1、第六章 食品中微生物快速检验技术 第六章 食品中微生物快速检验技术学习目标学习目标 第六章 食品中微生物快速检验技术概概 述述1 1、食品中微生物检测的优点和发展趋势、食品中微生物检测的优点和发展趋势 检测食源细菌的传统方法通常依赖于其在培养基里的生长检测食源细菌的传统方法通常依赖于其在培养基里的生长, ,即进行目标菌的分离和生化鉴定即进行目标菌的分离和生化鉴定, ,有时进行血清学诊断繁琐、有时进行血清学诊断繁琐、耗时。耗时。 随着分子生物学和电子技术的飞速发展随着分子生物学和电子技术的飞速发展, ,快速、准确、特异快速、准确、特异检微生物的新技术、新方法不断涌现检微生物的新技术、新方法不断涌
2、现, ,微生物检验技术由培养微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进水平向分子水平迈进, ,并向仪器化、动化、标准化方向发展并向仪器化、动化、标准化方向发展, ,可可大大提高食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性大大提高食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。 第六章 食品中微生物快速检验技术概概 述述2 2、食品中微生物检测的局限性、食品中微生物检测的局限性 大部分快速方法适用于检测特定微生物，用于快速筛选大大部分快速方法适用于检测特定微生物，用于快速筛选大量食品中所存在的特殊病原体。量食品中所存在的特殊病原体。 然而，快速检方法抗干扰能力弱，所得结果必须用标准参然而，快速检方法抗干扰
3、能力弱，所得结果必须用标准参考方法予以证实。考方法予以证实。 因此因此, ,随着某些快速方法更加频繁地被使用随着某些快速方法更加频繁地被使用, ,其优点和局限其优点和局限性同时变得更加明显，使用在选择和彻底评估这些快速检测方性同时变得更加明显，使用在选择和彻底评估这些快速检测方法时，必须综合考虑各方面因素，在工作效率和可靠性上找到法时，必须综合考虑各方面因素，在工作效率和可靠性上找到一个平衡点。一个平衡点。 第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术一、什么是一、什么是3M测试片？测试片？ 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M
4、3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术二、二、3M测试片的优点测试片的优点 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术1. 工作效率的极大提高工作效率的极大提高 根据大量数据统计，使用根据大量数据统计，使用 3M Petrifilm， 可以提高实验室工作效可以提高实验室工作效率率 118% 以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最终的以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最终的效果就是效益的增加。效果就是效益的增加。 2. 标准化的检测方法标准化的检测方法 品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使用不品质稳定的快速测试片
5、克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。 3. 国际化的认证方法国际化的认证方法 3M 快速测试的方法得到包括快速测试的方法得到包括 AOAC，AFNOR 在内的国际权威机构在内的国际权威机构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。二、二、3M测试片的优点测试片的优点 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M
6、3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术4. 快速得到检测结果快速得到检测结果 对比传统的测试方法，对比传统的测试方法， 3M快速测试片缩短检测时间，使快速测试片缩短检测时间，使您在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有您在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题。效的措施解决发现的问题。 5. 方便进行方便进行HACCP 认证认证 由于检测速度快，检测项目全，准确性高。由于检测速度快，检测项目全，准确性高。3M为食品生为食品生产工艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，产工艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，可以对包括生产线
