1、|遗传毒理学遗传毒理学( (Genetic ToxicologyGenetic Toxicology) )|DNADNA与基因与基因: : 基因基因( (gene)gene) 基因组基因组( (genosomegenosome) ) |染色质染色质( (chromatin)chromatin)与染色体与染色体( (chromosome)chromosome) |体细胞体细胞( (somatic cell)somatic cell)和生殖细胞和生殖细胞( (germ germ cell)cell) |基因型基因型( (genotype)genotype)与表型与表型( (pheotypepheo
2、type) )|细胞周期细胞周期( (cell cycle)cell cycle)、有丝分裂有丝分裂( (mitosis)mitosis)与减数分裂与减数分裂( (meiosis)meiosis) |基因突变（基因突变（gene mutationgene mutation）|染色体畸变（染色体畸变（chromosome aberrationchromosome aberration）|非整倍体和多倍体非整倍体和多倍体 ( (aneuploidyaneuploidy and and polyloidpolyloid) )|二、染色体畸变二、染色体畸变( (chromosome aberratio
3、n)chromosome aberration) 指染色体的结构改变指染色体的结构改变 z染色单体型畸变染色单体型畸变( (chromatidchromatid-type aberration)-type aberration)z染色体型畸变染色体型畸变( (chromosome aberration) chromosome aberration) 染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙( (gap)gap) 断裂断裂( (break) break) 断片断片( (fragment)fragment)和和缺失缺失( (deletion)deletion) 微小体微小体( (minute body)min
4、ute body) 无着丝点环无着丝点环环状染色体环状染色体 双着丝点染色体双着丝点染色体 倒位倒位( (inversion)inversion) 易位易位( (translocation)translocation) 插入插入( (insertion)insertion)和和重复重复( (duplication) duplication) 辐射体辐射体 染色体缺失及环状染色体的形成图染色体缺失及环状染色体的形成图 染色体插入和重复示意图染色体插入和重复示意图 染色体的臂间倒位染色体的臂间倒位 染色体相互易位示意图染色体相互易位示意图 |二、染色体畸变二、染色体畸变( (chromosome
5、aberration)chromosome aberration) z1 1非整倍体非整倍体 非整倍体非整倍体( (aneuploidaneuploid) )指细胞丢失或指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体体( (monosomemonosome) )，增加一条染色体时称为三体增加一条染色体时称为三体( (trisometrisome) )。染色体数目的改变会导致基因平衡的染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如异常。如2121三体导致先天愚
6、型三体导致先天愚型( (DownDown氏综合征氏综合征) )。z2 2整倍体整倍体 整倍体整倍体( (euploideuploid) )指染色体数目的异常指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体( (triploid)triploid)、四倍体四倍体( (tetroploidtetroploid) )等。在人体，等。在人体，3 3n n为为6969条染色体，条染色体，4 4n n为为9292条染色体。在肿瘤细胞及人条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞
7、的整倍体改变，几乎都是致死性的。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|( (一一) )碱基损伤碱基损伤z1. 碱基错配碱基错配z2. 嵌入嵌入DNA链链z3. 碱基类似物的取代碱基类似物的取代z4. 碱基的化学结构改变或破坏碱基的化学结构改变或破坏 |一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|（二）（二）DNADNA链受损链受损 1. 1. 二聚体的形成二聚体的形成 2. 2. DNADNA加合物（加合物（DNA adductsDNA adducts）形成形成 3. 3. DNA-DNA-蛋白质交联物蛋白质交联物( (DNA-ProteinD
8、NA-Protein crosslinkscrosslinks，DPCDPC) )形成形成 |二、二、引起突变的细胞分裂过程的改变引起突变的细胞分裂过程的改变|三、其他的改变三、其他的改变 对对DNADNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致合成和修复有关的酶系统作用可间接导致 DNADNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。损伤，诱发基因突变或染色体畸变。 |一、一、机体修复机体修复DNADNA损伤的机制可分为两大类：损伤的机制可分为两大类： 1.损伤耐受机制：指损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止遗传可绕过那些阻止DNA 复制的复制的DNA损伤。损伤。 2. 修复机制：修复机制：DNA修复
9、修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复|二、二、遗传因素对致突变作用的影响：遗传因素对致突变作用的影响： z ( (一一) )代谢酶遗传多态性代谢酶遗传多态性 z ( (二二) )修复功能的个体差异修复功能的个体差异 |一、观察项目的选择一、观察项目的选择z 1 1观察的效应终点类型观察的效应终点类型基因突变和染色体畸变的检测可直接反基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致
10、突变性唯一可靠的方法。还有许多物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为统称为遗传学终点遗传学终点( (genetic endpoint)genetic endpoint)。 |一、观察项目的选择一、观察项目的选择z遗传学终点分为遗传学终点分为5 5类：类：DNADNA完整性的改变完整性的改变( (形成加合物，断裂，形成
11、加合物，断裂，交联交联) )；DNADNA重排或交换；重排或交换；DNADNA碱基序列改变；碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。染色体分离改变。l其中实际上指基因突变，指染色体其中实际上指基因突变，指染色体畸变。畸变。 |2 2成套的观察项目成套的观察项目z遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：学试验。因为：化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两
12、者兼而有之，故在成套观察项目中或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如试验则通过加入模拟代谢系统，如S S9 9来弥补缺
13、乏活化来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。检，即出现假阴性。 |2 2成套的观察项目成套的观察项目|关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：入选的原则有：z选择的遗传毒性试验应包括选择的遗传毒性试验
