1、药品质量检测技术第六章 仪器分析v教学目标教学目标 1.掌握紫外分光光度法及可见分光光度法的掌握紫外分光光度法及可见分光光度法的 基本原理基本原理 2.掌握色谱法基本理论掌握色谱法基本理论 3.了解分光光度法和色谱法在工业生产和科学研究了解分光光度法和色谱法在工业生产和科学研究 中的应用中的应用 v知识要点知识要点 1.吸收光谱与物质结构的关系和光吸收基本定律吸收光谱与物质结构的关系和光吸收基本定律 2.色谱法基本理论色谱法基本理论 v技能要点技能要点 1.紫外紫外-可见分光光度计的应用可见分光光度计的应用 2.GC、HPLC、TLC的基本应用的基本应用 学习目标学习目标第一节第一节 分光光度
2、法分光光度法一、概述一、概述二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法三、红外分光光度法三、红外分光光度法一、概述v分光光度法：分光光度法： 测定被测物质在特定波长处或测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析的方法称为分光光度法。定性、定量分析的方法称为分光光度法。v主要包括主要包括: 紫外分光光度（电子光谱）法：吸收光波紫外分光光度（电子光谱）法：吸收光波长范围长范围200400nm，可用于物质的定性和，可用于物质的定性和定量分析。定量分析。 可见分光光度（电子光谱）法：吸收光波可见分光光度（电子光谱）法：吸收光
3、波长范围长范围400760nm，主要用于有色物质的，主要用于有色物质的定性和定量分析。定性和定量分析。二者合称为紫外二者合称为紫外-可见可见分光光度分光光度法即法即UV-ViS 红外分光光度法（红外分光光度法（IR，分子振，分子振-转光谱）：转光谱）：利用红外吸收光谱对物质进行分析的方利用红外吸收光谱对物质进行分析的方 法，吸收光波长范围法，吸收光波长范围2.51000 m，主要，主要用于已知结构的有机化合物鉴别（定性）用于已知结构的有机化合物鉴别（定性）二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法v光的基本特性光的基本特性v物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收v吸收定律吸收定律v紫外吸
4、收光谱的应用紫外吸收光谱的应用v紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 光的基本特性光的基本特性 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长动性可用波长 、频率、频率 、光速、光速c、波数（、波数（cm-1）等参数来描述：）等参数来描述： = c ； 波数波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量：光是由光子流组成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常数常数：h=6.626 10 -34 J S )单色光：单波长的光（由具有相同能量的光子单色光：单波长的光（由具有相同能量的光子组成）组成）白光（太阳光）：由各种单色
5、光组成的复合光白光（太阳光）：由各种单色光组成的复合光如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可成为白光，这两种颜色的光称为合，也可成为白光，这两种颜色的光称为互互补色光补色光。白光白光绿绿500-580橙橙600-650黄黄580-600红红650-780紫紫400-450蓝蓝450-480青蓝青蓝480-490青青490-500光的互补色示意图光的互补色示意图物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果而物质呈现的颜色则是被物质吸收光的互补色。而物质呈现的颜色则是被物质
6、吸收光的互补色。物质的吸收光谱曲线：物质的吸收光谱曲线： 将不同波长的光依次通过某一固定浓度和将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线）线） - -胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮几种有机化合物几种有机化合物的分子吸收光谱的分子吸收光谱图图吸收定律吸收定律CABeerlALamber定律：定律
