1、第第6 6章章. .荧光分光光度法荧光分光光度法6.1 概述6.2 方法原理6.3 荧光分析法6.4 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用荧光分光光度法在生物工程分析中的应用6.1 概述荧光蛋白质 在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。 用绿色荧光蛋白标记的细胞 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞
2、器)的标记。 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。 荧光染料 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。 用于增白洗衣粉中的增白剂， 指示信号用的各种荧光路标漆， 荧光标志服等。 荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有的黄光辐射互为补色成为白光，提高产品在日光下的白度。 6.2 方法原理6.2.16.2.1荧光（磷光）产生机理荧光（磷
3、光）产生机理6.2.2.1 6.2.2.1 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 。MM+M 能量热量M+hv+热量荧光F 磷光P 寿命10-7-10-9 S寿命10-4-10S单重态单重态 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。所有电子自旋都配对的分子的电子状态。 大多数有机物分子的基态是单重态。
4、大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。6.2.2.2 电子激发态的多重态三重态三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。有两个电子的自旋不配对而平行的状态。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转移振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转移l l 2T2内转移振动弛豫10-14-10-12S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7S6.2.2.3 激发态基态的能
5、量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。荧光荧光：时间较短,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态。磷光磷光：自旋禁阻，时间较长，第一激发三重态三重态的最低振动能级基态。分子去活化过程及荧光的发生 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环
6、境），在10-1110-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。（“内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转移振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”。如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-9 10-7秒。（它代表荧光的寿命）
7、 4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态)的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。荧光和磷光的根本区别: 荧光是由单重跃迁-单重引起的， 磷光则由三重跃迁-单重产生的。6.2.2.4 分子荧光的类型 分子因吸收光能而被激发，所产生的次级光发射现象称为光致发光光致发光； 分子被激发的能量是由化学反应释放的能量所提供，其发光现象称为化学发光化学发光。由生物体内化学反应所引起的发光现象，被称为生物发光生物发光。 荧光棒 荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料荧光染料三种化学成分构成。荧光棒发光原理是过氧化物和酯类化合物发生反应后，能量传递至
8、荧光染料，再由染料发出荧光。萤火虫、水母、深海鱼类发光机制是两种物质荧光素和荧光素酶合作产生的结果 6.2.3 6.2.3 激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱 1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(I)，作I光谱图称激发光谱。 2. 荧光光谱：选择ex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录不同发射波长时的I，作 I- 光谱图称为荧光光谱。图68蒽在乙醇溶液中的镜像光谱3.荧光光谱的特点：荧光光谱的特点：斯托克斯位移（斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，与激发光谱相比，荧
