1、1发酵过程优化与控制技术研究发酵过程优化与控制技术研究堵国成堵国成江南大学江南大学2生物质原料化学品化学品精细化学品精细化学品大宗化学品大宗化学品食品添加剂食品添加剂生物塑料生物塑料溶剂溶剂酚类酚类粘合剂粘合剂脂肪酸脂肪酸碳黑、颜料碳黑、颜料燃料、香料、墨水燃料、香料、墨水洗涤剂洗涤剂生物能源生物能源生物酒精生物酒精生物柴油生物柴油甲醇甲醇氢气氢气沼气沼气工业生物技术主要部分工业生物技术主要部分-发酵工程发酵工程3获得应用价值的微生物反应器及过程放大发酵过程优化和控制发酵工程研究发酵工程研究发酵产物分离提取4发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义微生物能够积累最大目的产物微生
2、物能够积累最大目的产物(产量产量)的的条件条件是什么？是什么？ 高产量高产量 便于产品分离便于产品分离提取提取关键问题关键问题1工程意义工程意义1相关研究：微生物生理、遗传特性和营养、环境因素5底物最多被微生物转化为产物底物最多被微生物转化为产物(转化率转化率)的的条件条件是什么？是什么？粮食原料为底物粮食原料为底物 高转化率高转化率 降低原料成本降低原料成本关键问题关键问题2工程意义工程意义2相关研究：微生物代谢途径和过程条件发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义6微生物最快速度发酵生产目的微生物最快速度发酵生产目的产物的产物的条件条件是什么？是什么？分批操作为主分批操作为
3、主 高生产强度高生产强度 缩短生产周期缩短生产周期工程意义工程意义3关键问题关键问题3相关：微生物反应动力学和系统优化发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义7条件确定过程优化初始条件过程分析过程强化发酵优化的研究思想：发酵是一个过程发酵优化的研究思想：发酵是一个过程8基于细胞表观特性进行优化基于细胞表观特性进行优化0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t /
4、 h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于细胞内部分析进行优化基于细胞内部分析进行优化高产量高产量高底高底物转物转化率化率高生高生产强产强度度优化策略优化策略在理论和技术上有突破，在工业生产中能广泛应用在理论和技术上有突破，在工业生产中能广泛应用显著提高发酵过程的经济性和科学性研究方法研究方法91 1 优化优化微生物生长的物理和化学环境微生物生长的物理和化学环境保证保证微生物生长处于最适条件微生物生长处于最适条件基本思想奠定基础基于基于底物运输、生化反应、产物排出底物运输、生化反应、产物排出确定确定不同环境条件对微生物生长不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响和代谢产物分布
5、的影响Prod. Distribution发酵优化技术10培养基组成的优化技术发酵环境条件的优化技术 确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足减少副产物的形成，使底物转化率明显提高减少副产物的形成，使底物转化率明显提高对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产量明显提高产量明显提高分析不同环境条件下微生物的生理学分析不同环境条件下微生物的生理学目的 内容112 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术基于微生物代谢特性的分阶段培养技术控制环境条件在最适合细胞生长或最适控制环境条件在最适合细胞生
6、长或最适合产物合成的水平合产物合成的水平目目的的分分析析不同不同T、pH、RPM、DO发酵过程的动力学参数发酵过程的动力学参数(，qp，qs)流变学参数的变化特性流变学参数的变化特性分阶段控制策略分阶段控制策略提提出出分阶段分阶段T、pH、RPM、DO发酵优化技术123 基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术建立动力学模型，求解参建立动力学模型，求解参数并评价其适用性数并评价其适用性对发酵进程和产量对发酵进程和产量指标进行预测指标进行预测ModelFormMonod Constant yieldu = umax s/(K m + s) Y x/s =
7、Y0Substrate inhibition Constant yieldu = umax s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0Substrate inhibition Variable yieldu = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition InhibitionsConstants yieldsu = umax s/(Km + s + s2/Ki) u = umax o (1 - P/P m
8、 )q p = alpha. u+ betaalpha, beta and Y p/s以数学模型为基础的优化优化发酵过程优化发酵过程发酵优化技术13 以生理模型为基础的优化以生理模型为基础的优化采用人工神经网络、专家系采用人工神经网络、专家系统、模糊逻辑控制技术统、模糊逻辑控制技术对发酵过程对发酵过程进行在线状进行在线状态预测和模态预测和模式识别式识别自适应最优自适应最优化控制系统化控制系统的开发、计的开发、计算机模拟和算机模拟和实际应用实际应用144 参参考考已知的生化反应计量关系、已知的生化反应计量关系、代谢途径、生理、特征，代谢途径、生理、特征，构建构建、合成不同产物的合成不同产物的代谢
