1、第一节第一节 生物药物制造的生物化学基础生物药物制造的生物化学基础第二节第二节 药物质量控制的生物化学基础药物质量控制的生物化学基础第三节第三节 药理学研究的生物化学基础药理学研究的生物化学基础第四节第四节 与药物设计有关的生物化学原理与药物设计有关的生物化学原理第一节第一节生物药物制造的生物化学基础生物药物制造的生物化学基础一一生物药物制备方法的特点生物药物制备方法的特点二二生物药物分离制备方法的主要原理生物药物分离制备方法的主要原理三三生物合成技术原理生物合成技术原理四四生物技术原理生物技术原理一、生物药物制备方法的特点一、生物药物制备方法的特点n生物药物生物药物主要包括生化药物、微生物药
2、物、主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物和生物制品，这些药物是以生物技术药物和生物制品，这些药物是以生物学和化学相结合的手段，以生物材料生物学和化学相结合的手段，以生物材料为原料制取的。为原料制取的。n制造技术具有如下特点：制造技术具有如下特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中目的物存在于组成非常复杂的生物材料中一种生物材料含有成千上万种成分，各种化一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性质各合物的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无质在制
3、备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。固定工艺可循。2.有些目的物在生物材料中含量极微有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏生物活性成分易变性、破坏生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。生物活性。4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影生物药物制造受理化因素和生物学因素影响响制造工艺几乎都在
4、溶液中进行制造工艺几乎都在溶液中进行温度、温度、pH、离子强度、离子强度对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定 以致许多工艺设计理论性不强以致许多工艺设计理论性不强5.生物药物常采用生物药物常采用“多阶式多阶式”法法即即“逐级分离逐级分离”法。法。纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。行才能达到目的。为了保护目的物的活性及结构完整为了保护目的物的活性及结构完整6.生物药物的均一性检测与化学上的纯度概生物药物的均一性检测与化学上的
5、纯度概念不完全相同念不完全相同由于生物药品对环境变化十分敏感，结构与由于生物药品对环境变化十分敏感，结构与功能关系多变复杂，因此对其均一性的评估功能关系多变复杂，因此对其均一性的评估常常是有条件的，或者只能通过不同角度测常常是有条件的，或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对定，最后才能给出相对“均一性均一性”结论。只结论。只凭一种方法得到的纯度结论往往是片面的，凭一种方法得到的纯度结论往往是片面的，甚至是错误的。甚至是错误的。二、生物药物分离制备方法的二、生物药物分离制备方法的主要原理主要原理（一）（一） 小分子生物药物的制备方法小分子生物药物的制备方法根据不同组分分配率的差别进行分离如：
6、溶根据不同组分分配率的差别进行分离如：溶剂萃取，分配层析，吸附层析，盐析，结晶剂萃取，分配层析，吸附层析，盐析，结晶等等（二）（二）生物大分子药物的制备方法生物大分子药物的制备方法根据生物大分子的特性采用多种分离手段交根据生物大分子的特性采用多种分离手段交互进行互进行n生物大分子类药物分离纯化的主要原理生物大分子类药物分离纯化的主要原理1.根据根据分子形状和大小分子形状和大小不同的分离方法不同的分离方法差速离心、透析、超滤和凝胶过滤等差速离心、透析、超滤和凝胶过滤等2.根据分子根据分子电离性质（带电性）电离性质（带电性）不同的分离不同的分离方法方法离子交换法、电泳法和等电聚焦法离子交换法、电泳