9、光光谱的波长总是出现在更长的波长处；荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；荧光光谱与激发波长无关。荧光光谱与激发波长无关。无论用无论用=250和和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。6.2.4 荧光量子产率与分子结构荧光量子产率与分子结构 1.产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的）分子具有与辐射频率相应的荧光结构荧光结构（内因）；（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定）吸收特征频率的光后，应可产生具
10、一定量子效率量子效率的荧光。的荧光。即量子效率即量子效率 F足够大：足够大：吸吸收收的的光光量量子子数数发发射射的的荧荧光光量量子子数数 F2.分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系1）跃迁类型：）跃迁类型： 通常，具有通常，具有 *及及n *跃迁结构的分子跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具才会产生荧光。而且具 *跃迁的荧光效率比跃迁的荧光效率比 n *跃迁的要大得多。跃迁的要大得多。2）共轭效应：）共轭效应： 共轭度越大，荧光越强。共轭度越大，荧光越强。共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系lex=205nmlex=286nmlex=356nmlem=278nmlem=321nmlem=
11、404nmF=0.11F=0.29F=0.36共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系分子结构与荧光分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性）刚性结构和共平面性： 分子刚性（分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。提高。 如荧光素（如荧光素（ 大）与酚酞（大）与酚酞（ =0）（3） 刚性平面结构刚性平面结构酚酞酚酞(无荧光无荧光)8羟基喹啉羟基喹啉(弱荧光弱荧光)红色荧光红色荧光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO荧光素荧光素联二苯联二苯 = 0.2芴芴 = 1.03,
12、4-苯并芘苯并芘( 强荧光物质强荧光物质)CH2刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系OHNNOMg1/28 羟基喹啉羟基喹啉8 羟基喹啉镁羟基喹啉镁刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系SO3NaNCH3CH3SO3NaNCH3H3C7 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸盐磺酸盐 F =0.758 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸盐磺酸盐 F =0.03空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系分子结构与荧光分子结构与荧光4）取代效应：）取代效应： 给电子取代基增强荧光（给电子取代基增强荧
13、光（p- 共轭），共轭），如如 -OH、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等；等； 吸电子基降低荧光，如吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；等； 与与 体系作用小的取代基影响不明显：体系作用小的取代基影响不明显： SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I无荧光无荧光NH2OH比比荧光强荧光强50倍倍 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光刚性会加强荧光: :有荧光有荧光COOHOH无荧光无荧光OHCOOH水杨酸水杨酸有荧光有荧光OHOHCO 重原子降低荧光但增强磷光，重原子降低荧光但增强磷光，
14、如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。到消失，该现象也称重原子效应。影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（一）溶剂效应：（一）溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度溶剂极性可增加或降低荧光强度 （改变（改变 *及及n * 跃迁的能量）；跃迁的能量）； 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。加或降低荧光强度。影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（二）温度：（二）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或增加、粘度或
15、“刚性刚性”降低）。因此体系降低温降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。度可增加荧光分析灵敏度。如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10 ，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（三）（三）pH值：值： 具酸或碱性基团的有机物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。性，因而也可使其荧光强度发生改变。OH-H+NH4+H+OH-NH2NH
