1、5/31/2022 - page 1h:marcoindustryFood media.5/31/2022 - page 2h:marcoindustryFood media.l了解染色的基本原理。了解染色的基本原理。l掌握常用染料的性质及其染色的配制技术。掌握常用染料的性质及其染色的配制技术。l熟悉常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的配熟悉常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的配制技术。制技术。l了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，掌握一般培养基的配制技术。掌握一般培养基的配制技术。5/31/2022 - page 3h:marcoindustryFoo
2、d media.一、染色原理一、染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。 化学因素：正负离子之间的相互吸引等。 5/31/2022 - page 4h:marcoindustryFood media. 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑、苦味酸等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红美兰等，瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等
3、（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料 .染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 染料染料细菌染色用的染料细菌染色用的染料酸性染料酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红）碱性染料碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细细菌一般带负电，菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。复合染料复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。单纯染料：单纯染料：
4、不能与被染物生成盐类. 碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。 酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。 5/31/2022 - page 7h:marcoindustryFood media.5/31/2022 - page 8h:marcoindustryFood m
5、edia.l1. 1. 常用染料的溶解度常用染料的溶解度 表表3-13-1l2. 2. 常用染料的配制常用染料的配制 5/31/2022 - page 9h:marcoindustryFood media.一、缓冲液的配制技术一、缓冲液的配制技术5/31/2022 - page 10h:marcoindustryFood media.l1.溶液浓度表示法溶液浓度表示法 l 2.物质的量浓度溶液的配制方法物质的量浓度溶液的配制方法l 3.溶液溶液 浓度的调整浓度的调整l4.常用酸碱的物质的量浓度计算常用酸碱的物质的量浓度计算 5/31/2022 - page 11h:marcoindustryF
6、ood media.5/31/2022 - page 12h:marcoindustryFood media.l血清学实验血清学实验在第五章讲解在第五章讲解5/31/2022 - page 13h:marcoindustryFood media.l 什么是微生物生化试验?l 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。l l 由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌。 1. 1. 在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察
7、培在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的养基的pH值变化。值变化。2. 2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。反应。3. 3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4. 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。5/31/2022 - page 15h:marcoindustryFood media.l 1.待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。l 2.待检菌应是纯种培养物。l 3.
8、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。l 4.应做必要的对照试验。l 5.提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。5/31/2022 - page 16h:marcoindustryFood media.l生化试验分类l（一）糖（醇）类代谢试验 l（二）氨基酸和蛋白质代谢试验l（三）有机酸盐和铵盐代谢试验l（四）酶类试验.（一）（一）糖（醇）类代谢试验糖（醇）类代谢试验 1.糖醇类发酵试验糖醇类发酵试验 2.V-P试验试验 3.甲基红（甲基红（Methyl Red）试验）试验 MR. 1. 糖醇类发酵试验糖醇类发酵试验 原理：原理：不同的细菌对各种糖醇的分
9、解能力及所产生的不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解12种糖醇种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。糖发酵试验糖发酵试验原理原理 不同微生物发酵糖的能力各异，产生的分解产物也不同，可以不同微生物发酵糖的能力各异，产生的分解产物也不同，可以作为细菌分类鉴定的手段。作为细菌分类鉴定的手段。大肠埃希菌大肠埃希菌/产气肠杆菌产气肠杆菌葡萄糖葡萄糖CH3COCOOHHCOOH甲酸解
10、氢酶甲酸解氢酶H2+ CO2伤寒沙门菌伤寒沙门菌葡萄糖葡萄糖CH3COCOOHHCOOH指示剂：溴麝香草酚蓝指示剂：溴麝香草酚蓝pH6.3(黄黄)；6.3 pH7.2(蓝蓝)pH6.3pH7.2举例举例.常用的糖醇常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖三糖：棉子糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇5/31/2022 - page 21h:marcoindustryFood media.l (1)试剂：糖
11、发酵培养基中，常用的指示剂主要有试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有l 酚红、溴麝香草酚蓝酚红、溴麝香草酚蓝 颜色反应较敏感，但稳定性较差颜色反应较敏感，但稳定性较差。l 溴甲酚紫和酸性复红溴甲酚紫和酸性复红 比较稳定比较稳定，特别是对发酵迟缓的细菌特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长培养时间较长，宜选，宜选则二者则二者。 l(2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖体糖发酵管，双糖(或三糖或三糖)高层斜面发酵管。高层斜面发酵管。l.2）试验操作方法试验操作方法 以无菌操作的方法将经以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌分离培养的
12、纯种细菌用接用接种针或环移取种针或环移取，接种于糖接种于糖发酵管中，若为半固体培发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺养基，则用接种针作穿刺接种。置接种。置361.0 置温箱置温箱内内培养培养经一定时间经一定时间(数小时数小时至二周至二周)培养，然后培养，然后每天观每天观察结果。察结果。 . 1 1. .糖发酵试验要注意杜氏小管的置入方法；糖发酵试验要注意杜氏小管的置入方法； 2.2.在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。止倒置的小管进入气泡。注意事项注意事项.杜氏小管灌装 灌装不好会使杜氏小管中有气泡，影响观察结果。 首先将试管中
13、装满培养液，然后用医用注射器吸取一定量培养液，排空其中空气，将针头伸到杜氏小管底部(防止气泡产生)，缓缓将培养液推入杜氏小管直到凸起(表面张力作用)，再至过量以至培养液润湿杜氏小管外表，因培养液具有一定粘滞力，它可使湿润的杜氏小管贴着试管放入时慢慢滑到试管底部，而不撞破试管底部。 .气泡导管气泡阳性阳性阳性阳性阴性阴性培养基变为黄色培养基未变色、培养基未变色、无气泡产生无气泡产生结果结果记录：记录： 产酸不产气，阳性，以产酸不产气，阳性，以“+”表示表示产酸产气，阳性，以产酸产气，阳性，以“ ”表示表示不产酸产气，阴性，以不产酸产气，阴性，以“-”表示表示. 2.V-P试验试验（乙酰甲基甲醇（
14、乙酰甲基甲醇 试验）试验） 1 1）原理：原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，氧化为二乙酰，在在-萘酚和肌酸的催化作用下，萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与蛋白胨中的胍基二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称生成红色化合物，称V VP P（+ +）反应。反应。.27V.P. 试验(伏普试验)n 用来测定某用来测定某些细菌利用葡萄些细菌利用葡萄糖产生糖产生非酸性非酸性或或中性末端
15、产物中性末端产物的的能力。能力。某些细菌在糖代谢过程中，经糖酵解途径产生丙酮酸。某些细菌在糖代谢过程中，经糖酵解途径产生丙酮酸。因不同细菌所含酶不同，进一步对丙酮酸的代谢也不同。因不同细菌所含酶不同，进一步对丙酮酸的代谢也不同。大肠埃希菌大肠埃希菌产气肠杆菌产气肠杆菌2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3+ 2CO2O2+ KOHCH3COCHOHCH3CH3COCOCH3CH3COCOCH3+胍基胍基红色化合物红色化合物+ H2OVP试验阴性。试验阴性。VP试验（试验（V）实验实验原理原理 举例举例.n应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，
16、前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律。 .302）V.P.试验n 取取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，支葡萄糖蛋白胨水培养基，1号接种大肠号接种大肠杆菌，杆菌，2号接产气杆菌，第号接产气杆菌，第3支接未知菌支接未知菌。n 37培养培养 48h后后，加入加入40%KOH 510滴，滴，然后再加入等量的然后再加入等量的5%-萘酚溶液，萘酚溶液，用力振荡用力振荡，再，再放入放入37温箱中保温温箱中保温30min，以加快反应速度。，以加快反应速度。n观察培养基的颜色变化。观察培养基的颜色变化。 3）结果观察与记录结果观察与记录 （1）发酵管出现红色者，为阳性，）发酵管出现
17、红色者，为阳性， 记记V-P+ （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P-.注意事项注意事项VPVP实验一定要注意开盖振荡！且反应时间较长。实验一定要注意开盖振荡！且反应时间较长。.中文名称： 大肠埃希菌 菌株保藏编号： CVCC 3038 特征特性： 非抗酸性 化能异养 最适温度37.pH7.27.4 不利用柠檬酸盐不利用柠檬酸盐 可发酵多种碳水可发酵多种碳水化合物如：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇化合物如：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇 接接触酶阳性、氧化酶阴性、脲酶阴性触酶阳性、氧化酶阴性、脲酶阴性.MR试验阳性、试验阳性、VP试验阴性试验阴性 属
