1、1第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度计及吸收光谱分光光度计及吸收光谱10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素10.5 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制10.6 光度分析法的应用光度分析法的应用2化学分析化学分析(Chemical analysis)：常量组分常量组分(1%), Er 0.1%0.2%依据化学反应依据化学反应, 使用玻璃仪器使用玻璃仪器 仪器分析仪器分析(Instrumental analysis)：微量组分微量组分(105：超高灵敏；超高灵敏； =(610）104 ：高灵敏；高灵
2、敏； 104)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别 ( 60nm) 显色反应要求显色反应要求53NNN NSO3HHO3SOHH O As32AsOOOHMO配位反应配位反应氧化还原反应氧化还原反应2 显色反应类型显色反应类型NNFe2+3NHHOOCCOOH+ VO3-+ H+NNCOOHCOOHHOOCHOOC+ VO2+ H O2偶氮胂偶氮胂III54离子缔合反应离子缔合反应CCOOHNN(C H )22 5(C H )22 5H+O-AuCl4.成盐反应成盐反应 (CH3)2NCHSCOCCH
3、NS(CH3)2NCCOCCHNS+ AgAgSAuCl4-罗丹明罗丹明B吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 553 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾NNNNSO3HHO3SOHOHAsO H32H O As32有机显色剂：有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III56三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S OCH3COOHHOCClClSO3HCH3COOH 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 CN(CH3)2(
4、H3C)2NN(CH3)257邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 NNCH3CH3肟类：丁二肟肟类：丁二肟 CCCH3NNOHHOCH3584 多元配合物多元配合物 多元配合物是由三种或三种以上的组分所形成多元配合物是由三种或三种以上的组分所形成的配合物。的配合物。 应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元配合物。三元配合物在吸光光度分析组成的三元配合物。三元配合物在吸光光度分析中应用较普遍。重要的三元配合物类型中应用较普遍。重要的三元配合物类型。 59 三元混配配合物三元混配配合物 金属离子与一种配合剂形成未饱和配合物，然金属离子与一种
5、配合剂形成未饱和配合物，然后与另一种配合剂结合，形成三元混合配位配合后与另一种配合剂结合，形成三元混合配位配合物，简称三元混配配合物。物，简称三元混配配合物。 例如，例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形形成成1:1:1的有色配合物，可用于钒的测定，其灵敏的有色配合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。度高，选择性好。60* 离子缔合物离子缔合物 金属离子先与配位剂生成配阴离金属离子先与配位剂生成配阴离子或配阳离子，再与带反电荷的离子生成离子子或配阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。缔合物。主要用于萃取光度法。 如，如，Ag+与与
6、1，10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量作掩蔽剂，可测定微量Ag+。 61* 离子缔合物离子缔合物 作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、1，10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷物、氯化四苯砷(或磷、锑或磷、锑)等等; 作为阴离子，有作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂无机杂多酸和某些酸性染料等。多酸和某些酸性染料等。62 * 金属离子金属离
7、子-配位剂配位剂-表面活性剂体系表面活性剂体系 金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动动(红移红移)，而测定的灵敏度显著提高。，而测定的灵敏度显著提高。 63 * 金属离子金属离子-配位剂配位剂-表面活性剂体系表面活性剂体系 常用的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化常用的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵化十六烷基三甲基铵 、溴化羟基十二烷基三甲基、溴
8、化羟基十二烷基三甲基铵、铵、OP乳化剂。乳化剂。 例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元配合物，在啶反应，生成三元配合物，在pH 89时呈蓝紫色，时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定用于痕量稀土元素总量的测定。64 杂多酸杂多酸 溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。杂多酸法需要还原反应的酸度范元素的基础。杂多酸法需要还
9、原反应的酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。围较窄，必须严格控制反应条件。65 杂多酸杂多酸 很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，些有机还原剂， 例：例：1-氨基氨基-2-萘酚萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。磷的测定。 硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。剂。 抗坏血酸也是较好的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。665 、显色条件的选择、显色条件的选择 实验条件包括实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂溶液酸度，显色剂用量，试剂加入
10、顺序，显色时间，显色温度，有机配合物的加入顺序，显色时间，显色温度，有机配合物的稳定性及共存离子的干扰等稳定性及共存离子的干扰等。（1）溶液的酸度）溶液的酸度 M+HR = MR+H+* 影响显色剂的平衡浓度和颜色影响显色剂的平衡浓度和颜色* 影响被测金属离子的存在状态影响被测金属离子的存在状态* 影响配合物的组成影响配合物的组成 * pH与吸光度关系曲线确定与吸光度关系曲线确定pH范围。范围。67（2）显色剂的用量）显色剂的用量 M(被测组分被测组分)+R(显色剂显色剂) = MR(有色配合物有色配合物) 为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。
11、但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。根据实验结果来确定显色剂的用量。68（3）显色反应时间）显色反应时间 有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽有些显色反应虽能迅速完成，但有色配合物的颜色很快开始褪色能迅速完成，但有色配合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后有些显色反应
12、进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。时间曲线确定适宜时间。69（4）显色反应温度）显色反应温度 显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成必需加热至一定温度完成。（5）溶剂）溶剂 有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率，影响有色配合物深。还可能提高显色反应的速率，影响有色配合物的溶解度和组成等。的溶解度和组成
13、等。70（6）干扰及其消除方法）干扰及其消除方法 试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。度。71a. 控制溶液酸度控制溶液酸度b.