16、-pH 13pH712苯胺苯胺苯胺在pH7-12溶液中会发生蓝色荧光，在pH小于2或大于13的溶液中都不发生荧光。影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸：（四）内滤光和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭：（五）荧光猝灭： 碰撞猝灭；碰撞
17、猝灭； 静态猝灭；静态猝灭； 转入三重态的猝灭；转入三重态的猝灭； 电子转移猝灭；电子转移猝灭； 自猝灭。自猝灭。例：猝灭剂（quencher）的影响荧光猝灭荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。 引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性物质。吸电子极性物质。荧光猝灭法荧光猝灭法: 有些猝灭剂的加入，其荧光强度的减荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光猝灭法。0IIF
18、溶液的荧光溶液的荧光一荧光分析的定量基础一荧光分析的定量基础荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 F= F I0 Cb F 荧光效率荧光效率 荧光物质的摩尔吸光系数荧光物质的摩尔吸光系数 I0 激发光强度激发光强度 b 液层厚度液层厚度 F = KC（该式只有当（该式只有当 Cb 0.05时才时才成立）成立）6.3荧光分析法2. 荧光分光光度计单色器单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器。光源光源：高压汞灯、氙灯检测器检测器：光电倍增管2. 荧光分光光度计单色器单色器单色器单色器光源光源。 检测器检测器液液 槽槽放大和指示仪表放大和指示仪表荧光分光光
19、度计的结构示意图荧光分光光度计的结构示意图I0I 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧灯. 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中样品池用石英或低荧光的玻璃材料.发射单色器发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。用于选择投射到检测器的荧光波长。检测器检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。精密的荧光光度计采用光电倍增管为检测器，将转入的光信号转变为电信号，并将其放大，由记录器记录荧光强度。6.3.2 6.3.2 荧光分析方法特点及应用荧光分析方法特点及应用( (一一) )荧光分析
20、方法及特点荧光分析方法及特点1 1标准曲线法标准曲线法 用已知的标准物质经过和试样同样的处理后，用已知的标准物质经过和试样同样的处理后，配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。2 2荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。 这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相这两种方法在灵敏度方面的
21、差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同。关的参数的测量方式不同。 而荧光强度而荧光强度F F（或磷光强度（或磷光强度P P）直接同荧光（磷）直接同荧光（磷光）物质的浓度成正比。同浓度相关的参数是在很光）物质的浓度成正比。同浓度相关的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）发射讯号本身，可用小噪声背景上的荧光（磷光）发射讯号本身，可用增强入射光强度增强入射光强度I I0 0或增大荧光讯号的放大倍数来提或增大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在光度法中高灵敏度。而在光度法中, , 若检测器放大倍数若检测器放大倍数 ，I I0 0及及I I同时同时,A,A值不变。值不变。 故荧光法灵敏度常比相应光
22、度法高故荧光法灵敏度常比相应光度法高2 24 4个数量个数量级。级。 在光度法中在光度法中,表示方法的灵敏度。表示方法的灵敏度。，其测定灵敏度其测定灵敏度。 在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的及及发射时的发射时的量子效率量子效率有关。荧光法绝对灵敏度理有关。荧光法绝对灵敏度理论定义为论定义为的乘积（的乘积（单位单位ggcmcm-2 -2 ）, , ，荧光强度，荧光强度，测定灵敏度，测定灵敏度。荧光法绝对灵。荧光法绝对灵敏度实际定义为敏度实际定义为/H /H （H H发射光谱半峰宽度发射光谱半峰宽度mm-1 -1 ） 。 一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对
23、灵敏度是以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。 几种物质的荧光绝对灵敏度几种物质的荧光绝对灵敏度 荧光物质荧光物质最大吸收波长最大吸收波长/nm最大荧光波长最大荧光波长/nm荧光光谱半宽荧光光谱半宽度（度（H）m-1荧 光 灵 敏荧 光 灵 敏度 （ 最 大度 （ 最 大吸收波长）吸收波长）喹啉硫酸氢盐喹啉硫酸氢盐(0.05molL-1H2SO4)2504610.470.066罗丹明罗丹明B（酒精）（酒精）5445710.170.88荧光素荧光素（0.1molL-1NaOH4905150.201.0四溴荧光素四