7、：吸光度：单色光通过溶液时被吸收的程度，用吸光度：单色光通过溶液时被吸收的程度，用A A表示。表示。朗伯朗伯（Lambert）和比耳和比耳（beer）分别于分别于1760年年和和1852年研究了光的吸收与有色溶液按液层的厚年研究了光的吸收与有色溶液按液层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。法的理论基础。如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯为朗伯-比耳定律，得到：比耳定律，得到：A=Kbc 此式
8、为此式为光吸收定律的数学表达式光吸收定律的数学表达式。 式中式中A称为吸光度；称为吸光度； K是比例常数，与入射光的波长、是比例常数，与入射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因物质的性质和溶液的温度等因素有关。素有关。v 吸收系数吸收系数A=Kbc中比例常数中比例常数K称为吸收系数；称为吸收系数；物理意义：单位浓度的溶液液层厚度为物理意义：单位浓度的溶液液层厚度为1 cm 时，在一定波长下测得的吸光度。时，在一定波长下测得的吸光度。在药品检验的实际工作中，通常有两种表示方在药品检验的实际工作中，通常有两种表示方法：法： v质量质量吸收系数吸收系数a当当c的单位为的单位为g/L，b的单位为的单位
9、为cm时时，K用用a表表示，称为示，称为质量质量吸收系数这时朗伯吸收系数这时朗伯-比耳定律为：比耳定律为： Aabc。 在药品检验中经常使用的是百分吸收系数，用在药品检验中经常使用的是百分吸收系数，用（E1%1cm）表示。）表示。物理意义物理意义:当吸光物质溶液浓度为当吸光物质溶液浓度为1%(1g/100mL) ，液层，液层厚度为厚度为1cm时，在一定条件下的吸收度。时，在一定条件下的吸收度。 v 摩尔吸收系数摩尔吸收系数 当式中浓度当式中浓度c的单位为的单位为mol/L，液层厚度的单位，液层厚度的单位为为cm时，则用另一符号时，则用另一符号表示，称为摩尔吸收表示，称为摩尔吸收系数，它表示物质
10、的浓度为系数，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度，液层厚度为为1cm时，溶液的吸光度。其单位为时，溶液的吸光度。其单位为L/molcm。这时朗伯这时朗伯-比耳定律就变为：比耳定律就变为： Abc紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用v鉴别：同一物质在相同条件下，测得的紫外鉴别：同一物质在相同条件下，测得的紫外-可见吸收光谱应具有完全相同的特征。可见吸收光谱应具有完全相同的特征。 对比吸收光谱特征参数对比吸收光谱特征参数 比较吸收度比值的一致性比较吸收度比值的一致性 对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性v杂质检查：药物与杂质的吸收光谱有明显差杂质检查：药物与杂质的吸收光谱有明显差别别v含
11、量测定：朗伯含量测定：朗伯-比耳定律比耳定律 对照品比较法对照品比较法 吸收系数法吸收系数法 计算分光光度法计算分光光度法紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计v仪器的基本组成部件仪器的基本组成部件单色器吸收池检测器显示光源一般由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显一般由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器示器（数据处理系统）（数据处理系统）五部分组成。五部分组成。 光源光源 钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源，3252500nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源，185375nm 单色器（分光系统）单色器（分光系统） 包括狭缝、透镜系统（准直镜）和色散元件包括狭缝、透镜系统（准直