7、，生产设备和环境在内的各个环节进行全面可以对包括生产线，生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测试。的测试。 三、三、3M测试片的操作过程（肠杆菌科为例）测试片的操作过程（肠杆菌科为例） 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术三、三、3M测试片的操作过程（肠杆菌科为例）测试片的操作过程（肠杆菌科为例） 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3
8、M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测
9、试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术四、四、3M测试片的结果判读图例测试片的结果判读图例 第六章 食品中微生物快速检验技术第一节第一节 3M3M测试片快速分析技术测试片快速分析技术 第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节第二节 Mi
10、ni-VIDASMini-VIDAS快速分析测试技术快速分析测试技术一、一、 Mini-VIDAS快速分析技术快速分析技术简介简介 第六章 食品中微生物快速检验技术第二节第二节 Mini-VIDASMini-VIDAS快速分析测试技术快速分析测试技术二、二、 Mini-VIDAS快速分析技术快速分析技术原理原理 第六章 食品中微生物快速检验技术第二节第二节 Mini-VIDASMini-VIDAS快速分析测试技术快速分析测试技术1、在固相包被抗体，捕获目标菌。2、二抗酶结合物结合目标菌，催 化底物产生荧光。1、在固相包被抗体，捕获目标菌酶结合物。2、目标菌抑制抗体和酶结合物结合，抑 制催化底物
11、产生荧光。三、三、 Mini-VIDAS快速分析技术快速分析技术优势优势 第六章 食品中微生物快速检验技术第二节第二节 Mini-VIDASMini-VIDAS快速分析测试技术快速分析测试技术三、三、 Mini-VIDAS快速分析技术快速分析技术优势优势 第六章 食品中微生物快速检验技术第二节第二节 Mini-VIDASMini-VIDAS快速分析测试技术快速分析测试技术 第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第三节第三节 利用电导率利用电导率快速分析测试技术快速分析测试技术一、一、 电导率电导率快速快速检测微生物检测微生物技术技术原理原理 第六章 食品中微生物快速检验技术第三节第三节 利用电
12、导率利用电导率快速分析测试技术快速分析测试技术 微生物在生长过程中利用低电导率的大分子物质微生物在生长过程中利用低电导率的大分子物质(如蛋白如蛋白质，多肽及碳水化合物等质，多肽及碳水化合物等)进行新陈代谢，生成低分子带电荷进行新陈代谢，生成低分子带电荷的分解物，使电导率发生变化。的分解物，使电导率发生变化。 电信号经放大后显示并记录，检测系统每电信号经放大后显示并记录，检测系统每10分钟检测一分钟检测一次电导率的变化，由计算机实时次电导率的变化，由计算机实时监控并自动给出结果。监控并自动给出结果。 因此只要先用标准方法对比因此只要先用标准方法对比做出标准曲线，就可以达到快速做出标准曲线，就可以
13、达到快速定量检测菌数的目的。定量检测菌数的目的。 一、一、 电导率电导率快速快速检测微生物检测微生物技术技术原理原理 第六章 食品中微生物快速检验技术第三节第三节 利用电导率利用电导率快速分析测试技术快速分析测试技术 样品中微生物数量越多，越快进入对数生长期。培养基电导率样品中微生物数量越多，越快进入对数生长期。培养基电导率发生跃迁的时间越短。发生跃迁的时间越短。二、二、 电导率电导率快速快速检测微生物检测微生物技术技术特点特点 第六章 食品中微生物快速检验技术第三节第三节 利用电导率利用电导率快速分析测试技术快速分析测试技术 1. 采用测量培养基电导采用测量培养基电导(M值值)和电极电导和电
14、极电导(E值值)结合的结合的方法，测量相对电导率变化，使灵敏度大大提高，方法，测量相对电导率变化，使灵敏度大大提高，E值测值测量法尤其适用于一些高盐分量法尤其适用于一些高盐分(高电导率高电导率)的选择性增菌培养的选择性增菌培养基，使电导率法用于致病菌快速初筛成为可能。基，使电导率法用于致病菌快速初筛成为可能。 2. 对难以测量电导变化的微对难以测量电导变化的微生物，采用测间接电导率的方法生物，采用测间接电导率的方法，通过测量，通过测量KOH吸收微生物代谢吸收微生物代谢产生产生CO2后电导率的变化反映微后电导率的变化反映微生物的生长情况。生物的生长情况。三、三、 电导率电导率快速快速检测微生物检
15、测微生物技术技术优势优势 第六章 食品中微生物快速检验技术第三节第三节 利用电导率利用电导率快速分析测试技术快速分析测试技术 1. 灵敏度高。最低可检测出灵敏度高。最低可检测出0.2-1个个/mL(克克)样品。样品。 2. 可检测样品种类广，检测的微生物项目多。可检测样品种类广，检测的微生物项目多。 3. 检测速度快。大部分项目检测速度快。大部分项目24小时内出结果，样品含菌小时内出结果，样品含菌量越高，出结果越快，只需数小时即给出结果。量越高，出结果越快，只需数小时即给出结果。 4. 检测步骤简单。厂家提供特殊配方的培养基，只需将检测步骤简单。厂家提供特殊配方的培养基，只需将样品加入培养基中