14、加入掩蔽剂加入掩蔽剂 选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜色应不干扰待测离子的测定。c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。扰。消除的干扰方法：消除的干扰方法：72e.选择适当的波长选择适当的波长f.当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。过增加显色剂的用量来消除干扰。g.分离分离 以上方法均不奏效时，预先分离的方法。以上方法均不奏效时，预先分离的方法。7
15、3化学法化学法 Co2, Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝蓝)NaFSCNCo2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN测测Co2(含含Fe3+)掩蔽法掩蔽法氧化还原法氧化还原法74测测Co2 (生成配合物性质不同生成配合物性质不同)Co2+, Zn2+,Ni2+, Fe2+ CoR,ZnR NiR,FeRCoR, Zn2+ ,Ni2+ , Fe2+ 钴试剂钴试剂RH+如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。则需采取分离法。测测Fe3(控制控制pH)Fe3+, Cu2+FeSS （紫红）紫红）Cu2+pH
16、 2.5SS磺基水杨酸磺基水杨酸75 为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则最大吸收原则” 。 选用最大吸收波长的光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。 在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应根据入射光波长。1 测量波长和吸光度范围的选择测量波长和吸光度范围的选择 （1）测量波长的选择）测量波长的选择10.5 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制76例例 丁二酮肟光度法测钢中镍丁二酮肟光度法测钢中镍配合物丁二酮肟镍的最大吸收配合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为波长为470 nm，但试样
17、中的铁但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm处也有一定吸收，干扰镍的测处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选定。为避免铁的干扰，可以选择波长择波长 520 nm进行测定，虽然进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。石酸铁不干扰镍的测定。77选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性78（2）吸光度范围的选择）吸光度范围的选择 从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测得到较高的准确度，一般应控制标准溶液
18、和被测试液的吸光度在试液的吸光度在0.20.8范围内。可通过范围内。可通过控制溶液控制溶液的浓度的浓度或或选择不同厚度的吸收池选择不同厚度的吸收池来达到目的。来达到目的。79（3） 参比溶液的选择参比溶液的选择 利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。扣除干扰的影响。80参比溶液选择参比溶液选择：A） 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。B） 显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离显色剂为无色，被测试液中存在其他
19、有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。C） 显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。空白作参比溶液。81D） 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。以消除显色剂和一些共存组分的干扰。E） 改变
20、加入试剂的顺序，使被测组分不发生显改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，以此溶液作为参比溶液消除干扰。色反应，以此溶液作为参比溶液消除干扰。822 标准曲线的制作标准曲线的制作 光吸收定律光吸收定律:吸光度与吸光物质的含量成正比，光吸光度与吸光物质的含量成正比，光度法进行定量的基础，标准曲线制作根据度法进行定量的基础，标准曲线制作根据。 方法方法:在选择的实验条件下分别测量一系列不同含在选择的实验条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，
21、得到一条通过原点的直线，称为过原点的直线，称为标准曲线标准曲线，此时测量待测溶液此时测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上可以查到与之相对应的被的吸光度，在标准曲线上可以查到与之相对应的被测物质的含量。测物质的含量。830123456780.000.050.100.150.200.250.300.35Aconcentration理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标准测定不同浓度标准溶液的吸光度溶液的吸光度AAc 作图作图84* 有时标准曲线不通过原点。有时标准曲线不通过原点。可能是由于参比溶液选择不当，可能是由于参比溶液选择不当，吸收池厚度不等，吸收池
22、位置吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。若有色配合物原因所引起的。若有色配合物的解离度较大，特别是当溶液的解离度较大，特别是当溶液中还有其他配位剂时，使被中还有其他配位剂时，使被测物质在低浓度时显色不完全。测物质在低浓度时显色不完全。找出原因，加以避免。找出原因，加以避免。85依据依据Beer定律，定律，A与与C关系应为经关系应为经过原点的直线过原点的直线cbAe3 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离86 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地