12、镜）和色散元件 吸收池（比色皿）吸收池（比色皿） 玻璃玻璃能吸收紫外光，仅适用于可见光区能吸收紫外光，仅适用于可见光区； 石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和不能吸收紫外光，适用于紫外和 可见光区可见光区； 要求要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）匹配性（对光的吸收和反射应一致） 为了消除误差提高测量的准确度，两只比色为了消除误差提高测量的准确度，两只比色 皿应配套使用皿应配套使用 检测器检测器（又叫接受器、光电转化器又叫接受器、光电转化器）光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管（检测弱光常用）（检测弱光常用）二极管阵列检测器二极管阵列检测器 信号显示器信号显示器 早期使用的是检流计、
13、微安表、电位计、早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等。数字电压表、自动记录仪等。 现代的分光光度计广泛采用数字电压表、现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及自动记录型装置和数据函数记录仪、示波器及自动记录型装置和数据处理台（称为工作站）。处理台（称为工作站）。 v紫外紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型 单光束分光光度计单光束分光光度计: 常用的有常用的有751G型、型、752型、型、721型、型、722型。型。 双光束分光光度计双光束分光光度计 ： 常用的有常用的有710型、型、730型、型、UV-210型等型等。 双波长分光光度计双波长分
14、光光度计 ： 与单波长与单波长分光光度计的主要区别在于采用双单色分光光度计的主要区别在于采用双单色器。器。v红外吸收产生的原理与条件红外吸收产生的原理与条件v红外光谱法的应用红外光谱法的应用v红外光谱仪红外光谱仪三、红外分光光度法三、红外分光光度法v红外吸收产生的原理与条件红外吸收产生的原理与条件 原理：原理：当分子中某个基团的振动频率和红外光的当分子中某个基团的振动频率和红外光的频率一致时，分子就吸收红外光的能量，从原来频率一致时，分子就吸收红外光的能量，从原来的基态振动能级跃迁到能量较高的振动能级。物的基态振动能级跃迁到能量较高的振动能级。物质对红外光的吸收曲线称为红外吸收光谱。质对红外光
15、的吸收曲线称为红外吸收光谱。 根据试样的红外吸收光谱进行定性、定量分根据试样的红外吸收光谱进行定性、定量分析和确定分子结构等分析的方法，称为红外分光析和确定分子结构等分析的方法，称为红外分光光度法。光度法。 红外光谱产生的条件红外光谱产生的条件 红外光的能量应恰好能满足振动能级跃迁所需要红外光的能量应恰好能满足振动能级跃迁所需要的能量，当红外光的频率与分子中某基团的振动的能量，当红外光的频率与分子中某基团的振动频率相同时，红外光的能量才能被吸收。频率相同时，红外光的能量才能被吸收。 红外光与物质之间有耦合作用。分子必须有偶极红外光与物质之间有耦合作用。分子必须有偶极矩的变化。矩的变化。v红外光
16、谱法的应用红外光谱法的应用 定性分析定性分析研究分子结构：如确定分子的空间构型，求化学键研究分子结构：如确定分子的空间构型，求化学键的力常数、键长和键角及未知化合物的结构鉴定等。的力常数、键长和键角及未知化合物的结构鉴定等。 定性分析定性分析官能团的定性分析、已知化合物的鉴定官能团的定性分析、已知化合物的鉴定 官能团的定性分析官能团的定性分析肯定法：肯定法：根据红外光谱的特征吸收峰，确认某基团的根据红外光谱的特征吸收峰，确认某基团的存在。存在。如某化合物的如某化合物的IR谱，在官能团区谱，在官能团区1740cm-1有吸收有吸收C=O，在指纹区，在指纹区1300cm-11150cm-1范围内有两
17、个强范围内有两个强吸收峰吸收峰CO，根据官能团区及指纹区的这三个相，根据官能团区及指纹区的这三个相关峰：关峰：否定法：否定法：基于某个波数区间内的吸收峰对某个基团是基于某个波数区间内的吸收峰对某个基团是特征的，在谱图中若无此吸收峰出现，则说明此基团特征的，在谱图中若无此吸收峰出现，则说明此基团在分子中不存在。在分子中不存在。COROR已知化合物的鉴定已知化合物的鉴定 用用标准试样标准试样对照对照 将试样的谱图与标准样品的谱图进行对照。将试样的谱图与标准样品的谱图进行对照。 与与标准谱图标准谱图对照对照 在没有纯净的标准物质时，可用标准谱图比较。在没有纯净的标准物质时，可用标准谱图比较。未知物结
18、构分析未知物结构分析未知物结构分析的一般步骤如下：未知物结构分析的一般步骤如下：了解与试样性质有关的其他资料了解与试样性质有关的其他资料了解来源了解来源元素分析的结果元素分析的结果相对分子质量相对分子质量熔点、沸点等物理性质和有关的化学性质熔点、沸点等物理性质和有关的化学性质由元素分析结果和相对分子质量推算出分子式由元素分析结果和相对分子质量推算出分子式计算不饱和度：计算不饱和度：21134nnn n n1 11 1价原子数目价原子数目n n3 33 3价原子数目价原子数目n n4 44 4价原子数目价原子数目规定：双键规定：双键(C=C、C=O)、饱和环状结构：、饱和环状结构：=1；叁键叁键
19、(CC)：=2；苯环：；苯环： =4。分子结构式中达到饱和时分子结构式中达到饱和时所缺一价元素的对数，每所缺一价元素的对数，每缺两个一价元素时，不饱缺两个一价元素时，不饱和度为一个单位和度为一个单位试样的制备和红外光谱的制作试样的制备和红外光谱的制作 被分析的试样应该是纯物质被分析的试样应该是纯物质 纯物质可以通过对试祥进行分离和精制的方法纯物质可以通过对试祥进行分离和精制的方法(如分如分馏、萃取、重结晶、层析等馏、萃取、重结晶、层析等)得到得到 根据试样的性质，按照试验条件制作红外光谱图根据试样的性质，按照试验条件制作红外光谱图谱图的解析谱图的解析 首先观察官能团区，解析第一强吸收峰属于何种
20、基团首先观察官能团区，解析第一强吸收峰属于何种基团的特征吸收峰。的特征吸收峰。如，羰基如，羰基(C=O)在在1820cm-11600cm-1有强吸收峰，其中：有强吸收峰，其中：COOCRROCORORCORHCORR1820 cm-1 1750 cm-11750 cm-1 1725 cm-11740 cm-1 1720 cm-11740 cm-1 1720 cm-1 找出该基团的全部或主要相关蜂，包括该基团在指纹找出该基团的全部或主要相关蜂，包括该基团在指纹区的吸收峰，进一步确认该基团的存在。然后解析第二区的吸收峰，进一步确认该基团的存在。然后解析第二强峰及其相关峰。强峰及其相关峰。 确定分子
21、中各个基团或化学键所连接的原子或原子确定分子中各个基团或化学键所连接的原子或原子团，以及与其他基团的结合方式，并结合相对分子质团，以及与其他基团的结合方式，并结合相对分子质量、不饱和度以及其他仪器分析结果等有关资料，推量、不饱和度以及其他仪器分析结果等有关资料，推测分子的结构。测分子的结构。与标准谱图进行对照与标准谱图进行对照 在相同的实验条件下操作，将得到的红外光谱图在相同的实验条件下操作，将得到的红外光谱图与标准谱图进行比较，若两张谱图吸收峰的位置和形与标准谱图进行比较，若两张谱图吸收峰的位置和形状完全相同，峰的相对强度一样，可以认为样品与该状完全相同，峰的相对强度一样，可以认为样品与该种
22、已知物是同一物质。种已知物是同一物质。例例 某未知物分子式为某未知物分子式为C8H8O，其，其IR谱如图所示，试谱如图所示，试推测未知物的分子结构。推测未知物的分子结构。解：解：(1)根据分子式计算不饱和度：根据分子式计算不饱和度： 1+8+(0-8)/25苯环及CH3的CH伸缩振动苯环的骨架振动单取代苯C=O的伸缩振动。因分子式中只有一个氧原子，不可能是酸或酯，只可能是酮，而且分子中有苯环，很可能是芳香酮。CH3的CH对称弯曲振动s(CH)CH3的CH反对称弯曲振动as(CH)(2)图谱解析图谱解析综上所述，该化合物中有一个单取代的苯环、一个羰综上所述，该化合物中有一个单取代的苯环、一个羰基
23、基(估计是芳香酮羰基估计是芳香酮羰基)、一个甲基，根据分子式，推、一个甲基，根据分子式，推测未知物的结构式可能是测未知物的结构式可能是:OCCH3总结：总结：OCCHCH3：CH3000cm-1 、1600cm-11500cm-1苯环的骨架振动、指纹区苯环的骨架振动、指纹区760cm-1，692cm-1单取代苯单取代苯 1681cm-1强峰为强峰为C=O的伸缩振动的伸缩振动 1363cm-1 CH3的CH1430cm-1CH3的CH 定量分析定量分析 红外光谱定量分析是通过对特征吸收谱带红外光谱定量分析是通过对特征吸收谱带强度的测量来求出组份含量强度的测量来求出组份含量。其理论依据是朗其理论依
24、据是朗伯伯-比耳定律。比耳定律。 由于红外光谱的谱带较多，选择的余地大，由于红外光谱的谱带较多，选择的余地大，所以能方便地对单一组份和多组份进行定量分所以能方便地对单一组份和多组份进行定量分析。析。 此外，该法不受样品状态的限制，能定量此外，该法不受样品状态的限制，能定量测定气体、液体和固体样品。因此，红外光谱测定气体、液体和固体样品。因此，红外光谱定量分析应用广泛。但红外光谱法定量灵敏度定量分析应用广泛。但红外光谱法定量灵敏度较低，尚不适用于微量组份的测定。较低，尚不适用于微量组份的测定。v红外光谱仪红外光谱仪色散型色散型IR谱仪：利用单色器作为色散元件谱仪：利用单色器作为色散元件傅立叶傅立
25、叶IR谱仪：利用光的干涉作用进行测定，没谱仪：利用光的干涉作用进行测定，没有色散元件有色散元件第二节第二节 色谱法色谱法一、色谱法概述一、色谱法概述二、薄层色谱法二、薄层色谱法三、气相色谱法三、气相色谱法四、高效液相色谱法四、高效液相色谱法一、色谱法概述一、色谱法概述 色谱法的来源色谱法的来源 色谱法色谱法(chromatography)早在早在1903年由俄国植物学年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙碳酸钙的直立玻璃管的直立玻璃管内，然后加入内，然后加入
26、石油醚石油醚使其自由流下，结果色素中各组分使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种互相分离形成各种不同颜色的谱带不同颜色的谱带。他称之为。他称之为色谱色谱。这。这种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离应用于无色物质的分离色谱分离过程色谱分离过程 色谱分离的原理色谱分离的原理 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强构上的差异，与固定
27、相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 色谱法分类色谱法分类 二、薄层色谱法二、薄层色谱法(TLC)(thin layer chromatography) TLC
28、的概念、分类、特点的概念、分类、特点 概念：概念： TLCTLC法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。定。 分类：分类： 吸附薄层色谱吸附薄层色谱：固定相为吸附剂，适于异构体的分离：固定相为吸附剂，适于异构体的分离 原理原理：产生差速迁移而得到分离：产生差速迁移而得到分离 分配薄层色谱
29、分配薄层色谱：固定相为液体，适于同系物的分离：固定相为液体，适于同系物的分离 原理原理：利用样品中各组分在固定相与流动相之间的分：利用样品中各组分在固定相与流动相之间的分配系数差别而实现分离配系数差别而实现分离 胶束薄层色谱胶束薄层色谱：以表面活性剂胶束溶液为展开剂的薄：以表面活性剂胶束溶液为展开剂的薄层色谱层色谱 原理原理：被分离组分在水、胶束和固定相三者之间形成：被分离组分在水、胶束和固定相三者之间形成分配平衡分配平衡特点特点 方法简便易行，容易掌握；方法简便易行，容易掌握； 不需考虑杂质的污染问题，对样品净化程度的要求低；不需考虑杂质的污染问题，对样品净化程度的要求低； 在一块薄层板上可
30、以同时展开多个样品，分析时间短；在一块薄层板上可以同时展开多个样品，分析时间短； 展开后的薄层可以用不同的扫描条件反复扫描比较，只展开后的薄层可以用不同的扫描条件反复扫描比较，只 要所测的斑点稳定，还可存放到需要时再测定；要所测的斑点稳定，还可存放到需要时再测定； 可选用各种不同显色剂喷雾显色，有助于定性鉴别。可选用各种不同显色剂喷雾显色，有助于定性鉴别。 载板：载板： 具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度均匀，价格合理，常用为玻璃板。平整、厚度均匀，价格合理，常用为玻璃板。 玻璃板的常用规格：玻璃板的常用规格：520cm、1020
31、cm、2020cm，要求光滑、平整、洗净后不附水珠、干，要求光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥。燥。TLC的基本材料的基本材料 固定相或载体：固定相或载体： 硅胶：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带酸性硅胶：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带酸性 氧化铝：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带碱氧化铝：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带碱性性 硅藻土：中性吸附剂硅藻土：中性吸附剂 纤维素：液纤维素：液-液分配色谱担体（水为固定液），具一液分配色谱担体（水为固定液），具一定粘性定粘性 聚酰胺：特殊有机薄层材料聚酰胺：特殊有机薄层材料硅胶硅胶G(含粘合剂煅石膏含粘合剂煅石膏)，GF254(含含2
32、54nm荧光剂荧光剂)，硅，硅胶胶 H ( 不 含 粘 合 剂不 含 粘 合 剂 ) ， 硅 胶， 硅 胶HF254 点样器：点样器： 常用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器。常用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器。 展开容器：展开容器：上行展开可用适合薄层板大小的专用平底或双槽上行展开可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭；展开缸，展开时须能密闭；水平展开用专用的水平展开缸。水平展开用专用的水平展开缸。 显色装置：显色装置： 喷雾显色用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器；喷雾显色用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器； 浸渍显色用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；浸渍显色用专用玻璃器械或用适
33、宜的展开缸代用； 蒸气熏蒸显色用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。蒸气熏蒸显色用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。 检视装置：检视装置： 为装有可见光、为装有可见光、254nm及及365nm紫外光源及相应的滤紫外光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。TLC的基本操作的基本操作 除另有规定外，将除另有规定外，将1份固定相和份固定相和3份水（或加有黏合份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动
34、涂布器进行涂布（厚度为动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110烘烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。损及污染。制备制备 点样：点样： 一般为圆点状或窄细的条带状，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边点样基线距底边1015mm，圆点，圆点状直径一般不大于状直径一
35、般不大于3mm，条带状宽，条带状宽度一般为度一般为510mm；点间距一般不；点间距一般不少于少于8mm。 展开：展开： 准备：准备：在展开缸中加入适量的展开剂，密闭保持在展开缸中加入适量的展开剂，密闭保持1530分钟。分钟。 展开方式：展开方式：上行、下行、近水平、双向展开等，多采上行、下行、近水平、双向展开等，多采用上行展开。用上行展开。 （b）直立式展开1色谱缸 2薄层板 3展开剂 4展开剂蒸气（a）倾斜上行法展开1色谱缸 2薄层板 3展开展开：展开：将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。一般展
36、开为宜，密闭。一般展开815cm。溶剂前沿达到规定。溶剂前沿达到规定 展距，取出薄层板，晾干，待检测。展距，取出薄层板，晾干，待检测。 显色与检视：显色与检视： 对对有色有色物质，展开后可直接检视；物质，展开后可直接检视； 对对无色无色物质可在紫外灯物质可在紫外灯(254nm或或365nm)下，观察有下，观察有无暗斑或荧光斑点，记录其颜色、位置及强弱。适用于有无暗斑或荧光斑点，记录其颜色、位置及强弱。适用于有荧光的物质或少数有紫外吸收的物质；荧光的物质或少数有紫外吸收的物质； 荧光荧光薄层板薄层板(如硅胶如硅胶GF254板板)检测，在检测，在254nm紫外光灯下观察荧光板上的荧光紫外光灯下观察
37、荧光板上的荧光淬灭物质形成的色谱；淬灭物质形成的色谱； 既无色，又无紫外吸收的物质可用喷既无色，又无紫外吸收的物质可用喷雾法或浸渍法以适宜的雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色剂显色，或显色，或加热显色，在日光下检视。加热显色，在日光下检视。 v定性鉴别：利用定性鉴别：利用Rf值进行定性鉴别值进行定性鉴别v定量分析定量分析TLC的应用的应用 原点到组分斑点质量中心的距离原点到组分斑点质量中心的距离Rf值值 = 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离三、气相色谱法三、气相色谱法(GC) (gas chromatography ) GC的概念、分类、特点及应用对象的概念、分类、特点及应用对象 分类分类
38、 气相色谱气相色谱 气液分配色谱气液分配色谱 填充柱气相色谱填充柱气相色谱 毛细管柱气相色谱毛细管柱气相色谱 概念概念 GC法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。色谱柱进行分离测定的色谱方法。特点特点 应用范围广应用范围广 应用对象应用对象 具有挥发性或在一定温度下能够汽化的物质具有挥发性或在一定温度下能够汽化的物质 不挥发或热不稳定的物质可衍生化后分析不挥发或热不稳定的物质可衍生化后分析 某些大分子物质和高聚物可用裂解色谱法分析某些大分子物质和高聚物可用裂解色谱法分析 分离效率高，分析速度快分离效率高，分析速度快
39、 样品用量少，样品用量少， 灵敏度高灵敏度高选择性好选择性好 气相色谱仪气相色谱仪国产气相色谱仪国产气相色谱仪气相色谱仪的构成气相色谱仪的构成 气路系统进样系统分离系统检测系统温控系统气路系统气路系统作用作用：获得纯净、流速稳定的载气。包括气源、压力获得纯净、流速稳定的载气。包括气源、压力计、流量计及气体净化装置等。计、流量计及气体净化装置等。 常用的载气常用的载气：H2、He、N2、Ar 载气的要求：载气的要求：化学惰性，不与有关物质反应。载气的化学惰性，不与有关物质反应。载气的选择除了要求考虑对柱效的影响外，还要与分析对象选择除了要求考虑对柱效的影响外，还要与分析对象和所用的检测器相匹配。
40、和所用的检测器相匹配。 载气的来源：载气的来源： 气体钢瓶和减压阀：压力表多为两级压力指示气体钢瓶和减压阀：压力表多为两级压力指示 气体发生器：氮气、氢气、空气及一体机气体发生器：氮气、氢气、空气及一体机 进样系统进样系统构成：构成：进样器、进样口、气化室等进样器、进样口、气化室等 要求：要求： 进样量或体积要适宜、准确；进样量或体积要适宜、准确； 采用常规色谱柱分离，进样体积几至几十微升；采用常规色谱柱分离，进样体积几至几十微升； 对毛细管柱分离，体积约为对毛细管柱分离，体积约为10-210-3L； 体积过大或进样过慢，将导致分离变差（拖尾）；体积过大或进样过慢，将导致分离变差（拖尾）； 进
41、样针最大容量与进样量要匹配。进样针最大容量与进样量要匹配。 汽化室要求：体积小；热容量大；对样品无催化作用汽化室要求：体积小；热容量大；对样品无催化作用包括：填充柱和毛细管柱（或开管柱）包括：填充柱和毛细管柱（或开管柱） 分离系统分离系统 填充柱：填充柱：多为多为U形或螺旋形；内径形或螺旋形；内径26mm；长长13m；内填固定相。；内填固定相。毛细管柱：毛细管柱：分为涂壁、多孔层和涂载体开分为涂壁、多孔层和涂载体开管柱，内径管柱，内径0.10.5mm，长达几十至，长达几十至100m，通常弯成直径通常弯成直径1030cm的螺旋状；其特点的螺旋状；其特点为渗透性好、传质快，分离效率高（为渗透性好、
42、传质快，分离效率高（n可达可达106）、分析速度快、样品量小。）、分析速度快、样品量小。 作用对象：作用对象：气化室、柱箱、检测器气化室、柱箱、检测器 控温方式：控温方式：恒温和程序升温恒温和程序升温 温控系统温控系统 作用作用：将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于纪录的电信号，然后对被分的信息转变为便于纪录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量。离物质的组成和含量进行鉴定和测量。常用的检测器：常用的检测器：氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(Flame ionized detector，FID)热导检测器热导检测器(Therma
43、l conductivity detector，TCD)电子捕获检测器电子捕获检测器(Electron capture detector ，ECD)质谱检测器质谱检测器(MSD)即即气相气相质谱联用仪质谱联用仪(GC-MS)检测系统检测系统 主要用于可在主要用于可在H2-Air火焰中燃火焰中燃烧的有机化合物（如烃类物烧的有机化合物（如烃类物质）的检测。质）的检测。通用型检测器通用型检测器主要对含有较大电负性原子的主要对含有较大电负性原子的化合物响应。它特别适合于环化合物响应。它特别适合于环境样品中卤代农药和多氯联苯境样品中卤代农药和多氯联苯等微量污染物的分析。等微量污染物的分析。质谱是唯一可以
44、给出分子量质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法确定分子式的方法, 而分子式而分子式的确定对化合物的结构鉴定的确定对化合物的结构鉴定 是至关重要的是至关重要的四、高效液相液相色谱法四、高效液相液相色谱法(HPLC) (high performance liquid chromatography ) HPLC的概念、分类、特点及应用的概念、分类、特点及应用HPLC系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。 根据分离机制不同，分为根据分离机制不同，分为液固吸附液固吸附色谱、色谱、液液
45、分配液液分配色色谱、谱、化学键合化学键合色谱、色谱、离子交换离子交换色谱、色谱、分分 子排阻子排阻色谱等色谱等概念概念分类分类利用保留值作为定性参数；利用保留值作为定性参数；利用在样品中加入对照品，通过峰值增高来确认；利用在样品中加入对照品，通过峰值增高来确认；利用利用LC-MS联用仪，通过被分离物的质谱图与谱联用仪，通过被分离物的质谱图与谱库的谱图对比来定性；库的谱图对比来定性；利用二极管阵列检测器给出利用二极管阵列检测器给出UV光谱与对照品相比光谱与对照品相比较，结合保留时间来确认。较，结合保留时间来确认。应用应用 高速、高效、高灵敏度、应用广泛（高速、高效、高灵敏度、应用广泛（GC分析只
46、占分析只占有机有机 物的物的20%，HPLC分析可占分析可占80%） 特点特点高效液相色谱仪高效液相色谱仪输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统 其其工作过程工作过程如下：首先高如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲控制器的出口流出。当注入欲分离样品分离样品时，流经进样器贮液时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来
47、，由此器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。得到液相色谱图。 输液系统输液系统 高压输液泵：压力：高压输液泵：压力：15015035035010105 5 Pa Pa为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。六通阀进样六通阀进样进样系统进样系统 分离系统分离系统 分离系统的主要元件是色谱柱，它是色谱分分离系统的
48、主要元件是色谱柱，它是色谱分离过程中存放固定相的场所离过程中存放固定相的场所 。常用检测器：常用检测器：紫外紫外-可见检测器可见检测器(Ultraviolet and Visible Detector, UVD)荧光检测器荧光检测器(Fluorescence Detector, DFD)折光指数检测器折光指数检测器(Refractive Index Detector, RID) 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)质谱检测器质谱检测器(Mass Detector, MSD)检测系统检测系统 应用最广，对大部分
49、有机化应用最广，对大部分有机化合物有响应合物有响应主要用于氨基酸、多环芳烃主要用于氨基酸、多环芳烃等生物制品及环境监测及等生物制品及环境监测及体内药物分析体内药物分析适合于无紫外吸收、无电活适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测性和不发荧光的样品的检测通用型检测器通用型检测器 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10mdp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇， 约约1ml/min 1ml/min 柱温的选择：选室温柱温的选择：选室温25250 0C C左右左右