7、法和等电聚焦法3.根据分子根据分子极性大小极性大小与与溶解度溶解度不同的分离方不同的分离方法法溶剂提取法、分配层析法、盐析法、等电点溶剂提取法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法沉淀法和有机溶剂分级沉淀法4.根据根据配基特异性配基特异性不同的分离方法不同的分离方法亲和层析法亲和层析法n精制一个具体药物，常需要根据它的多种精制一个具体药物，常需要根据它的多种理化性质和生物学特性，采用多种分离方理化性质和生物学特性，采用多种分离方法进行有机结合，方能达到预期目的。法进行有机结合，方能达到预期目的。分离纯化生物大分子的原理分离纯化生物大分子的原理1.根据分子形状和大小不同的分离方法
8、根据分子形状和大小不同的分离方法透析透析超滤超滤凝胶过滤凝胶过滤密度梯度离心密度梯度离心1.透析透析原理：利用生物大分子不能通过半透膜原理：利用生物大分子不能通过半透膜的性质，将其与小分子物质分开。的性质，将其与小分子物质分开。常用的半透膜：常用的半透膜：玻璃纸、火棉玻璃纸、火棉纸或其他改型的纤纸或其他改型的纤维素材料维素材料2.超滤超滤原理：利用压力或离心力，强行使水和其他原理：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而大分子物质被截小分子溶质通过半透膜，而大分子物质被截留在膜上留在膜上3.凝胶过滤凝胶过滤介质：凝胶颗粒（内部是多孔的网状结构）介质：凝胶颗粒（内部是多孔的网状结
9、构）原理：不同大小的分子所经的路径不同原理：不同大小的分子所经的路径不同4.密度梯度离心密度梯度离心原理：颗粒的沉降取决于它的大小和密度，原理：颗粒的沉降取决于它的大小和密度，在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，且沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前。即停止不前。常用的密度梯度：常用的密度梯度：蔗糖梯度蔗糖梯度CsCl梯度梯度蔗糖梯度离心蔗糖梯度离心CsCl梯度离心梯度离心2.根据分子电离性质不同的分离方法根据分子电离性质不
10、同的分离方法离子交换层析法离子交换层析法电泳电泳等电等电聚焦聚焦1.离子交换层析法（离子交换层析法（Ion exchange chromatography)原理原理：利用离子交换剂上的可解离基团（活：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离技术。离目的的一种层析分离技术。介质介质：离子交换树脂：离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换阴离子交换阳离子交换阳离子交换n离子交换介质简介：离子交换介质简介：1.普通的离子交换树脂：普通的离子交换树脂： 适用于小分子离子化合物的
11、分离适用于小分子离子化合物的分离2.大孔型离子交换树脂：大孔型离子交换树脂： 适用于较大分子物质的分离、精制适用于较大分子物质的分离、精制3.离子交换纤维素：离子交换纤维素： 适用于大分子物质的分离适用于大分子物质的分离 DEAE-C 二乙氨基乙基纤维素二乙氨基乙基纤维素 CM-C 羧甲基纤维素羧甲基纤维素4.离子交换凝胶：离子交换凝胶： 适用于大分子物质的分离，适用于大分子物质的分离， 离子交换与分子筛作用结合起来离子交换与分子筛作用结合起来 DEAE-SephadexCM-Sephadex2.电泳电泳电泳原理：在外电场的作用下，带电颗电泳原理：在外电场的作用下，带电颗粒向着与其所带电荷相反
12、的电极方向移粒向着与其所带电荷相反的电极方向移动的现象。动的现象。常用电泳方法：常用电泳方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳槽电泳槽电泳仪电泳仪3.等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IEF, Isoelectric focusing electrophoresis)原理：在外电场作用下，带电颗粒在具原理：在外电场作用下，带电颗粒在具有有pH梯度的介质中泳动，并停留于等梯度的介质中泳动，并停留于等于其等电点的于其等电点的pH梯度处，形成一个很梯度处，形成一个
13、很窄的区带。窄的区带。分辨率：分辨率：0.02的的pI差异即可分开。差异即可分开。pH梯度的形成：梯度的形成：两性电解质两性电解质2D Electrophoresis 3.根据分子极性大小与溶解度不同的分离方根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法法等电点沉淀等电点沉淀使蛋白质所带正负电荷相等，静电荷为零使蛋白质所带正负电荷相等，静电荷为零时的溶液的时的溶液的pH值，称为蛋白质的等电点。值，称为蛋白质的等电点。等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低盐析盐析高盐浓度时，破坏蛋白质水化层并且中和高盐浓度时，破坏蛋白质水化层并且中和电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀。电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀。
14、分配层析分配层析混合物的各组分在固定相和流动相中的分配混合物的各组分在固定相和流动相中的分配情况不同，具有不同分配系数的各种成分以情况不同，具有不同分配系数的各种成分以不同的速度移动而得以分离。不同的速度移动而得以分离。有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离4.根据配基特异性不同的分离方法根据配基特异性不同的分离方法亲和层析法亲和层析法(afinity chromatography )：生物：生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合，高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合，配基通过共价键牢固地配基通过共价键牢固地结合结合于固相载体上制于固相载体上制得亲和吸附系统。样品中的目的物在一定条得亲和吸附系
15、统。样品中的目的物在一定条件下，能以次级键与已固定化的配基结合，件下，能以次级键与已固定化的配基结合，而杂质则不被吸附，分去杂质后，更换条件，而杂质则不被吸附，分去杂质后，更换条件，使高分子物质使高分子物质重新解离重新解离而被纯化。而被纯化。GST 纯化系统纯化系统GST-Tag三、生物合成技术原理三、生物合成技术原理n生物合成生物合成：是利用生物细胞的代谢反应是利用生物细胞的代谢反应(更多的是利用微生更多的是利用微生物转化反应物转化反应)来合成化学方法难于合成的药物或来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。药物中间体。n微生物转化反应微生物转化反应：是利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应
16、，是利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。n半合成药物半合成药物：是指一个药物其部分结构由天然资源得到，然是指一个药物其部分结构由天然资源得到，然后用化学合成法制得最终产品，或应用微生物后用化学合成法制得最终产品，或应用微生物转化法将化学合成的中间产物，通过某些生物转化法将化学合成的中间产物，通过某些生物合成步骤来解决药物合成中难于进行的化学反合成步骤来解决药物合成中难于进行的化学反应，从而获得最终有效化合物。应，从而获得最终有效
17、化合物。半合成技术：半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品化学合成法制得最终产品2）化学合成的中间产物）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物微生物转化法获得最终有效化合物四、生物技术原理四、生物技术原理n生物技术生物技术（biotechnology）：）：又称生物工程（又称生物工程（bioengineering），是利用生物），是利用生物有机体有机体(动物、植物和微生物动物、植物和微生物)或其组成部分或其组成部分(包包括器官、组织、细胞或细胞器等括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或发展新产品或新工艺的一种技术体系。新工
18、艺的一种技术体系。n生物技术的内容：生物技术的内容：基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程基因工程基因工程n用人工方法，提取或制备某种细胞的某种用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。产生人们所需的产物的工程技术。细胞工程的定义细胞工程的定义n应用细胞生物学和分子生物学的方法应用细胞生物学和分子生物学的方法, ,通过类似于通过类似于工程
19、学的步骤工程学的步骤, ,在细胞整体水平或细胞器水平上按在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。包括一切生物类型的基本单位一细胞（有时也包括器包括一切生物类型的基本单位一细胞（有时也包括器官或组织）的离体培养、融合以及细胞核、细胞质乃官或组织）的离体培养、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器（如线粒体等）的移植与改建等操至染色体与细胞器（如线粒体等）的移植与改建等操作技术。作技术。酶工程的定义酶工程的定义n指酶的工业化生产及其固定化技
20、术以及由指酶的工业化生产及其固定化技术以及由酶制剂构成的生物反应器和生物传感器等酶制剂构成的生物反应器和生物传感器等新技术、新装置的研究应用。新技术、新装置的研究应用。发酵工程发酵工程n发酵工程也称为微生物工程，是在最适合发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺。定产品的一种生物工艺。生物工程（技术）药物生物工程（技术）药物n指运用重组指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白、激素和酶类药物以及疫产的多肽、蛋白、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物等。苗、单抗和
21、细胞生长因子类药物等。n现代生物技术的核心内容：现代生物技术的核心内容：重组重组DNA技术技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术重组重组DNA技术（基因工程）技术（基因工程）目的基因的获取目的基因的获取基因载体的选择与构建基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接（重组体的构建）目的基因与载体的拼接（重组体的构建）重组重组DNA导入受体细胞（重组体的转化）导入受体细胞（重组体的转化）筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞(重组体重组体的筛选与鉴定的筛选与鉴定)工程菌（或细胞）大量培养与目的蛋白的生产工程菌（或细胞）大量培养与目的蛋白的生产单克隆抗体技术单克隆抗体技术n基本
22、概念：基本概念：抗体主要由抗体主要由B淋巴细胞合成。每个淋巴细胞合成。每个B淋巴细淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同淋巴细胞合成不同的抗体。的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的细胞。被激活的B细胞分细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞细胞的分裂增殖形成多克隆，
23、并合成多种抗体的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体单克隆抗体。n单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody）由由一种抗原决定簇刺激机体，由一个一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴淋巴细胞细胞 接受该抗原所产生的抗体。接受该抗原所产生的抗体。 n基本原理基本原理：B淋巴细胞能够产生抗体，淋巴细胞能
24、够产生抗体， 但在体外不能进行但在体外不能进行无限分裂无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。n基本步骤（不包括抗原的准备及免疫小鼠）基本步骤（不包括抗原的准备及免疫小鼠）1.将抗原注射小鼠体内进行免疫，取出受免脾将抗原注射小鼠体内进行免疫，取出受免脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。2.应用选择性培养基培养，筛选杂交瘤细胞，应用选择性培养基培养，筛选杂交瘤细胞，逐一克隆扩增，从中挑出
25、能产生单抗的杂交逐一克隆扩增，从中挑出能产生单抗的杂交瘤细胞株。瘤细胞株。3.将杂交瘤细胞进行扩大培养或注射到动物体将杂交瘤细胞进行扩大培养或注射到动物体内，然后从培养液或动物腹水中提取单克隆内，然后从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体。抗体。4.单克隆抗体的提纯单克隆抗体的提纯n应用应用检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂 ：病原微生物抗原、抗体的：病原微生物抗原、抗体的检测；检测； 肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；激素测定；细胞因子的测定。的检测；激素测定；细胞因子的测定。蛋白质的提纯蛋白质的提纯治疗（肿瘤！）治疗（肿瘤！）n1989年，年，FDA批准
26、第一个鼠源单克隆抗体批准第一个鼠源单克隆抗体OKT3上市。上市。目前，目前，FDA一共批准了一共批准了28个个n1997年第一个人源单克隆抗体（年第一个人源单克隆抗体（Zenapax）n1999年中国批准第一个单抗药物年中国批准第一个单抗药物目前，中国拿到批文的单抗产品目前，中国拿到批文的单抗产品9个个n2002年第一个全人源化单抗上市（年第一个全人源化单抗上市（Humira）n2011年单抗药物销售年单抗药物销售480亿美元，领跑！亿美元，领跑！第二节第二节药物质量控制的生物化学基础药物质量控制的生物化学基础n药物质量控制的内容药物质量控制的内容药物的鉴别药物的鉴别药物的杂质检查药物的杂质检
27、查药物的含药物的含量测定量测定一、药物质量控制的常用一、药物质量控制的常用生化分析法生化分析法（一）免疫分析法（一）免疫分析法（二）电泳分析法（二）电泳分析法（三）酶法分析（三）酶法分析（一）、免疫分析法（一）、免疫分析法n免疫扩散法（免疫扩散法（Immunodiffusion ）n免疫电泳法（免疫电泳法（immunoelectrophoresis ）n放射免疫法（放射免疫法（RIA）n酶联免疫测定法（酶联免疫测定法（ELISA）n利用一块琼脂凝胶平板，在其上面打几个大小合利用一块琼脂凝胶平板，在其上面打几个大小合适的小孔，分别加入抗原和抗体，两个反应物分适的小孔，分别加入抗原和抗体，两个反应
28、物分别向凝胶孔的四方放散，成对的抗原和抗体在最别向凝胶孔的四方放散，成对的抗原和抗体在最适的平衡点上形成免疫沉淀弧。适的平衡点上形成免疫沉淀弧。n可用于未知样品的抗原组成及不同样品的抗原特可用于未知样品的抗原组成及不同样品的抗原特性比较鉴定性比较鉴定免疫扩散法免疫扩散法n利用带电蛋白质在电场作用下具有不同的利用带电蛋白质在电场作用下具有不同的迁移率，将抗原分开，再与抗体进行免疫迁移率，将抗原分开，再与抗体进行免疫扩散反应，借助沉淀弧来观察抗原抗体复扩散反应，借助沉淀弧来观察抗原抗体复合物。合物。n常用的方法常用的方法:对流免疫电泳对流免疫电泳简单免疫电泳简单免疫电泳n对流免疫电泳对流免疫电泳(
29、counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。在术。在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 (电渗是电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负
30、电荷，琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗动，产生电渗) 在抗原抗体相遇的最适比例处形在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。试验的灵敏度，并缩短反应时间。n放射免疫测定法放射免疫测定法利用抗原和抗体相互利用抗原和抗体相互反应的高度特异性，与放射性核素测量技反应的高度特异性，与放射性核素测量技术的高度灵敏性
31、相结合而形成的超微量分术的高度灵敏性相结合而形成的超微量分析方法。不仅普遍用于具有抗原性的生物析方法。不仅普遍用于具有抗原性的生物大分子的分析，而且也广泛用于低分子量大分子的分析，而且也广泛用于低分子量具有半抗原性质的药物和甾体激素类物质具有半抗原性质的药物和甾体激素类物质的分析的分析n酶联免疫测定法（酶联免疫测定法（ELISA）以酶代替放射性核素对抗原或抗体进行标记，以酶代替放射性核素对抗原或抗体进行标记，使酶与抗原或抗体共价连接，故称为酶联免疫使酶与抗原或抗体共价连接，故称为酶联免疫吸附测定（吸附测定（ELISA）。）。ELISA技术是把抗原技术是把抗原-抗体特异性反应和酶的高抗体特异性反
32、应和酶的高效催化作用相结合而建立的一种免疫标记技术。效催化作用相结合而建立的一种免疫标记技术。（二）、电泳分析法（二）、电泳分析法n电泳是带点颗粒在电场作用下，向着与其电泳是带点颗粒在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极方向移动。所带电荷相反的电极方向移动。n各种物质由于所带净电荷的种类和数量不各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。和鉴定。n影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：缓冲液的种类和性质缓冲液的种类和性质