18、名： Escherichia 种名加词： coli . 3.甲基红（甲基红（MR）试验）试验 1 1）原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中）原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH H值下降值下降至至pH4.5pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。以下，使甲基红指示剂变红。为甲基红试验阳性为甲基红试验阳性 ；有的细菌；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性
19、产物，培养液使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pHpH5.45.4，甲基红指示剂呈，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。桔黄色，为甲基红试验阴性。检测不同细菌分解葡萄糖产酸的能力。检测不同细菌分解葡萄糖产酸的能力。大肠埃希菌大肠埃希菌葡萄糖葡萄糖产气肠杆菌产气肠杆菌指示剂：指示剂：甲酸甲酸乙酸乙酸乳酸乳酸琥珀酸等琥珀酸等分解分解甲酸、乙醇和乙酰甲基甲酸、乙醇和乙酰甲基甲甲醇醇 pH5.4葡萄糖葡萄糖分解分解甲基红甲基红pH5.4(橘黄色橘黄色)。甲基红试验甲基红试验实验实验原理原理 pH4.5pH5.4举例举例.2）试验方法：试验方法： 挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄挑
20、取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于糖蛋白胨水培养基，于361 或或30 （以（以30 较好）较好）培养培养35天，从第天，从第48h起，每日取培养液起，每日取培养液1ml，加入甲基，加入甲基红指示剂红指示剂12滴，立即观察结果。滴，立即观察结果。 .3）结果观察与记录结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记淡红色为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，从从发现阴性并培养至第发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。天仍为阴性，即可判定结果。.MR-VP试验原理及照片V-
21、P.1.靛基质（吲哚）试验靛基质（吲哚）试验2.H2S试验试验3.尿素酶试验尿素酶试验 （二）（二）氨基酸和蛋白质代谢试验氨基酸和蛋白质代谢试验.1.吲哚试验吲哚试验 （靛基质试验）（靛基质试验） 1 1）原理：原理：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。.40吲哚试验n色氨酸分解反应：n吲哚反应： 不同微生物所含酶系统不同，某些细菌含有不同微生物所含酶系统不同，某些细菌
22、含有色氨酸酶色氨酸酶，能够分解，能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸。培养基内蛋白胨中的色氨酸。大肠埃希菌大肠埃希菌色氨酸色氨酸产气肠杆菌产气肠杆菌色氨酸酶色氨酸酶+H2OCH3COCOOH吲哚吲哚+检测：检测：吲哚吲哚 +对二甲基对二甲基氨基苯甲醛氨基苯甲醛玫瑰吲哚玫瑰吲哚+H2O玫瑰红色玫瑰红色吲哚试验阳性吲哚试验阳性+吲哚试验吲哚试验实验实验原理原理吲哚阴性吲哚阴性 -举例举例.2）试验方法：试验方法： 取取3 3支胰蛋白水培养基培养基，支胰蛋白水培养基培养基，1 1号接种大肠杆菌，号接种大肠杆菌，2 2号号接种产气杆菌，接种产气杆菌，第第3 3支接未知菌支接未知菌。 3737培养培养24h
23、24h48h48h。 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。3）结果观察与记录结果观察与记录 呈现玫瑰红色呈现玫瑰红色,为阳性反应为阳性反应,记记+ 无红色者无红色者,为阴性反应为阴性反应,记记-.靛基质试验原理及照片靛基质试验原理及照片 靛基质+1 1）原理：某些细菌能分解培养原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成基中的含硫氨基酸生成H H2 2S S， H H2 2S S可与加入培养基中的铅或可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色铁离子生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。 l)FeS(SOHFeSO4SH SHNHCOC
24、OOHCHOHCOOHSHCHNHCH422233222黑色. 2）方法与结果 (1)琼脂穿刺法：培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37 24-48h培养后，观察结果。结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。 (2)醋酸铅试纸法：培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37培养24-48h。结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。.3）结果观察与记录结果观察与记录 培养基底部呈黑色，
25、培养基底部呈黑色，为阳性，记为阳性，记+ 培养基底部无黑色，培养基底部无黑色，为阴性，记为阴性，记- .3. 尿素分解试验尿素分解试验 尿素酶（尿素酶（Urease）试验试验1 1）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2 2个分子的个分子的氨，使培养基变为碱性，氨，使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色使培养基中的酚红指示剂呈粉红色。培培养基由黄色变为红色养基由黄色变为红色，为阳性为阳性。以此鉴以此鉴别细菌别细菌。1 1）未接种）未接种2 2）尿素酶阳性）尿素酶阳性3 3）尿素酶阴性）尿素酶阴性.2）试验方法：试验方法： 挑取大量
26、培养挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。天，作最终判定。.尿素酶试验图尿素酶试验图 阳性3）结果观察与记录结果观察与记录培养基呈粉红色，为阳性，记培养基呈粉红色，为阳性，记 +培养基颜色不变，为阴性，记培养基颜色不变，为阴性，记 -.（三）（三） 呼吸酶类试验呼吸酶类试验
27、F氧化酶试验氧化酶试验F过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验F硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验F氰化钾试验氰化钾试验.1. 氧化酶试验氧化酶试验1）原理原理: 氧化酶使细胞色素氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素氧化后，氧化型细胞色素C再使再使盐酸二甲基对苯二胺盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成氧化，使生成玫瑰红色到暗玫瑰红色到暗紫色紫色的醌类化合物的醌类化合物,再和再和-萘酚萘酚结合结合,生成生成吲哚酚蓝吲哚酚蓝,呈呈蓝色反应，为阳性蓝色反应，为阳性。. 氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反
28、应。 本实验肠杆菌科阴性，弧菌科，非发酵菌阳性（个别除外），奈瑟菌属均阳性。 试验方法 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深； 再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。 . 用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。 异常结果： 奈瑟菌属有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等9种致病菌，引起流行性脑脊髓膜炎 上呼吸道症状：鼻咽炎等全身感染症状：高热、出血点或瘀血点，脑膜炎症状：头痛、呕吐、颈项强直;引起淋病，引起新生儿淋病性眼结膜炎。
29、. 氧化酶试验注意事项： 试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。 10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。.试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺盐酸二甲基对苯二胺 1% -萘酚萘酚-乙醇液乙醇液.蓝色为+不变色或为不变色或为粉粉红色为红色为-.2. 过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验1）原理：原理： 某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。即
30、为阳性反应。.2）试验方法试验方法 用滴管直接滴加用滴管直接滴加1%1%盐酸二甲基对苯二胺试剂盐酸二甲基对苯二胺试剂1 1- -2 2滴滴在培养物上在培养物上, ,再加入再加入1% -1% -萘酚萘酚- -乙醇液乙醇液1 1- -2 2滴滴, , 在在3030秒秒内判定试验结果。内判定试验结果。 3 3）结果观察与记录结果观察与记录 在在3030秒内呈蓝色反应秒内呈蓝色反应, ,为阳性为阳性, ,记记 + + 不变色或为不变色或为粉粉红色者红色者, ,为阴性为阴性, ,记记 - -.2）试验方法试验方法 取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试
31、管），滴加片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。.3）结果观察与记录结果观察与记录 产生气泡者，为阳性，记产生气泡者，为阳性，记+ 不产生气泡者，为阴性，记不产生气泡者，为阴性，记-.3.硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验1）原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺
32、作用，生成重氮苯磺酸，酸，重氮苯磺酸再与重氮苯磺酸再与-萘胺萘胺作用，生成作用，生成红色红色的化合物，的化合物，呈红色反应，为阳性反应。呈红色反应，为阳性反应。.试剂 A、对氨基苯磺酸试剂、对氨基苯磺酸试剂 B、-萘胺试剂萘胺试剂.2）试验方法试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在上接种，在361 培养培养14天，每天取天，每天取2mL培培养液养液,加入加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。立即观察结果。.3）结果观察与记录结果观察与记录 呈现红色，为阳性，记呈现红色，为阳性，记+ 若无红色出现，为
33、阴性，记若无红色出现，为阴性，记-.4. 氰化钾试验氰化钾试验1）原理：原理： 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶可与呼吸酶作用使酶失去活性作用使酶失去活性,抑制细菌的生长抑制细菌的生长,但有的细菌在但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌以此鉴别细菌.2）试验方法试验方法 取培养取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落的营养肉汤培养液或菌落1环，环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，胶塞塞紧，361 培养培养24 48h，观察结果。，观察结果。.3）结