23、看到的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象通过原点向浓度轴弯曲的现象( (吸光度轴弯曲吸光度轴弯曲) )。这种。这种情况称为偏离朗伯情况称为偏离朗伯- -比尔定律。若在曲线弯曲部分进比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。行定量，将会引起较大的误差。 87偏离朗伯比尔定律偏离朗伯比尔定律的原因主要是仪器或溶液的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯的实际条件与朗伯- -比尔定比尔定律所要求的理想条件不一致。律所要求的理想条件不一致。88（1）非单色光引起的偏离）非单色光引起的偏离 * 朗伯朗伯-比尔定律只适用于单色光比尔定律只适用于单色光，但由于
24、单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比尔定律的偏离。89* 克服非单色光引起的偏离的措施克服非单色光引起的偏离的措施 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。，使标准曲线有较宽的线性范围。 入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长
25、的光的坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的值大值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。长处小得多。 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。在标准曲线的线性范围内。90（2 2）介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离 朗伯比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。朗伯比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收
26、外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。91（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，导合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，导致偏离朗伯致偏离朗伯-比尔定律。比尔定律。92A 解离解离 大部分有机酸碱的酸式、碱式对光
27、有不同的吸大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱碱)解离程度不同，解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。生改变。93B 配位配位 显色剂与金属离子生成的是多级配合物，且各显色剂与金属离子生成的是多级配合物，且各级配合物对光的吸收性质不同级配合物对光的吸收性质不同 例如在例如在Fe()与与SCN-的配合物中，的配合物中，Fe(SCN)3颜颜色最深，色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故颜色最浅，故SCN-浓度越大，浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。溶液颜色越深，即吸光
28、度越大。94 c 缔合缔合 例如在酸性条件下，例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。而它们对光的吸收有很大的不同。 在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比尔定律的偏离。对朗伯比尔定律的偏离。Beer定律适用的另一个前提：稀溶液定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使浓度过高会使c与与A关系偏离定律关系偏离定律954 吸光度测量的误差吸光度测量的误差 在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差在吸光光度分析中，仪
29、器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。 这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。变动，读数不准确等。96光度计中光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器尺刻度不均匀。对于同一仪器,读数的波动对透射读数的波动对透射比为一定值比为一定值;而对吸光度读数波动则不再为定值。而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大吸光度越大,读数波动所引起的吸光度误差也越大读数波动所引起的吸光度误差也越大97 光度计的读数误差一般为光
30、度计的读数误差一般为0.22(T),由于由于T与浓度与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的不是线性关系，故不同浓度时的T引引起的误差不同。起的误差不同。100806040200T% c1 c2 c3 T T T-透光率读数误差透光率读数误差 c c1c1 c2c2 c3c398 透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。而不落两端。 待测溶液的透射比待测溶液的透射比T在在15%65%之间，或使之间，或使吸光度吸光度A在在0.20.8之间之间，才能保证测量的相对误，才能
31、保证测量的相对误差较小。差较小。99仪器测量误差仪器测量误差%100ln%100%100ln434. 0lg1lgTTdTAdAcdcETTTbcAre100仪器测量误差仪器测量误差%100lg434. 0%100ln%100%10001. 0TTTTTTAAccETdTr101浓度测量的相对误差与浓度测量的相对误差与T(或或A)的关系的关系1086420204060800.70.40.20.1AT%Err0.434lg(0.01)cTEcTTT(36.8)0.434实际工作中，应控制实际工作中，应控制T在在1565, A在在0.20.8之间之间10210.6 光度分析法的应用和其它吸光光度法
32、光度分析法的应用和其它吸光光度法一、一、 单一组分测定单一组分测定1) 金属离子金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟丁二酮肟, Co-钴试剂钴试剂2) 磷的测定磷的测定: DNA中含中含P9.2%, RNA中含中含P9.5%, 可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄(e e小小)磷钼磷钼(V)蓝蓝(e e大大)Sn2+103二、多组分的测定二、多组分的测定a) 在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分yb) 在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除
33、扣除x吸收吸收,可求可求y104二、多组分的测定二、多组分的测定 e ex 1, e ey 1, e ex 2, e ey 2由由x,y标液在标液在 1, 2处分别测得处分别测得c) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1=e ex 1bcx+ e ey 1bcy (在 1处测得处测得A1) A2 =e ex 2bcx+ e ey 2bcy (在 2处测得处测得A2)105三、三、 示差吸光光度法示差吸光光度法普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即
34、提高入射光强度，并法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液液浓度的标准溶液作参比溶液A=Ax -As =b(cx - cs ）=bc106三、三、 示差吸光光度法示差吸光光度法设：待测溶液浓度为设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为标准溶液浓度为cs(cs cx)Ax= b cx， As = b cs=x -s =b(cx - cs ）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差溶液的吸光度之差。由标准曲线上查得相应的。由标准曲线上查得相应的c值，则待测溶液浓度值，则待测溶液浓度cx
35、： cx = cs + c 107示差法标尺扩展原理：示差法标尺扩展原理： 普通法：普通法： cs的的T=10%；cx的的T=5% 示差法：示差法： cs 做参比，做参比， 调调T=100% 则：则： cx的的T=50% ；标尺扩展标尺扩展10倍倍108四、四、 双波长分光光度法双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；两个单色器获得两不需空白溶液作参比；两个单色器获得两束单色光束单色光( (1 1和和2 2) )；以参比波长以参比波长1 1处的吸光处的吸光度度A A11作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越背景吸收较大的复杂试
36、样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。单波长法有所提高。 109双波长分光光度法双波长分光光度法A A2 A1 (2 1)b c 两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓与待测组分浓度度c成正比。成正比。1和和2分别表示待测组分在分别表示待测组分在1和和2处的摩尔吸光系数。处的摩尔吸光系数。测量波长测量波长2和参比波长和参比波长1的选择与组合的选择与组合110基本要求：基本要求：在选定的两个波长在选定的两个波长1和和2处待测组分的吸光度应处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。具有足够大的差值。
37、选定的波长选定的波长1和和2处干扰组分应具有相同吸光度，处干扰组分应具有相同吸光度，即：即： Ay = A y2 A y1 = 0故：故：Ax+y = A x=(x2x1)bcx此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差A只与待测组分只与待测组分x的浓度呈线的浓度呈线性关系，而与干扰组分性关系，而与干扰组分y无关。若无关。若x为干扰组分，则也为干扰组分，则也可用同样的方法测定可用同样的方法测定y组分。组分。111双波长分光光度法消除干扰双波长分光光度法消除干扰在 2， A 2 = Ax2+Ay2在在 1， A 1= Ax1+Ay1 A= A 2 - A 1 = Ax2+Ay2 (Ax1+Ay1)
38、 = Ax2 Ax1 = AxAy2 Ay1 Ax =(e ex2 e ex1)bcx消除了消除了y的干扰的干扰X被测被测Y干扰干扰211Ay1AX1Ay2AX2A/nm112双波长分光光度法消除浑浊背景干扰双波长分光光度法消除浑浊背景干扰 1 2AA 1 -A 2 = A Ac例例 牛奶中微牛奶中微量量Fe的测定的测定113五五 一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HLHLHLL=HL+LKccAKKe ee eeeee +L+aaa(HL)H (HL)=+H +H KaH+L/HL配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A(设设b=1cm).114五五
39、一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HLKaH+L/HL高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得 AL Lc(HL).代入整理：代入整理：115AAKAA +HLaL-=H -HLLL HLAAKAAa-p= pH+lg-或116MO吸收曲线吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600 /nmA曲线曲线pHpH1 11.10, 1.381.10, 1.382 22.652.653 33.063.064 43.48