16、，放入仪器，然后启动程序即可自动出样品加入培养基中，放入仪器，然后启动程序即可自动出结果。对于液体样品无需复杂前处理，固体样品只需进行结果。对于液体样品无需复杂前处理，固体样品只需进行必要的均质和稀释即可。必要的均质和稀释即可。 一、一、 膜过滤荧光染色法原理膜过滤荧光染色法原理 第六章 食品中微生物快速检验技术第四节第四节 膜过滤荧光染色法膜过滤荧光染色法二、二、 膜过滤荧光染色法步骤膜过滤荧光染色法步骤 第六章 食品中微生物快速检验技术第四节第四节 膜过滤荧光染色法膜过滤荧光染色法三、三、 膜过滤荧光染色法仪器膜过滤荧光染色法仪器 第六章 食品中微生物快速检验技术第四节第四节 膜过滤荧光染
17、色法膜过滤荧光染色法一、利用葡萄糖醛酸酶定量检测一、利用葡萄糖醛酸酶定量检测E. Coli 大肠杆菌重要卫生学指标，是环境监测、食品安全、卫生防大肠杆菌重要卫生学指标，是环境监测、食品安全、卫生防疫监测中必检的一个项目。传统的大肠菌群检测法试验过程繁疫监测中必检的一个项目。传统的大肠菌群检测法试验过程繁杂、检测工作量大、费用较高，而且不适合进行大肠杆菌定量杂、检测工作量大、费用较高，而且不适合进行大肠杆菌定量检测。检测。 绝大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸绝大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶，能分解葡萄醛酸苷。使无色原性酶，能分解葡萄醛酸苷。使无色原性-底物（底物（4甲基伞花内脂甲基伞花内脂-D葡萄糖
18、苷酸）葡萄糖苷酸）生成甲基伞形酮葡萄糖苷酸，在生成甲基伞形酮葡萄糖苷酸，在365nm紫外灯下观察出现蓝亮色荧光，可以实紫外灯下观察出现蓝亮色荧光，可以实现定量检测。现定量检测。 第六章 食品中微生物快速检验技术第五节第五节 利用酶促反应定量检测微生物利用酶促反应定量检测微生物二、二、 ATP荧光法检测总菌落数荧光法检测总菌落数 第六章 食品中微生物快速检验技术第五节第五节 利用酶促反应定量检测微生物利用酶促反应定量检测微生物 萤火虫会发光是由于它能合成萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂生物催化剂荧光素酶、虫荧光素荧光素酶、虫荧光素(
19、D-luciferin)以及所有细胞生物以及所有细胞生物都产生的生物能量物质都产生的生物能量物质三磷酸腺苷（三磷酸腺苷（ATP）。）。 在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：二、二、 ATP荧光法检测总菌落数荧光法检测总菌落数 第六章 食品中微生物快速检验技术第五节第五节 利用酶促反应定量检测微生物利用酶促反应定量检测微生物 上式表明，只要具备适当条件，不仅萤火虫，即使在试管中上式表明，只要具备适当条件，不仅萤火虫，即使在试管中
20、也能发出荧光。当反应系统中，虫光素酶和虫荧光素处于过量也能发出荧光。当反应系统中，虫光素酶和虫荧光素处于过量的情况下，荧光的强弱取决于的情况下，荧光的强弱取决于ATPATP的数量。的数量。 在食品样品中，细菌细胞越多，在食品样品中，细菌细胞越多，ATPATP量越高，发出的荧光也量越高，发出的荧光也就越强。就越强。 所以，在排除样品中非细菌所以，在排除样品中非细菌ATPATP干扰的情况下，通过荧光值干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌就能确定样品中细菌ATPATP的含量，从而确定细胞数量。的含量，从而确定细胞数量。ATP+ O +Luciferin+Luciferase =2O xyluc
21、iferin+AM P+ PPi+ CO2检测原理荧光素荧光素酶腺苷一磷酸氧合荧光素荧光三、三、 MTT法检测总菌落数法检测总菌落数 第六章 食品中微生物快速检验技术第五节第五节 利用酶促反应定量检测微生物利用酶促反应定量检测微生物 检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 Formazan结晶形成的量与活菌数成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活菌细胞数量。 该方法的特点是检测灵敏度高、快速。在肿瘤细胞杀伤药物筛选中应用广泛，在食品卫
22、生监测中也有应用的报道。三、三、 MTT法检测总菌落数法检测总菌落数 第六章 食品中微生物快速检验技术第五节第五节 利用酶促反应定量检测微生物利用酶促反应定量检测微生物应用实例1：巴氏消毒奶中活菌素快速检测 取巴斯消毒奶10mL ，至于无菌离心管中3000rpm离心5分钟，弃去上清。加入10mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次3000 rpm离心5分钟，弃去上清取出奶液基质。加入1mL生理盐水重悬底部的微生物，取0.2mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌液做标准曲线，统一加入底物反应30分钟，读数。一、一、 血清学方法血清学方法 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微
23、生物利用免疫反应快速检测微生物图图示示几几种种操操作作类类型型的的原原理理一、一、 血清学方法血清学方法(基本原理回顾第基本原理回顾第3章章) 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物实例实例1：化脓性链球菌的免疫聚集快速检测：化脓性链球菌的免疫聚集快速检测菌体菌体凝集试验凝集试验免疫散射比浊法免疫散射比浊法二、二、 酶联免疫吸附检测方法酶联免疫吸附检测方法 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用
24、相结合的一种敏感性很高的实验技术。 分点理解分点理解: 1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 2. 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性； 3. 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。 在ELISA测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。实例：双抗体夹心实例：双抗体夹心ELISA法检测霍乱弧菌法检
25、测霍乱弧菌 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原抗原/ /抗体。抗体。最常用的是双抗夹心法检测抗原最常用的是双抗夹心法检测抗原三、三、 免疫胶体金层析快速检测方法免疫胶体金层析快速检测方法 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物胶体金原理示意图（检测单增李斯特菌为例）胶体金原理示意图
26、（检测单增李斯特菌为例）检测线检测线质检线质检线吸收垫吸收垫样品垫样品垫硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜连接垫连接垫（胶体金垫）（胶体金垫）背衬背衬（底板）（底板）p病毒性疾病：病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。、犬细小病毒、猪瘟等。p寄生虫疾病：寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙虫病。虫病。p细菌性疾病：细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽等霍乱弧菌、类鼻疽等。胶体金快速诊断技术的应用胶体金快速诊断技术的应用 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物副溶
27、血性弧菌副溶血性弧菌阳性结果阳性结果阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照H5N1流感病流感病毒阳性结果毒阳性结果 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物胶体金快速诊断技术的特点胶体金快速诊断技术的特点 p简捷快速：简捷快速：操作简单，一般只要操作简单，一般只要5-10min 5-10min 就会出结果，就会出结果，而其它方法如而其它方法如ELISAELISA需要需要1-2h1-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。p结果易于判定：结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。p特异性好：特
28、异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。了它具有很好的特异性。 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物胶体金快速诊断技术的特点胶体金快速诊断技术的特点 p简捷快速：简捷快速：操作简单，一般只要操作简单，一般只要5-10min 5-10min 就会出结果，就会出结果，而其它方法如而其它方法如ELISAELISA需要需要1-2h1-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。p结果易于判定：结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。p特异性好：特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。了它具有很好的特异性。 第六章 食品中微生物快速检验技术第六节第六节 利用免疫反应快速检测微生物利用免疫反应快速检测微生物谢谢 谢！谢！ 第六章 食品中微生物快速检验技术下节课，学习病毒检测和动物检疫技术。下节课，学习病毒检测和动物检疫技术。