34、果观察与记录结果观察与记录 对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记性，记+。 对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记性。记-。. （四）（四）毒性酶类试验毒性酶类试验F溶血试验溶血试验F血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验.1. 溶血试验溶血试验1）原理：原理： 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。血反应，借此可鉴别细菌。.2）试验方法试验方法平板法平板法试管法试管法.平板法平
35、板法 将培养物接种于血平板培养基上，将培养物接种于血平板培养基上，361 培养培养24 48h，观察结果。，观察结果。.溶血试验的溶血类型及现象溶血试验的溶血类型及现象（1） （甲型）溶血（甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。草绿色溶血环。（2） （乙型）溶血（乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血菌落周围出现较宽的透明溶血环。环。（3）（丙型）溶血（丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。菌落周围无溶血环。.甲型（甲型（-）溶血）溶血乙型（乙型（-）溶血）溶血丙型（丙型（-）溶血）溶血. （乙型）溶血（乙型）溶血.试管法 将待检菌培养液与等量的将待检菌培
36、养液与等量的2%羊血球混合，在羊血球混合，在361 培养培养16 18h，观察结果。如溶血，培养，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。液可出现透明状。.3）结果观察与记录结果观察与记录 有溶血现象，为阳性，记有溶血现象，为阳性，记+； 无溶血现象，为阴性，记无溶血现象，为阴性，记 -.2. 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验1）原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为
37、血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。为阳性。.2）试验方法试验方法（1）玻片法：）玻片法： 取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。.有凝块均匀混浊血浆生理盐水血浆凝固酶试验血浆凝固
38、酶试验.（2）试管法）试管法 取灭菌小试管取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水支，各加入血浆无菌水(1:1) 0.5ml，1支支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余；其余2支作对照管，支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液悬液0.5ml作阳性对照作阳性对照;另另1支加入营养肉汤或支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶氯化钠溶0.5ml作空白对照。将作空白对照。将3管同时放管同时放37温箱或水浴中培养，每温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次，观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察
39、直至内无凝固现象者，观察直至24小时。小时。.阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动.金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 .3）试管法的结果观察与记录试管法的结果观察与记录 空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固。 试验管血浆凝固者为阳性；试验管血浆凝固者为阳性； 均无凝固则为阴性。均无凝固则为阴性。.其他其他 柠檬酸盐利用试验 1.有机酸盐的利用试验有机酸盐的利用试验. 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验1）原理：原理： 某些细菌能利用柠檬酸某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解
40、枸盐作为唯一碳源，分解枸橼橼(柠檬柠檬)酸盐生成碳酸盐；酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为淡绿转为深蓝色深蓝色，为，为阳性阳性。肠杆菌科各种细菌利用柠檬酸盐的能力不同，有的菌可利用柠檬酸钠作肠杆菌科各种细菌利用柠檬酸盐的能力不同，有的菌可利用柠檬酸钠作为碳源，有的则不能。为碳源，有的则不能。大肠埃希菌大肠埃希菌产气肠杆菌产气肠杆菌 大肠埃希菌不能利用柠檬酸盐，故不能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养大肠埃希菌不能利用柠檬酸盐，故不能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基上生长。柠檬酸
41、盐利用试验阴性。基上生长。柠檬酸盐利用试验阴性。 产气肠杆菌能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基上生长，并分解柠檬酸产气肠杆菌能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基上生长，并分解柠檬酸盐产生盐产生CO2，再生成碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，培养基中的指示剂，再生成碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，培养基中的指示剂BTB由绿色变为蓝色。由绿色变为蓝色。枸橼酸盐利用试验（枸橼酸盐利用试验（C）实验原理实验原理 举例举例 .2）试验方法试验方法 挑取待检菌，在西挑取待检菌，在西蒙柠檬酸盐培养基斜面蒙柠檬酸盐培养基斜面上密集划线接种，在上密集划线接种，在361 培养培养14天，天，每天观察结果。每天观察结果。.