14、应包括5 5种类型的遗传种类型的遗传学终点。学终点。z通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。z体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。z应包括生殖细胞和体细胞。应包括生殖细胞和体细胞。z通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进内的真实性，再行
15、选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。行遗传危害的评价。 |二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验 z( (一一) )细菌回复突变试验细菌回复突变试验( (AmesAmes试验试验) ) 鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突组氨酸营养缺陷型突变株。变株。(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物|二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z( (二二) )微核试验微核试验 微核微核( (Micronucleus)Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或
16、纺锤丝是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染
17、色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核微核试验试验( (Micronucleus Micronucleus testtest，MNTMNT) )是观察受试物是观察受试物能否产生微核的试验。能否产生微核的试验。其主要可检出其主要可检出DNADNA断裂断裂剂和非整倍体诱变剂。剂和非整倍体诱变剂。 (二二)微核试验微核试验MNNCE|二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z(三三)染色体畸变分析染色体畸变分析 z(四四)姐妹染色单体交换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE） |二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z(五五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐
18、性致死试验z(六六)显性致死试验显性致死试验z(七七)程序外程序外DNA台成试验台成试验 z(八八)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验z(九九)哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题 z(一一)阴性和阳性对照的设立阴性和阳性对照的设立 1 1阴性对照阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，数据。例如，AmesAmes试验的
19、阴性对照可了解所用试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。无任何使回复突变率增加或减少的因素。 2 2阳性对照阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames
20、Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(二二)体外试验的活化系统体外试验的活化系统 1 1哺乳动物细胞介导哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种
21、活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9S9，但不如体内活化系统。但不如体内活化系统。 2 2S9 S9S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经经90009000g g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶( (MFO)MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺
22、点是其缺点是S9S9随实验动物种属或器官不同而有差异；随实验动物种属或器官不同而有差异；S9S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。 3 3纯化酶和基因工程纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素应用纯化细胞色素P-450P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素工程，将人的细胞色素P-450P-450基因，插入组合细胞基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢内，用上
23、述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。活化系统。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(三三)致突变试验与致癌试验的关系致突变试验与致癌试验的关系 已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与发现人类接触致癌物与DNADNA加合物，同其肿瘤加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具
24、中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。学物质致癌性进行筛检。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件：阴性结果判定条件：最高
25、剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选物细胞进行体外试验，常选LDLD5050或或LDLD8080为最大剂为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以中可以50005000gg皿作为最高剂量。皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒在非常狭
26、窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中试验结果在毒理学安全性评价中的作用的作用阳性结果应具有剂量阳性结果应具有剂量反应关系，即随反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所
27、表示的含义不一。如基终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNADNA修复的实际后果尚不明确。修复的实际后果尚不明确。 |美国美国EPA毒物处毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。z第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染微核试验或染色体
28、畸变试验色体畸变试验)；z第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；z第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。z在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特