33、 离子强度（离子强度（0.050.10mol/L）电场电场 常压电泳常压电泳 高压电泳（高压电泳（500V以上）以上）支持介质支持介质 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、醋酸纤维素膜、滤纸聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、醋酸纤维素膜、滤纸（三）、酶法分析（三）、酶法分析n酶法分析的原理是借助酶促反应（包括单酶法分析的原理是借助酶促反应（包括单酶或多酶耦联反应）对酶或酶所作用的底酶或多酶耦联反应）对酶或酶所作用的底物或参与酶促反应的辅酶、激动剂和抑制物或参与酶促反应的辅酶、激动剂和抑制剂等进行定性、定量分析。剂等进行定性、定量分析。n酶法分析主要有三类测定法：酶法分析主要有三类测定法：终止反应法终止反应法连续测定
34、法连续测定法循环放大法循环放大法二、生物药物质量控制的生化分析方法二、生物药物质量控制的生化分析方法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.蛋白质药物的纯度分析：蛋白质药物的纯度分析：蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，而不包括盐类、缓冲液离子、而不包括盐类、缓冲液离子、SDS等小分子等小分子在内。在内。纯度检定方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检定方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、毛细管电泳、毛细管电泳（CE）、等点聚焦（）、等点聚焦（IEF）、）、HPLC（包括（包括凝胶排阻层析，各种反
35、相凝胶排阻层析，各种反相HPLC，离子交换，离子交换色谱，疏水色谱等）、化学法色谱，疏水色谱等）、化学法2.多肽与蛋白质的分子量的测定多肽与蛋白质的分子量的测定（1）凝胶层析法（）凝胶层析法（Gel chromatography ）（2）SDS-PAGE（3）质谱法）质谱法n质谱法质谱法(Mass Spectrometry, MS)即用电场和即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子分子相互作用
36、产生离子、负离子和离子分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。的方法。3.蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定物理性质：紫外分光光度法、折射率法、比物理性质：紫外分光光度法、折射率法、比浊法浊法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲比色法、化学性质：凯氏定氮法、双缩脲比色法、BCA法法染色性质：考马斯亮蓝、银染、金染染色性质：考马斯亮蓝、银染、金染其他：荧光激发其他：荧光激发BCA法法4.胶体金比色法胶体金比色法胶体金是一种带负电荷胶体金是一种带负电荷的疏水性胶体，加入蛋白质后，红色的胶的疏水性胶体，加入蛋白质后，红色的胶体金溶液转变为蓝色，颜色的改变
37、与加入体金溶液转变为蓝色，颜色的改变与加入的蛋白质量有定量关系，在的蛋白质量有定量关系，在595nm处测定处测定药品吸光度质，计算含量。药品吸光度质，计算含量。5.生物质谱法生物质谱法多肽和蛋白质的分子量可用多肽和蛋白质的分子量可用MALDI/MS（基质辅助激光解吸离子化质（基质辅助激光解吸离子化质谱法）或谱法）或ESI/MS（电喷雾离子化质谱法）（电喷雾离子化质谱法）直接测定。直接测定。n简便、快速、灵敏、准确简便、快速、灵敏、准确（二）核酸类药物的主要分析方法（二）核酸类药物的主要分析方法n核酸的组成：磷酸、戊糖、碱基核酸的组成：磷酸、戊糖、碱基n针对三个组分测定其中一种针对三个组分测定其
38、中一种1.紫外分光光度法紫外分光光度法（DNA/RNA）原理：核酸分子中的碱基含有共轭双键，对原理：核酸分子中的碱基含有共轭双键，对紫外光有特征吸收。紫外光有特征吸收。260nmRNA:每每1ml含含1m mg RNA溶液的光吸收值为溶液的光吸收值为0.022DNA:每每1ml含含1m mg RNA溶液的光吸收值为溶液的光吸收值为0.020280nm2.地衣酚显色法测定地衣酚显色法测定RNA含量含量当当RNA与浓盐酸在与浓盐酸在100下煮沸后，即发生降下煮沸后，即发生降解产生核糖，并进而转变为糠醛，在解产生核糖，并进而转变为糠醛，在FeCl3或或CuCl2催化下，糠醛与催化下，糠醛与3，5-二