9、网络代谢网络。利用利用代谢通量分析方法，代谢通量分析方法，计算计算得得出胞内出胞内各条代谢途径的通量变化各条代谢途径的通量变化。发酵优化技术15分析分析不同发酵产品合成途径中不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质主要代谢节点的性质，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出提出一系列发酵一系列发酵优化策略优化策略。 16长期胁迫可遗传性的应答长期胁迫可遗传性的应答（遗传变异）（遗传变异）短期胁迫不可遗传性的应答短期胁迫不可遗传性的应答（生理性的（生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondri
10、onATP环境压力或胁迫环境压力或胁迫 饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的激活以及代谢途径的临时调整等激活以及代谢途径的临时调整等5 基于基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程环境胁迫条件下微生物生理应答的过程优化技术优化技术发酵优化技术17研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋
11、白转录和代机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代谢途径变化，谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物采用不同环境胁迫手段或措施对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成目的产物。目的产物。 学术思想学术思想18学术思想学术思想6 基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术CofactorsMetal ionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins 研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制研究辅因子形式及其浓
12、度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，对微生物的生长或代谢进行调控，律，对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物合成目的产物促进微生物合成目的产物的代谢流的最大化和快速化。的代谢流的最大化和快速化。 发酵优化技术19发酵过程优化与控制技术研究举例发酵过程优化与控制技术研究举例20举例举例1：丙酮酸发酵：丙酮酸发酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA -KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1, NA)PDC (B
13、1) PT (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素硫胺素NA： 烟酸烟酸Bio：生物素：生物素B6： 吡哆醛吡哆醛GlucosePyruvate如何得到丙酮酸高产量发酵？如何得到丙酮酸高产量发酵？-菌株选育和培养条件优化菌株选育和培养条件优化XXXX选育自身不能合成维生素的酵母选育自身不能合成维生素的酵母( (维生素缺陷型维生素缺陷型) )控制培养基中维生素浓度控制培养基中维生素浓度21t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp / h 0 0.2
14、 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 动力学分析高高溶氧溶氧下，丙酮酸转下，丙酮酸转化率较高，但生产强化率较高，但生产强度度(葡萄糖消耗速度葡萄糖消耗速度)较较低低低溶氧下，葡萄糖消低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙耗速度加快，然而丙酮酸产率却明显下降酮酸产率却明显下降代谢网络分析PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9DO=10%PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7DO=85%PEP到Pyr的通量增加了20%
15、，丙酮酸进一步代谢的通量下降了63.3%高溶氧下转化率高的原因如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制辅因子分析NADHATP39.0NADHATP39.0NADHATP20.7NADHATP20.7总总ATP下降下降31.4%, NADH下降下降18.6%生产强度(葡萄糖消耗速度)59低溶氧生产强度高的原因DO=10%DO=85%22高产量高产量(89.4 g/L)高产率高产率(0.636 g/g)高生产强度高生产强度(1.95 g/(L h) 确定分阶段供氧模式:发酵0-16 h控制kLa为450 h-1，16 h后将kLa
16、降低至200 h-1碳平衡分析前16 h较高溶氧有利于碳流合成细胞；采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！16 h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸结果 016h 1632h 3248h after 48h kL a / h-1 450 300 200 450 300 200 450 300 200 450 300 200 Glucose1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cell growth2 47 30 27 17 13 16 13 13 11 3
