1、实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析一、数据分析p定量PCR扩增曲线的各种概念一、数据分析p什么是基线 基线是扩增曲线的水平部分。一、数据分析p基线扣除一、数据分析p什么是阈值 阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。一、数据分析p什么是Ct值 Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。一、数据分析p基线一、数据分析p基线一、数据分析p基线一、数据分析p基线一、数据分析p阈值线一、数据分析p阈值线二、常见问题分析1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。（抑制物的
2、影响可通过稀释样本消除）二、常见问题分析pPCR抑制物l 黑色素 l 多糖类l 血红蛋白l 尿素l 其他l 乙醇 l 蛋白酶Kl 胍盐l 苯酚二、常见问题分析p血液中PCR抑制物的作用机制及对策抑制物抑制物作用原理作用原理对策对策肝素可结合于DNA和RNA上；对反转录酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化锂血红蛋白含有铁，释放铁离子至PCR混合物，干扰DNA合成。1）DNA-琼浆糖凝胶珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH处理。乳铁蛋白含有铁，释放铁离子至PCR混合物，干扰DNA合成。同上免疫球蛋白IgG与单链DNA相互作用同上亚铁血红素与DNA、RN
3、A结合，后续的提取过程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，结合亚铁血红素二、常见问题分析p检查样本质量 用分光光度计测量样本260/280比值 DNA纯度：OD260/OD280=1.8 RNA纯度：OD260/OD280=2.0二、常见问题分析2、自动基线有问题二、常见问题分析p手动设置基线 点击右键，选择Baseline Threshold二、常见问题分析p手动设置基线 将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环” 即，原始为26，将其设置为20，点击OK二、常见问题分析p手动设置基线 设置完成后问题曲线恢复正常二、常见问题分析3、重复性1个样本4个复孔重复性好二、常见
4、问题分析3、重复性1个样本4个复孔重复性差二、常见问题分析p造成重复性差的原因 基线、阈值的设置 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 低拷贝的样本泊松分布 没有使用ROX校准（ABI7500）二、常见问题分析p基线、阈值的设置 根据曲线的具体情况进行设置：阈值：大部分曲线荧光强度/20基线：开始2/3（根据仪器和试剂） 结束扩增信号出现的前一个循环 如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。二、常见问题分析p加样误差（操作？移液器？）p没有将试剂和样本充分混匀 有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCR Mix反应液、引物探针、样本、水），在分装入
5、反应板（管）前没有充分混匀。 结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。 解决方法： 在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离心。 同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体都在反应管底部。二、常见问题分析p低拷贝的样本泊松分布 泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布（discrete probability distribution）。 在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？二、常见问题分析pROX校准：参比荧光（ABI7500）二、常见问题分析pROX设置 ABI7500仪器软件自动进
6、行ROX校准。 ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。二、常见问题分析4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例） 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）二、常见问题分析p指数增长期内扩增曲线具有高度重复性二、常见问题分析p是什么原因造成平台期很低呢？ 可能是目标样本的浓度太低。 通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体。 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的
7、平台期很低。二、常见问题分析p引物和模板比例二、常见问题分析p是否可以调整引物和模板的比例？ YES。 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太低。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线的形状不相同。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 同时这些曲线没有明显的指数增长期。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 最后看线性图谱。 曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 案例： 先看对数图谱 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲线
8、不光滑。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 案例： 再看下线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。二、常见问题分析p如何判断他们是否存在扩增？ 案例： 分析： 形成这类曲线的原因可能是模板可能是模板的质量差（PCR抑制物；模板浓度低），也有可能是引物探针有问题。 试剂原因： 如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。 荧光信号差的试剂也会有同样的问题。二、常见问题分析p总结 对PCR原理的了解是基础，一切从原理出发。 常见问题归类： 抑制物：稀释样本消除抑制 重复性差：基线/阈值设置、加样/混匀、泊松分布、参比荧光 可疑的扩增：综合各种图谱分析