39、羟基甲苯（地二羟基甲苯（地衣酚衣酚 ）反应生成绿色复合物，在）反应生成绿色复合物，在670nm处有处有最大吸收。最大吸收。3.二苯胺法测定二苯胺法测定DNA含量含量DNA分子中分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，可与二苯胺反应生成蓝色化合物，在解，可与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595 nm处具有最大吸收。处具有最大吸收。（三）酶类药物分析（三）酶类药物分析n质量指标：酶类药物的催化活力质量指标：酶类药物的催化活力n酶的比活力：酶浓度和纯度的衡量标准酶的比活力：酶浓度和纯度的衡量标准n测活方法应满足的条件：测活方法应满足的条件：1.有可被检测且能反映酶反应
40、进行程度的信号有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物物2.底物对酶远远过量底物对酶远远过量3.适宜的反应温度适宜的反应温度4.最适最适pH反应体系反应体系5.在酶促反应初速度范围内在酶促反应初速度范围内（四）重组（四）重组DNA药物中的可能杂质检查药物中的可能杂质检查n重组重组DNA药物的可能杂质：药物的可能杂质：残留外源性残留外源性DNA宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质类毒素类毒素蛋白质突变体蛋白质突变体蛋白质裂解物蛋白质裂解物n外源性外源性DNA：世界卫生组织世界卫生组织(WHO)规定每一剂量药物中残留规定每一剂量药物中残留DNA含量不得超过含量不得超过100pg测定方法：测定方法：DNA分
41、子杂交分子杂交n宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质：是指生产过程中来自宿主或培养基中的残留蛋是指生产过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或多肽等杂质。白或多肽等杂质。n内毒素内毒素：细菌细胞壁的结构物质，如脂多糖中的类脂细菌细胞壁的结构物质，如脂多糖中的类脂A，不能向胞外分泌，只有在细菌死亡或崩解后才不能向胞外分泌，只有在细菌死亡或崩解后才能释放出来，称为内毒素。能释放出来，称为内毒素。n二聚体或多聚体的测定二聚体或多聚体的测定一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或多聚体一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或多聚体的含量限度。的含量限度。n降解产物的测定降解产物的测定鉴于降解产物的基本结构通常与未降解的重组鉴
42、于降解产物的基本结构通常与未降解的重组药物相似，因此，对降解产物的测定多采用离药物相似，因此，对降解产物的测定多采用离子对反相色谱。子对反相色谱。第三节第三节 药理学研究的药理学研究的生物化学基础生物化学基础n现代药理学研究已从整体、系统、器官、现代药理学研究已从整体、系统、器官、组织、细胞进入到亚细胞、分子甚至量子组织、细胞进入到亚细胞、分子甚至量子水平，因此生物化学和分子生物学已成为水平，因此生物化学和分子生物学已成为现代药理学的重要理论基础。现代药理学的重要理论基础。一一药物作用的生物化学基础药物作用的生物化学基础（一）神经传导与神经递质（一）神经传导与神经递质当两个神经元的突触当两个神
43、经元的突触20nm时，动作电位时，动作电位仍可使突触后膜去极化，神经冲动继续向下仍可使突触后膜去极化，神经冲动继续向下传递。传递。如裂隙如裂隙 20nm时，就必须由时，就必须由神经递质神经递质来传来传递信息。递信息。神经递质神经递质(突触分泌信号突触分泌信号)：神经元突触前膜：神经元突触前膜释放起着信息传递作用的物质称为神经递质。释放起着信息传递作用的物质称为神经递质。（二）受体的结构与功能（二）受体的结构与功能受体（受体（receptor）细细胞中能识别配体并与其特胞中能识别配体并与其特异性结合，引起各种生物异性结合，引起各种生物效应的分子称为受体。效应的分子称为受体。配体（配体（ligan
44、d）信息信息分子（神经递质、激素、分子（神经递质、激素、生长因子、化学药物）生长因子、化学药物）受体的化学本质：为蛋白质，部分为糖受体的化学本质：为蛋白质，部分为糖蛋白或脂蛋白。蛋白或脂蛋白。受体分类受体分类：（膜表面受体、胞内受体）：（膜表面受体、胞内受体）1. 离子通道型离子通道型2. G蛋白蛋白-效应蛋白型效应蛋白型3. 酪氨酸蛋白激酶型酪氨酸蛋白激酶型4. 转录因子型转录因子型 1. 受体受体 离子通道型离子通道型受体本身构成离子通道。受体本身构成离子通道。当受体的调节部位与配当受体的调节部位与配体结合后，受体变构，体结合后，受体变构，使通道开放或关闭、引使通道开放或关闭、引起或切断阳