17、 10 11 Pyruvate 44 41 32 80 60 55 83 70 57 82 78 41 Ethanol 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Residual carbon 7 27 39 3 27 29 5 17 32 14 12 48 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?-?-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制！如何分阶段？分阶段溶氧控制！如何分阶段？23举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控我国是世界最大的维生素我国是世界最大的维生素C生产国和出口国，生产国和出口国，2
18、009年生产年生产10万吨万吨左右，产值左右，产值45亿，占世界市场亿，占世界市场90 小菌小菌(氧化葡萄糖氧化葡萄糖杆菌杆菌G. oxydans )大菌大菌(巨大芽孢杆巨大芽孢杆菌菌B. megaterium )关键科学问题：维生素关键科学问题：维生素C C发酵微生物的功能关系发酵微生物的功能关系L-山梨糖山梨糖2-酮基酮基-L-古龙酸古龙酸现况：维生素现况：维生素C两步发酵工艺两步发酵工艺小菌单独培养生长、产酸困难小菌单独培养生长、产酸困难大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸团队承担的国家团队承担的国家863重重点项目和国家支撑项目点项目和国家支撑项目与南开
19、大学功能基因组与南开大学功能基因组学中心、国内最大学中心、国内最大Vc生生产企业合作产企业合作实现组学技术解决发酵实现组学技术解决发酵工业长期问题的典型工业长期问题的典型+24基因组测序步骤鸟枪法测序鸟枪法测序提取基因提取基因组组DNA打断基因打断基因组组DNA基因文基因文库构建库构建大规模大规模测序测序罗氏罗氏GSFLX高通量基因组测序高通量基因组测序 衔接子衔接子连接连接单链单链DNA与与磁珠结合磁珠结合油滴中油滴中PCR反应反应序列拼接序列拼接测序测序反应反应填补缺口填补缺口基因组注释基因组注释代谢途径分析代谢途径分析小菌测序小菌测序大菌测序大菌测序代谢途径分析代谢途径分析代谢途径分析代
20、谢途径分析从代谢从代谢途径角途径角度解析度解析两菌关两菌关系系25氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全柠檬酸循环不完全无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通过糖异生生产，不能通过糖异生生产C6G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和途径和D途径的全部酶基因途径的全部酶基因缺失编码磷酸缺失编码磷酸果糖激酶的基果糖激酶的基因，糖酵解途因，糖酵解途径不完全径不完全26蛋白质组学蛋白质组学小菌单独发酵时小菌单独发酵时胞内蛋白表达胞内蛋白表达大
21、菌存在时小菌大菌存在时小菌胞内蛋白表达胞内蛋白表达功能蛋白确定，功能蛋白确定，研究大菌影响小研究大菌影响小菌产酸的机制菌产酸的机制K. VulgarB. megaterium27发酵发酵优化优化提高糖酸转化率提高糖酸转化率提高提高VC产量产量提高生产强度提高生产强度基因基因测序测序功能功能蛋白蛋白产物产物解析解析3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖TCA循环循环大菌特定的代谢途径大菌特定的代谢途径L-山梨酮山梨酮2-酮基酮基-L-古龙酸古龙酸L-山梨糖山梨糖2-酮基酮基-L-古龙酸生产途径古龙酸生产途径Vc目标目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能：确定微生物之间的功能关系，提
22、高效能目标目标2：构建：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新一步发酵菌株，实现重大创新举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控28举例举例3 3：透明质酸：透明质酸(HA)(HA)发酵过程优化与控制发酵过程优化与控制透明质酸三级结构透明质酸三级结构优良理化性质：粘弹性优良理化性质：粘弹性 高保湿性高保湿性 生物相容性生物相容性 食品添加剂食品添加剂关节炎治疗关节炎治疗化妆美容化妆美容高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈乳酸对细胞生长和乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用合成有着较强的抑制作用细
23、胞生长和细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争HA发发酵存在酵存在问题问题29透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究问题问题高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈溶氧水平溶氧水平表观黏度表观黏度0nK32221.36cofDPN DDr350.001opPNNDr(%)100cafTVT有效搅拌区域模型有效搅拌区域模型051015200200400600Culture time (h)Agitation speed (rpm)051015200100200