29、异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。 |国际协调组织国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为议的检测试验组合为z细菌基因突变试验；细菌基因突变试验；z体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；细
30、胞比试验；z体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。z在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如研究时，其他试验如DNA加合物测定、加合物测定、DNA链断裂检测、链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显
31、示有可能具致癌性或致突毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验验或应用肿
32、瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏如肝脏UDS试验、试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测关基因的遗传改变检测)。 |我国卫生部在食品安全性毒理学评价我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序程序(1994)中对遗传毒理学试验的要中对遗传毒理学试验的要求是：求是：z根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验 以及体细以及体细胞和生殖细胞的原则，在胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓路试验、小鼠骨髓微核试验或骨
33、髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，隐性致死试验，UDS试验试验)中再选择两项试验进行。中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序我国农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗中对遗传毒理学试验的要求则为：传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓
34、细胞微核试验或骨髓细胞染色回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。第八第八卫生毒理学教研室2004.5|1775年英国Pott 阴囊癌|1895年德国Rehn 职业性膀胱癌|1915年日本山极和市川 试验性皮肤癌|1922年英国Kennway 动物
35、皮肤癌|1945年英国Case 职业性膀胱癌|肿瘤指有分裂潜能的细胞受致癌因素的作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物，在人体任何部位、任何组织都可以发生肿瘤。|化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程。|化学致癌物(chemical carcinogen)是指具有化学致癌作用的化学物质。 |第一节 化学致癌机制|第二节 化学致癌物的分类 |第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法|一、化学致癌作用多因素、多基因参与的多阶段过程z致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与z不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤
36、在不同地区所见的遗传变化是不同的z多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用z个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响|二、与致癌作用有关的代谢活化与灭活： 前致癌物 近致癌物 终致癌物 Precarcinogens proximate carcinogens ultimate carcinogens|三、化学致癌作用的分子机制：|（一）DNA加合物：|（二）DNA修复与致癌过程：|（三）癌基因、原癌基因和抑癌基因：| 1、癌基因（oncogene）和原癌基因（proto-oncogene）：| 2、抑癌基因（anti-oncogene）|（四）基因表达调控异常与肿瘤的发生：|四、化学致癌过
37、程：|引发阶段 促长阶段 进展阶段（initiation） （promotion）（progression） 前致癌物前致癌物终致癌物终致癌物细胞含错细胞含错配碱基配碱基细胞死亡细胞死亡不分化的癌不分化的癌分化的肿瘤分化的肿瘤致癌物致癌物-DNA加加合物合物引发的细胞引发的细胞正常细胞正常细胞转移转移|IARC将化学物对人类致癌性资料(流行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级（2002，878）：|组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分者属于本组。87|组2，对人类是很可能或可能致癌物。又分为两组，即组2A和组2B。z 组2A，对人类很可能(probably)是致癌物，指对人
38、类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。63z 组2B，对人类是可能(possible)致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。234|组3，现有的证据不能对人类致癌性进行分类。493|组4，对人类可能是非致癌物。1|根据致癌机制分类 z1.genotoxic carcinogens直接致癌物间接致癌物无机致癌物z2.non- genotoxic carcinogens促长剂 激素调控剂细胞毒剂 过氧化物酶体增殖剂免疫抑制剂 固态物质z3.未分类：美舍吡伦第第类类|一、用于致癌物筛选的短期试验|（一）致突变试验：z基
39、因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验);z染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;z原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；z体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞。 |一、用于致癌物筛选的短期试验：|（二）哺乳动物短期致癌试验： 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：z1小鼠皮肤肿瘤诱发试验：于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠
40、为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。z2小鼠肺瘤诱发试验：染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计)b检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。z3大鼠肝转化灶诱发试验。对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在814周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试