40、3.485 53.983.986 65.53,6.805.53,6.80由每份溶液的由每份溶液的一对一对pH、A，可求得一个可求得一个Ka, 取平均值即可取平均值即可.117MO离解常数的测定离解常数的测定作图法作图法LHLappHlgAAKAA HLL2AAA AHL3.32(pKa)123456ApH=pKapHpHA 曲线曲线ALLHLlgpHAAAA 曲线曲线0.60.40.20-0.2-0.4-0.63.04.0pHHLLHLlggLlAAAA 3.34118六六 配合物组成的测定配合物组成的测定(1)饱和法饱和法(摩尔比法摩尔比法): 固定固定cM ,改变改变cR 固定一种组分固定
41、一种组分(通常是金属离子通常是金属离子M)的浓度，改的浓度，改变配位剂变配位剂(R)的浓度，得到一系列的浓度，得到一系列R/M比值比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，为纵坐标，R/M为横坐标作图。为横坐标作图。1191:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 120（2）连续变化法）连续变化法(又称等摩尔系列法又称等摩尔系列法) cM+cR=c，改变改变cM和和cR的相对量，配制一系列溶的相对量，配制一系列溶液，在有色配合物的最大吸收波长处测量这一液，在有色配合物的最
42、大吸收波长处测量这一系列溶液的吸光度。当溶液中配合物系列溶液的吸光度。当溶液中配合物MRn浓度浓度最大时，最大时，cR/cM比值为比值为n 当当cM/c为为0.5时，配位比为时，配位比为1:1 当当cM/c为为0.33，配位比为，配位比为1:2 当当cM/c=0.25时，配位比为时，配位比为1:3121等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法: :M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2MR=MRnn MR(ccc）常数常数122例：例： 精密称取精密称取B12样品样品25.0mg，用水溶液配成用水溶液配成100ml。精密吸取精密吸取10.00ml，又置又置100ml容量瓶中，加水至
43、刻度。取此溶液容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在在1cm的吸收池中，于的吸收池中，于361nm处测定吸光度为处测定吸光度为0.507，求，求B12的百分含量？（百分吸光系数为的百分含量？（百分吸光系数为207） 解：解：mLgmLgCi/1045. 2100/1045. 21207507. 053mLgC/1050. 2100101001050. 252样%0 .98%1001050. 21045. 2%100%5512样CCBi123 分析应用分析应用 痕量金属分析痕量金属分析临床分析临床分析食品分析食品分析124邻二氮菲分光光度法测定铁邻二氮菲分光光度法测定铁 根据朗伯根据朗伯-比耳定律：比
44、耳定律：A=bc当入射光波长当入射光波长及光程及光程b一定时，在一定浓一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的与该物质的浓度浓度c成正比。成正比。只要绘出以吸光度只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度为纵坐标，浓度c为横为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。知样的含量。 125在在pH=29的溶液中，的溶液中，Fe2+与邻二氮菲与邻二氮菲(phen)生成稳定生成稳定的桔红色配合物的桔红色配合物Fe(phen)32+此配合物的此配合物的lgK
45、稳稳=21.3，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数510 = 1.1104 Lmol-1cm-1，而，而Fe3+能与邻二氮菲生成能与邻二氮菲生成3 1配合物，配合物，呈淡蓝色，呈淡蓝色，lgK稳稳=14.1。所以在加入显色剂之前，应。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺用盐酸羟胺(NH2OHHCl)将将Fe3+还原为还原为Fe2+，其反应，其反应式：式：2Fe3+ + 2NH2OHHCl 2Fe2+ + N2 + H2O + 4H+ + 2Cl-测定时控制溶液的酸度为测定时控制溶液的酸度为pH5较为适宜。较为适宜。 2+NN3Fe2+NNNNNNFe1261.标准溶液配制标准溶液配制10gmL-1铁标准
46、溶液配制铁标准溶液配制 系列标准溶液配制系列标准溶液配制: 取取6个个50mL容量瓶，分别加容量瓶，分别加入铁标准溶液入铁标准溶液0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL，然后加入，然后加入1mL盐酸羟胺，盐酸羟胺，2.00mL邻二邻二氮菲，氮菲，5mLNaAc溶液，每加入一种试剂都应初溶液，每加入一种试剂都应初步混匀。用去离子水定容至刻度，充分摇匀，放步混匀。用去离子水定容至刻度，充分摇匀，放置置10min。1272.吸收曲线的绘制吸收曲线的绘制用用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液，选定浓度比色皿，以试剂空白为参比溶液，选定浓度下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以波长为下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以波长为横坐标，吸光度横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。510nm1283. 标准曲线标准曲线(工作曲线工作曲线)的绘制的绘制用用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液，在选定波比色皿，以试剂空白为参比溶液，在选定波长下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁含长下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁含量为横坐标，吸光度量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。
