，经培养的涂抹在整个平板上，经培养长出单一菌落。具体分为两种方法：将长出单一菌落。具体分为两种方法：将0.1ml0.1ml样品加入固体培养基表面，用无菌样品加入固体培养基表面，用无菌涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养皿中，加入皿中，加入454
7、550 50 固体培养基迅速混固体培养基迅速混匀进行培养。匀进行培养。 3 3、单细胞（单孢子）挑取法、单细胞（单孢子）挑取法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样
8、品制小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。的液滴来进行纯培养物的分离。 4 4、选择性培养分离法、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。的方法进行分离。 利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离 富集培养富集培养 三、微生物的培养三、微生物的培养 1、好氧培养和厌氧培养好氧培养和厌氧
9、培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室好氧培养以空气为氧的来源。实验室的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业生产时用自然对流和机械通风法来供氧；生产时用自然对流和机械通风法来供氧；液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧；液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧；液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气达到供氧的目的。达到供氧的目的。 厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气的方法来实现的。实验室培养时，可将的方法来实现的。实验室培养时，可将
10、菌种接种到固体、半固体培养基的深层菌种接种到固体、半固体培养基的深层进行培养，同时加入还原剂；也可将厌进行培养，同时加入还原剂；也可将厌氧微生物放入真空干燥器，抽出空气，氧微生物放入真空干燥器，抽出空气，并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气体。体。 2 2、分批培养和连续培养、分批培养和连续培养 分批培养：将微生物置于一定容积的、分批培养：将微生物置于一定容积的、定量的培养基中培养，培养基一次性加入，定量的培养基中培养，培养基一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。分批不再补充和更换，最后一次性收获。分批培养的过程中菌体、各种代谢产物的数目培养的过程中菌体、
11、各种代谢产物的数目与营养物的数目呈负相关性。当微生物生与营养物的数目呈负相关性。当微生物生长及基质变化达到一定时，菌体生长则会长及基质变化达到一定时，菌体生长则会停止。在发酵工业中可用中间补料或连续停止。在发酵工业中可用中间补料或连续流加物料，使培养基中营养物质的浓度保流加物料，使培养基中营养物质的浓度保持在适合菌体生长和有利于菌体积累代谢持在适合菌体生长和有利于菌体积累代谢产物的环境中。产物的环境中。 连续培养：在微生物培养的过程中，不连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物体及代谢产物的发
12、酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养连续培养理论基础：由于对典型生长曲理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。续培养技术。 连续培养原理连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以
13、溢流方式流鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。状态和稳定的生长速率。n 连续培养和单批培养的比较连续培养和单批培养的比较单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lglg细胞数细胞数（个（个/ml/ml）连续培养连续培养 连续培养器连续培养器连续连续培养培养器器按控制方式分按控制方式分按培养器的级数分按培养器的级数分按细胞状态分按细胞状态分按用途分按用途
14、分内控制（控制菌体密度）：恒浊器内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器生长速率）：恒化器单级连续培养器单级连续培养器多级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐发酵生产用：连续发酵罐 连续培养技术连续培养技术恒化连续培养恒化连续培养 概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。保持细菌生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、原理：
15、通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等）氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的特点：维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究。应用范围：实验室科学研究。恒化器恒化器 连续培养技术连续培养
16、技术恒浊培养恒浊培养 概念：通过调节培养基流速，使培养液概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来和培养物流出的速度来维持菌浓度不变维持菌浓度不变, ,即即浊度不变浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。减慢培养基的流速。 连续培养技术连续培养技术恒恒浊培养浊培养 特点：基质过量，微生特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行物始终以最高速率进
17、行生长，并可在允许范围生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。但工艺复杂，烦琐。 使用范围：用于生产大使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。物，如乳酸、乙醇等。 恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较装置装置控制对控制对象象培养培养基基培养基培养基流速流速生长生长速率速率产物产物应用应用范围范围恒浊恒浊器器菌体密菌体密度（内度（内控制）控制）无限无限制生制生长因长因子子不恒定不恒定最高最高大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体形成相平形成相平行的产物行的产物生产生产为主为主恒
18、化恒化器器培养基培养基流速流速（外控（外控制）制）有限有限制生制生长因长因子子恒定恒定低于低于最高最高不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验实验室为室为主主 连续发酵连续发酵 连续培养在生产上的应用，相对于单批连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。发酵而言。 优点：高效，简化了操作了装料、灭菌、优点：高效，简化了操作了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。水、汽、电
19、的负荷均衡合理。 连续发酵连续发酵 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月至一般只能维持数月至1 1年。年。 固定化细胞连续培养固定化细胞连续培养 细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面，吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。产物。 优点：可提供高密度的细胞；减少细胞优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。的分离工艺。 缺点：成本高；易污染；物质传递阻力缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。 3 3、混菌培养、混菌培养 两种或两种以上的微生物的培养。通两种或两种以上的微生物的培养。通常是在发酵工业中用两种或两种以上的常是在发酵工业中用两种或两种以上的具有互补性质的菌种进行混合培养。具有互补性质的菌种进行混合培养。