24、溴荧光素（0.1molL-1NaOH5185400.180.19硫堇硫堇(0.05molL-1H2SO4)5986210.180.031 3.3. 荧光分析法的选择性荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只有很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有干扰很少，选择性较好。干扰很少，选择性较好。1.1.无机化合物无机化合物 很多金属（除铀盐等）和非金属可同有机化合物形很多金属（除铀盐等）和非金属可同有机化合物形成荧光配合物，测量发射的荧光可定量分析。荧光成荧光配合物，测量发射的荧光可定量分析。荧光法可测元素：
25、法可测元素：AlAl、AuAu、B B、BeBe、CaCa、CdCd、CuCu、EuEu、GaGa、GdGd、GeGe、HfHf、MgMg、NbNb、PbPb、RhRh、RuRu、S S、SeSe、SbSb、SiSi、SnSn、TaTa、TbTb、ThTh、TeTe、W W、ZnZn和和ZrZr等。还等。还有一些无机离子如氟和氰离子等能使其它物质的荧有一些无机离子如氟和氰离子等能使其它物质的荧光由于熄灭效应而减弱。据此可测氟和氰等离子的光由于熄灭效应而减弱。据此可测氟和氰等离子的浓度。浓度。 (二)荧光分析法的应用无机离子的荧光测定法无机离子的荧光测定法 离子离子试剂试剂波长，波长，nm灵敏度
26、灵敏度干扰干扰激发激发荧光荧光g/mLAl3+茜素紫酱茜素紫酱R4705000.007Be,Co,Cr,Cu,Th,Zr,F-,NO2-,Ni,PO43-F-铝铝-茜素紫酱茜素紫酱R(荧光熄灭荧光熄灭)4705000.001Be,Co,Cr,Cu,Fe,Ni, Th,Zr, PO43-B4O72-安息香安息香3704500.04Be,SbCd2+2-(邻羟基苯邻羟基苯)苯并恶唑苯并恶唑365蓝蓝2NH3Li+8-羟基喹啉羟基喹啉3705800.2MgSn4+黄酮醇黄酮醇4004700.1Fe,PO43-,ZrZn2+安息香安息香绿绿10B,Be,Sb, 2. 很多有机化合物可同无机阳离子形成荧
27、光配合物，一般都很多有机化合物可同无机阳离子形成荧光配合物，一般都具有苯环以及二个以上能同金属离子螯合的配位基团。具有苯环以及二个以上能同金属离子螯合的配位基团。下下面是四种最常用的荧光试剂的结构：面是四种最常用的荧光试剂的结构： NOHNHOOHNOHSO Na3OCOCOHCOH8-羟基奎宁茜素紫酱R黄酮醇安息香（用于Al，Be等金属离子的试剂）（用于AlF的试剂）（用于Zr和Sn的试剂）（用于B，Zn，Ge和Si的试剂） 这些荧光试剂都具有这些荧光试剂都具有电子系统。激发和发射过程同电子系统。激发和发射过程同-*跃迁有关跃迁有关。这种跃迁常产生宽的无精细结构的荧。这种跃迁常产生宽的无精细
28、结构的荧光峰。光峰。 NOHNHOOHNOHSO Na3OCOCOHCOH8-羟基奎宁茜素紫酱R黄酮醇安息香（用于Al，Be等金属离子的试剂）（用于AlF的试剂）（用于Zr和Sn的试剂）（用于B，Zn，Ge和Si的试剂） 3.3.生物分子:利用激发光谱和发射光谱用荧光法研究氨基酸和蛋白质。虽然游离氨基酸中能产生荧光的只有几个带苯环的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白质含有荧光辅酶(Fluorescent coenzyme)，荧光辅酶生色剂可用于许多蛋白质的荧光分析中。 维生素B1(硫胺素)含量的测定 维生素B2(核黄素)含量的测定 维生素B11(叶酸)含量的测定烟熏、烘烤、油炸
29、等造成了3，4苯并芘含量的增加举例举例 痕量痕量3,4-苯并芘的测定苯并芘的测定: 苯并芘苯并芘方法一：方法一：萃取（环己酮或石油醚）萃取（环己酮或石油醚）浓缩浓缩层析层析以以H2SO4 溶解苯并芘溶解苯并芘荧光分析荧光分析荧光测定：荧光测定：l lex = 520 nml lem= 545 nm方法二：试样先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液液液分配或色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘。分离出的苯并芘斑点，在波长365nm的紫外光灯下观察，与标准斑点进行目测比色概略定量。因苯并芘在紫外光灯下照射呈蓝紫色荧光斑点。举例二 1,3-环己二酮-甲醛作为荧光衍生试剂荧光分光光度法
30、测定氨苄西林钠荧光测定：荧光测定：l lex = 336 nml lem= 420 nm Floroskan Ascent系列荧光分析仪应用领域： 细胞内Ca2+检测（Intracellular Ca2+ ） 细胞增殖 (Cell proliferation) 细胞毒性 (Cytotoxicity) 多药物耐药性 (Multi-drug resisent) 细胞粘附 (Cell adhesion) DNA定量（DNA quantitation） 报告基因分析（Reporter gene assay） 杂交分析（Hybridization assay） 免疫分析（Immunoassays） 酶活性分析（Enzyme activity） 细菌定量（Bacterial quantitation） 细胞溶解作用（Phagocytosis） 荧光和化学发光检测仪荧光和化学发光检测仪 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图本章作业思考题1.名词解释：荧光与磷光；激发光谱与发射光谱的定义及区别。2.荧光物质的分子结构通常具备哪些特点？3.荧光分光光度计在结构上与紫外分光光度计有何异同?