42、3）结果观察与记录结果观察与记录 斜面有菌苔生长，培养基斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记为阳性，记+； 无菌苔生长，培养基斜面无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记仍为绿色者，为阴性，记-.柠檬酸盐试验原理及斜面照片 阳性+. 2.三糖铁（三糖铁（TSI）试验）试验.1）三糖三糖铁铁试验的原理试验的原理 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因
43、接触空气而氧化，加面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。色。 如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。变黑。 .制好的培养制好的培养基基对照管对照管斜面红色，底斜面红色，底面黄色面黄色培养基全培养基全黄色黄色斜面、底部黄斜面、底部黄色，并产生色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，斜面红色，底部黄色，
44、产生产生H2S底面黄色，并产生底面黄色，并产生CO2.2）试验方法试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置刺接种并涂布于斜面，置361培养培养1824h，观察结果。观察结果。. 已知大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌原理？ 2志贺氏菌志贺氏菌3沙门氏菌沙门氏菌4大肠杆菌大肠杆菌.下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？ 2志贺氏菌志贺氏菌3沙门氏菌沙门氏菌4大肠杆菌大肠杆菌.思考题提问：提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生不产生
45、H2S。在培养基上应该产生什么现象？。在培养基上应该产生什么现象？大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生产生H2S。在培养基上应该是什么现象？。在培养基上应该是什么现象？1.沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？多数产气，在培养基上应该是什么现象？5/31/2022 - page 97h:marcoindustryFood media.培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的
46、混合养料。代谢产物的混合养料。要求：应具备要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。须灭菌。 l 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水机盐和水 .微生物的六大营养素微生物的六大营养素5/31/2022 - page 99h:marcoindustryFood media.l l l .营养物质营养物质水水碳源碳源兼能源兼能源氮源氮源无机盐无机盐生长生长因子因子细胞的组成成分细胞的组成成分提供细胞代谢的介质提供细胞代谢的介质直接参与代谢过程直接参与代谢过程降低细胞内温度降低细胞内温度维持生物大分子的维持生物大
47、分子的天然构象天然构象合成含氮物质提供能量构成细胞物质构成细胞物质 提供能量提供能量 构成细胞的组成成分；构成细胞的组成成分； 作为酶的组成成分；作为酶的组成成分；维持酶的活性；维持酶的活性；调节细胞渗透压；调节细胞渗透压； 作为某些自养菌的能源作为某些自养菌的能源。 1.培养基的成分培养基的成分 维持细菌的代谢、维持细菌的代谢、繁殖繁殖.2.培养基的分类 按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基按培养基用途 基础培养基、选择培养基 增殖培养基、鉴别培养基.二、培养基pH的测定与调整 测定测定pH是培养基配制过程中的重要步骤
48、之一，测定是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为的标准温度为25士士2。调节。调节pH可用无菌的可用无菌的1mol/l氢氧化氢氧化钠溶液或钠溶液或10%碳酸钠溶液、碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。盐酸溶液。 一般高压灭菌前培养基的一般高压灭菌前培养基的pH会比最终会比最终pH调高调高0.2左右，左右，灭菌后基本合适。灭菌后基本合适。 .二、培养基pH的测定与调整 测定测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温的标准温度为度为25士士2。调节。调节pH可用无菌的可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或氢氧化钠溶液或10%碳酸碳酸
49、钠溶液、钠溶液、1mol/l盐酸溶液。盐酸溶液。 当调节缓冲液的当调节缓冲液的pH时，宜用时，宜用6mol/l磷酸或磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液。氢氧化钾溶液。 一般高压灭菌前培养基的一般高压灭菌前培养基的pH会比最终会比最终pH调高调高0.2左右，灭菌后左右，灭菌后基本合适。因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的基本合适。因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测均进行测定，并记下每次定，并记下每次pH的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH
50、的调节。的调节。 测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用酸度酸度计校正，如与所需计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤，使培养基澄清。后要加热过滤，使培养基澄清。 .三、常用培养基的制备技术1.玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用。前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用。 （1）平皿用纸或布包好，或装在