24、300400500Culture time (h)Broth viscosity (mPas)051015200204060Culture time (h)KLa (h-1)051015200306090120120Culture time (h)DO level (%)(a)(b)(c)(d)有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学(Va=1）剪切力对菌体形态影响剪切力对菌体形态影响理想理想HAHA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧溶氧水平溶氧水平溶氧传递系数溶氧传递系数表观粘度表观粘度搅拌转速搅拌转速30降解透明质酸提高发酵
25、过程的混合及传质效率降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率问题问题高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈氧化还原降解氧化还原降解HA提高混合与传质效率提高混合与传质效率FT-IR分析结果分析结果过氧化氢过氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解抗坏血酸氧化还原降解HA 氧化还原氧化还原降解降解HA没没有破坏其有破坏其基本结构基本结构单元单元05101520051015Culture time (h)Cell concentration (g/L)05101520020406080Culture time (h)Sucrose concentration
26、(g/L)0510152002468Culture time (h)HA concentration (g/L)051015200204060Culture time (h)Lactic acid concentration (g/L)(a)(b)(c)(d)HA氧化还原降解对氧化还原降解对HA发酵的影响发酵的影响添加添加H2O2/ /抗坏血酸对流体力学影响抗坏血酸对流体力学影响添加H2O2,Vc31Transglutaminase (TGase, Protein glutamine -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 )举例举例4： Transglutamin
27、ase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通过通过 N-(-谷酰胺谷酰胺) 赖氨酸键交联蛋白质赖氨酸键交联蛋白质 催化蛋白质中催化蛋白质中Gln的的-羧酰胺基与伯胺间发羧酰胺基与伯胺间发生转移反应生转移反应 蛋白质脱酰胺作用蛋白质脱酰胺作用 通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长链链-羟基羟基 目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质间形成共价交联的酶制剂间形成共价交联的酶制剂32Activation Mechanism of Transglutami
28、nasePre-Pro-TGaseSecreted from cells folding Pro-TGaseInhibitor (TAPI)InhibitionProtease-inhibitor complexsactivationSerine ProteaseMetalloProteaseTGasePro-region (AAs)+举例举例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization33根据该根据该TGase活化模型：在发酵过程的产酶初期活化模型：在发酵过程的产酶初期:*添加添加1000 U/
29、mL的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高31.2 %*添加添加10 mg/mL的的CTAB，使发酵过程酶活提高，使发酵过程酶活提高21.8 %举例举例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization34 G lucose G 6P F6P G A P G 3P P E P P yr O A A R 5P H is S er C ys Trp P he Tyr A la Val L eu A sp G ly Lys T hr M et A sn Ile A cC oA C it
30、A K G G lu P ro A rg G ln A m ino acids for other proteins A m ino acids for T G ase H is C ys S er G ly Trp P he Tyr A la Val L eu A sp A sn M et T hr Lys Ile G ln A rg P ro G lu Determine of culture medium by analysis of amino acid metabolism using mass balances Amino acid metabolic anylysis of St
31、reptomyces Mobaraense Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation. DO1DO2DO2DO1pH1pH2举例举例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation OptimizationpH1:7.0; pH2:6.5DO1:转速转速300 rpm; DO2:转速转速200 rpm35小 结 对微生物发酵过程进行解析（生理、动对微生物发酵过程进行解析（生理、动力学、代谢网络）力学、代谢网络） 根据不同发酵过程的特点，提出相应的根据不同发酵过程的特点，提出相应的优化控制策略优化控制策略 实现微生物发酵过程高产量、高产率和实现微生物发酵过程高产量、高产率和高生产强度的有机统一高生产强度的有机统一36