45、离子、阴离起或切断阳离子、阴离子的流动，从而传递信子的流动，从而传递信息。息。 2. 受体受体 G蛋白蛋白-效应蛋白型效应蛋白型在真核细胞，鸟苷三在真核细胞，鸟苷三磷酸磷酸-结合蛋白（结合蛋白（G蛋蛋白）在联系细胞膜受白）在联系细胞膜受体与效应蛋白质中起体与效应蛋白质中起着重要的介导作用。着重要的介导作用。3. 受体受体 酪氨酸蛋酪氨酸蛋白激酶型白激酶型这类受体本身是一种这类受体本身是一种跨膜蛋白，自身具有跨膜蛋白，自身具有酶活性，或与酶结合酶活性，或与酶结合在一起，其胞外结构在一起，其胞外结构域与配体结合而被激域与配体结合而被激活，通过内侧激酶反活，通过内侧激酶反应将细胞外信号传递应将细胞外
46、信号传递至细胞内。至细胞内。4.受体受体 转录因子转录因子型型位于细胞内的受体多为转录因子，与相应配体结合后，位于细胞内的受体多为转录因子，与相应配体结合后，能与能与DNA的顺式作用元件结合，在转录水平调节基的顺式作用元件结合，在转录水平调节基因表达。因表达。 该型受体结合的信息物质有该型受体结合的信息物质有类固醇激素类固醇激素、甲状腺素甲状腺素、维甲酸维甲酸、维生素维生素D等，它们进入细胞后，有些可与其等，它们进入细胞后，有些可与其位于位于细胞核内细胞核内的受体相结合形成激素的受体相结合形成激素-受体复合物，受体复合物，有些则先与其在有些则先与其在细胞质内细胞质内的受体相结合，然后以激素的受
47、体相结合，然后以激素-受体复合物的形式穿过核孔进入核内。受体复合物的形式穿过核孔进入核内。 （三）跨膜信号转导与细胞内信号转导（三）跨膜信号转导与细胞内信号转导n细胞针对外源信息所发生的细胞内生细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程称为信号物化学变化及效应的全过程称为信号转导（转导（signal transduction）。）。 细胞应答反应细胞应答反应细胞外信号（配体）细胞外信号（配体）受体受体胞内信息分子胞内信息分子1.不同种类的受体使用共同组分构成的信号不同种类的受体使用共同组分构成的信号转导；转导；2.在信号转导通路中不同类型的磷酸化同时在信号转导通路中不同类型的磷酸
48、化同时起作用。起作用。（四）细胞信号转导与药物研究（四）细胞信号转导与药物研究n细胞信号转导是维持正常细胞代谢和存活细胞信号转导是维持正常细胞代谢和存活所必须，与人类的健康和疾病密切相关。所必须，与人类的健康和疾病密切相关。n信号转导药物信号转导药物n信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号转信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号转导药物研究的出发点。导药物研究的出发点。（五）药物作用的靶酶（五）药物作用的靶酶n 药物对靶酶的作用：药物对靶酶的作用：一是调节酶量（酶的合成增加或减少），一是调节酶量（酶的合成增加或减少），二是调节酶活力（激动剂、抑制剂、辅酶或活二是调节酶活力（激动剂、抑制剂、辅酶或活力调
49、节）。力调节）。n有些重要治疗剂的作用在于它们能选择性有些重要治疗剂的作用在于它们能选择性地抑制一种靶酶。地抑制一种靶酶。n 一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效药物应具备以下条件：药物应具备以下条件：1.被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾病被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾病的发生有关，在患者体内这一生化途径的抑的发生有关，在患者体内这一生化途径的抑制具有治疗意义。制具有治疗意义。2.这种酶抑制剂必须具有特异性，在治疗剂量这种酶抑制剂必须具有特异性，在治疗剂量内不对其它代谢途径或受体发生抑制作用。内不对其它代谢途径或受体发生抑制作用。3.这种抑制剂应具有某
50、种药动学特征，如可这种抑制剂应具有某种药动学特征，如可被吸收并渗透到作用部位和具有合理，可被吸收并渗透到作用部位和具有合理，可预见的量效关系及作用持续时间。预见的量效关系及作用持续时间。4.抑制剂对人体毒性较小，疗效指数高。抑制剂对人体毒性较小，疗效指数高。5.抑制剂应符合药品标准。工艺、质量与价抑制剂应符合药品标准。工艺、质量与价格在临床上与市场上具有竞争性。格在临床上与市场上具有竞争性。（六）细胞生长调节因子（六）细胞生长调节因子n细胞生长调节因子细胞生长调节因子系在体内和体外对效应系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类生理活性物质，