41、验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。z4雌性大鼠乳腺癌诱发试验，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。z 此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。|一、用于致癌物筛选的短期试验：|（二）哺乳动物短期致癌试验：|何时应考虑进行致癌性评价：z人体可能长期暴露于该化学物；z该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；z反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。z如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性
42、结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。 |ICH(1995)根据已知的危险因素、拟定的适应症和用药时间，提出下列进行新药致癌性研究的范围，避免不必要的试验。z临床上连续应用6个月以上的药品；对慢性或复发性疾病需间断性长期反复治疗的药品；造成长期暴露的给药系统。z已知属于对人具有潜在致癌性的同类化合物；构效关系提示具有致癌危险性的物质3长期毒性试验发现癌前病变3原型或代谢产物在组织内长期蓄积，引起局部组织反应或其他病理生理反应的物质。z具有遗传毒性的物质
43、往往具有致癌性，如拟长期使用，应进行慢性毒性试验(1年)，检测早期致癌反应。z拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药等。z 局部使用吸收很差的药物不必进行经口致癌试验。z 已具有致癌性资料的药物的各种酸、碱、盐应提供其在药物动力学、药效学或安全性方面没有明显改变的证据，对于酯和复杂的衍生物在确定是否需要进行致癌试验时也应有类似的资料，并应个案讨论。z 基本作为替代治疗的内源性物质不需要进行致癌试验。但对生物技术制品，下列情况可考虑进行致癌试验：生物学作用明显不同于天然相应物质的制品；结构明显不同于天然相应物质的制品；在人体引起局部或全身浓度明显增加的制品。 |二、哺乳动
44、物长期致癌试验：|（一）试验动物 z物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理学资料较完备，因此使用最广泛。在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。 z性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。z年龄：使用刚断乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。 |（二）剂量选择和动物数量 z致癌试验一般设三个试验组。z美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此
45、剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。zICH(1995)提出，高剂量选择可以根据：毒性终点，即最大耐受剂量(MTD);药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25倍；选择吸收饱和剂量;药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱;最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5。限制剂量为1500mg(kg体重d)。 |（二）剂量选择和动物数量z中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10。中剂
46、量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。z同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。z动物数量：每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。 |（三）染毒途径 z经口染毒是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺人饲料或饮水中连续给予动物(57天/周)。若掺入后的适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5。z经皮染毒，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10。必须保证受试物与皮肤良
47、好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周37次。z吸入染毒，每天染毒4小时，每周57天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应均匀、恒定。z其他注射途径可根据需要采用。 |（四）试验期限| ICH(1997)建议参考下面几条准则：z(1)一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。z(2)当最低剂量组或对照组存活的动物只有25时，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结
48、束试验。z 一个合格的阴性对照试验应符合下列标准：因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10。小鼠和仓鼠在18个月，大鼠在24个月时各组存活的动物不能少于50。 |（五）观察和结果分析z 1一般观察 每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄入量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。老年动物多病易死，应加强巡视，防止动物死亡后未及时刻验，发生尸体组织自溶。z 2病理检查 动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉
49、眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。|（五）观察和结果分析z3结果分析 统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性肿瘤)及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。肿瘤发生率()(实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数)100z 式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤潜伏期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。应对试验结果进行仔细的统计学分析，并研究剂量反应关系。 |致癌试验阳性的判定标准WH
50、O(1969)：z(1)对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；z(2)试验组发生对照组没有的肿瘤类型；z(3)试验组肿瘤发生早于对照组；z(4)与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。z 在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。 |结果报告：z应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；z应报告剂量反应关系及统计学分析结果。z如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍
