1、分子生物学研究方法分子生物学研究方法 基因操作基因操作DNADNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因的定点突变基因的定点突变PCRPCR扩增等扩增等核心技术核心技术（一）三大成就（一）三大成就 ：1 1、 4040年代确定了遗传信息的携带者，即基年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是因的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决了遗而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；传的物质基础问题；一、发展历程及基础一、发展历程及基础2. 502. 50年代揭示了年代揭示了DNADNA分子
2、的双螺旋结构模型和半保留复分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制制机制, ,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；Rosalind FranklinX-ray 光源光源DNAMaurice Wilkins成像成像1953- Franklin & Wilkins3. 503. 50年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了 中心法则中心法则 和操纵子学说和操纵子学说, ,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。Jacob and Monod（二）两大技术保证：（二）两大技术保证：1.
3、1.DNADNA的体外切割和连接的体外切割和连接19621962年年ArberArber 发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，19671967GellertGellert发现了发现了 DNA DNA 连接酶连接酶限制性酶限制性酶连接酶连接酶2. 2. DNADNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术二、二、 DNADNA操作技术操作技术（一）（一） 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳基本原理：基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移
4、率，它与电场强度和下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比电泳分子本身所携带的净电荷数成正比, ,与分子的摩与分子的摩擦系数成反比擦系数成反比| DNADNA和和RNARNA被称为多聚阴离子（被称为多聚阴离子（polyanionspolyanions），），核酸分子放核酸分子放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，度下，DNADNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。构型。大分子量的大分子量的DNA移动的慢移动的慢小分子量的小分子量的DN
5、A移动的快移动的快电泳缓冲液电泳缓冲液阳极阳极阴极阴极DNA加样孔加样孔琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2500.250kbkb之间之间聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1 1到到10001000个碱基对之间个碱基对之间凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNADNA片段的大小范围（片段的大小范围（bpbp）0.3%0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 00050 0001 0000.7%0.7%琼脂糖琼脂糖20 0001 00020 0001 0001.4%1.4%琼脂糖琼脂糖6
6、0003006 0003004.0%4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 0001001 00010010.0%10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺500255002520.0%20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501501凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 在紫外线的照射下在紫外线的照射下结合溴化乙锭（简称结合溴化乙锭（简称EtBrEtBr）的的DNADNA分子发分子发出荧光出荧光, ,每条每条DNADNA带中带中仅含有仅含有0.050.05g g的微的微量量
7、DNADNA也可以被清晰也可以被清晰地检测出来。地检测出来。称样称样溶解溶解加热加热制板制板倒胶倒胶电泳操作基本程序电泳操作基本程序取样取样点样点样电泳电泳检测检测结果分析结果分析（二）（二） 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序将带有互补的特定核苷酸序列的单链列的单链DNADNA或或RNARNA混合在一混合在一起，其相应的同源区段就会起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就机体，所形成的双链分子就被称为被称为杂种核酸分子杂种核酸分子。 DNA/DNA DNA/DNA 或或
8、DNA/RNA DNA/RNA 不同不同温度温度下下DNADNA的构的构型变型变化化| 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的泳分离的DNADNA或或RNARNA分子，都必须通过毛细管分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地凝胶中的位置原封不动地“吸印吸印”上去的，上去的，因此，核酸杂交也被称为因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交印迹杂交”。 材料：材料：尼龙滤膜尼龙滤膜 、硝酸纤维素滤膜、硝酸纤维素滤膜 、二乙氨基乙基纤维素滤、二乙氨基乙基纤维素滤膜（膜（DEAEDEAE）步骤：
9、步骤：第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法噬菌斑印迹法; ;第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交探针进行杂交Southern BlottingSouthern Blotting的过程的过程（1 1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNADNA（2 2）通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳
10、液的移动转移胶中的DNADNA（3 3）固定胶中的固定胶中的DNADNA（4 4）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）（5 5）结果检测）结果检测1、Southern Blotting（DNA印迹技术）印迹技术） 常用常用的荧光的荧光染料：染料：C C5 5、C C3 3等等2.Northern blotting2.Northern blotting（RNARNA印迹技术）印迹技术）|是将是将RNARNA分子从电泳凝胶分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种上，进行核酸杂交的一种实验
11、方法。实验方法。 分离的分离的 mRNA (不同长度不同长度) 探针探针 DNA结合结合主要步骤：主要步骤： 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS- SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶( (PAGE)PAGE)电泳电泳 蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜 靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测Step 1.Step 1.靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应Step Step 2.2.与与标记标记的第的第二抗二抗体（体（酶标酶标二抗二抗）反）反应应SteStep p 3.3.显显色色反反应应：酶酶促促反反应应4 4、原位杂交（、原位杂交（in s
12、itu hybridizationin situ hybridization ）DNA的定位的定位RNA定位定位|将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中的细胞或组织中的核酸进核酸进行杂交，称为原位杂交。行杂交，称为原位杂交。|特点特点: :|能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究|不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高靶序列灵敏度高|能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片细胞或组织的固定
13、：载玻片组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理: : 用去垢剂或蛋白酶除用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质去核酸表面蛋白质探针的选择和标记探针的选择和标记杂交杂交杂交结果检测杂交结果检测检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术5 5、探针的标记、探针的标记|探针的种类探针的种类: :根据核酸的性质，可分为根据核酸的性质，可分为DNADNA和和RNARNA探针探针; ;根根据是否使用放射性标记物的与否据是否使用放射性标记物的与否, ,可分为放射性标记探针和非可分为放射性标记探针和非放射性标记探针放射性标记探针; ;根据是否存在互补链根据是否存在互补链, ,可分为单链和双链探
14、可分为单链和双链探针针; ;根据放射性标记物掺入情况根据放射性标记物掺入情况, ,可分为均匀标记和末端标记可分为均匀标记和末端标记探针。探针。|标记物标记物: :核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：3232P P、3535S S、3 3H H等等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素缺口平移法缺口平移法（1 1）双链）双链DNADNA探针探针 当双链当双链DNADNA分子的一条链上产生切口时分子的一条链上产生切口时, ,E.coliE.coli DNA DNA聚合聚合酶酶就可将核苷酸连接到切口的就可将核苷酸连接到
15、切口的33羟基末端。羟基末端。 同时该酶具有从同时该酶具有从5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性, ,能从切口的能从切口的55端除去核苷酸。端除去核苷酸。 由于在切去核苷酸的同时又在切口的由于在切去核苷酸的同时又在切口的33端补上核苷酸端补上核苷酸, ,从而使切口沿着从而使切口沿着DNADNA链移动链移动, ,用放射性核苷酸代替原先无用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为最合适的切口平移片段一般为50-50050-500个核苷酸。个核苷酸。 随机引物法随机引物法 随机引物合成双随机
16、引物合成双链探针是使寡核链探针是使寡核苷酸引物与苷酸引物与DNA模板结合模板结合,在在Klenow酶的作用酶的作用下下,合成合成DNA探针。探针。产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷个核苷酸。酸。（2 2）单链）单链DNADNA从从M13M13载体衍生序列合成单链载体衍生序列合成单链DNADNA探针探针 从从RNARNA合成单链合成单链cDNAcDNA探针探针 （3 3）寡核苷酸探针）寡核苷酸探针（4 4）末端标记）末端标记DNADNA探针探针 （5 5）RNARNA探针探针从从M13M13载体衍生序列合成单链载体衍生序列合成单链DNADNA探针探针 从从RNARNA合合成单链成单
17、链cDNAcDNA探针探针 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的另一种细菌菌株的DNADNA而导致性状特征发生遗传改变而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。的生命过程。提供转化提供转化DNADNA的菌株叫作供体菌株，接受转化的菌株叫作供体菌株，接受转化DNADNA的的细菌菌株则被称为受体菌株。细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源处于能够接受外源DNADNA状态的细胞称为感受态细胞。状态的细胞称为感受态细胞。（三）（三） 细菌转化细菌转化步骤：步骤：1.1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（将快速生长中的大肠杆菌置于经低温
18、（00）预）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。（形成原生质球）。2.2.与转化混合物中的外源与转化混合物中的外源DNADNA形成粘附在细胞表面的复形成粘附在细胞表面的复合物。合物。 3.3.立即将该体系转移到立即将该体系转移到4242下做短暂的热刺激，复合下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。物便会被细胞所吸收。4.4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复细胞活性恢复5. 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。涂布于选择性培养基中分离转化子。（四）（四）基因扩增
19、基因扩增聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即PCRPCR技术，是一技术，是一种在体外快速扩增特定基因或种在体外快速扩增特定基因或DNADNA序序列的方法，故又称为基因的体外扩增列的方法，故又称为基因的体外扩增法。法。1 1、 基本原理基本原理 ：PCRPCR由变性由变性-退火退火-延伸三个延伸三个基本反应步骤构成。基本反应步骤构成。模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经加热至经加热至9393左右左右, ,一定一定时间后，使模板时间后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮解离，使之成
20、为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；反应作准备；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板：模板DNADNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；靶序列靶序列引物引物1引物引物25355353靶序列靶序列3靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物1引物引物253553533Taq DNA聚合酶聚合酶引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTPdNTP为反应原
21、为反应原料，靶序列为模板，料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留按碱基配对与半保留复制原理，合成一条复制原理，合成一条新的与模板新的与模板DNADNA互补互补的链。的链。第一次第一次PCR PCR 循环的结果是产生两个靶序列的复制。循环的结果是产生两个靶序列的复制。1cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664
22、201,048,576301,073,741,8242 2、PCRPCR反应五要素反应五要素： 引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和模板和MgMg2+2+（1 1）PCRPCR引物设计引物设计E 一对引物，与一对引物，与33端互补端互补E 长度：长度：15153030个核苷酸个核苷酸E 碱基分布随机碱基分布随机E 引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列E 引物与非特异扩增区无同源性引物与非特异扩增区无同源性E 33端必须互补端必须互补E 55端可游离端可游离E 引物浓度一般为引物浓度一般为0.10.1 0.5 0.5 mol/Lmol/L（2 2）DNA DNA 聚合
23、酶聚合酶u在核苷酸底物的存在下，以一条在核苷酸底物的存在下，以一条DNADNA链为模板催化链为模板催化新链的合成新链的合成u需要具有需要具有 3 -OH 3 -OH 的引物的引物u具有具有 5 5 到到3 3 方向聚合的能力方向聚合的能力u通常具有通常具有 3 3到到 5 5 外切酶活性外切酶活性uTaqTaq DNADNA聚合酶在聚合酶在70708080具有最高聚合活性具有最高聚合活性(3)(3)镁离子浓度镁离子浓度: : TaqTaq酶活性需要酶活性需要MgMg2+ 2+ ，MgMg2+2+浓度过浓度过高导致非特异扩增，一般常用高导致非特异扩增，一般常用1.51.5mmolmmol/L/L
24、(4)(4)底物浓度底物浓度: :dNTPdNTP浓度在浓度在2020200 200 mol/Lmol/L，四种，四种dNTPdNTP必须浓度相等必须浓度相等(5)PCR(5)PCR反应的缓冲溶液反应的缓冲溶液 : : 提供合适的酸碱度和提供合适的酸碱度和某些离子：某些离子：10105050mmolmmol/L /L Tris-HClTris-HCl缓冲液、缓冲液、5050mmolmmol/L /L KClKCl、明胶、明胶 PCR仪仪（五）（五） 核苷酸序列分析核苷酸序列分析( (dideoxydideoxy- -termination sequencing)termination sequ
25、encing)|原理：原理：双脱氧（双脱氧（22，33）- -核苷酸可以象核苷酸可以象2-2-脱氧核脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的苷酸那样直接掺入新合成的DNADNA链中，但因链中，但因3 3 端不端不具具OHOH基，基，DNADNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个每个DNADNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的的DNADNA片段测定出核苷酸序列。片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来过磷酸二酯键连接起来AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5AGCTA
26、AAGGTACGGGAATTTCGCG 533添加添加 DNA polymeraseDNA polymerase所有所有4 4 dNTPsdNTPs其中一种标记的其中一种标记的ddNTPddNTP在四个不同的反应管中各只包含一种在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTPddNTP. .ddTTPddCTPddGTPddATPAGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5533T TTCGATCGAT TTCGATTCGATT TTCGATTTCGATTT TT TC CTCGATTTTCGATTTC CTCGATTTCTCGATTTCC
27、CTCTCG GTCGTCGA AT T 反应反应C C反应反应G G 反应反应A A 反应反应每一管中的复制的序列都停留在每一管中的复制的序列都停留在ddNTPsddNTPs 处处5反应终止后，四个反应反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离离. .这四个反应管中延伸的这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基寡核苷酸仅相差一个碱基. .电泳结构通过显色指示电泳结构通过显色指示. . T T C C G G A A33C CC CT TT TT TA AG GC CT T55过程：过程：制备制备ssss-DNA-DNA与引
28、物退火与引物退火分为分为4 4个反应系统个反应系统每个每个系统中加入系统中加入dNTPdNTP（其中其中dATPdATP常带同位素标记）和一种常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸DNADNA聚合酶定序反应聚合酶定序反应反应产物变性后反应产物变性后电泳电泳凝胶干燥凝胶干燥放射自显影放射自显影（该法亦适合该法亦适合mRNAmRNA的序的序列分析）列分析） 。GCGC富集区常出现富集区常出现“隐影隐影”或或“停止停止”现象，如在反应现象，如在反应中加入中加入dITPdITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-7-脱氧鸟苷可解决脱氧鸟苷可解决GCGC富集区
29、的测序。富集区的测序。1 1）模板制备）模板制备: :可自动化可自动化2 2）定序反应）定序反应: :可自动化可自动化3 3）凝胶电泳）凝胶电泳: :自动化有一定困难自动化有一定困难4 4）核苷酸序列阅读与计算机输入）核苷酸序列阅读与计算机输入: :可自动化可自动化2. 2. DNADNA序列测定的自动化序列测定的自动化1.凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验:凝胶阻滞试验（凝胶阻滞试验（gel retardation assay），），又叫作又叫作DNA迁移率变迁移率变动试验（动试验（DNA mobility shift assay），），是用是用于体外研究于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特与蛋白
30、质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。殊的凝胶电泳技术。（六）（六）DNADNA与蛋白质相互作用研究与蛋白质相互作用研究 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。的距离也就相应缩短了。凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞
31、实验的基本原理图放射自显影放射自显影凝胶电泳凝胶电泳在在DNaseI足迹试验（足迹试验（DNA foot-printing assay）过程过程中，首先将待检测的双链中，首先将待检测的双链DNA分子用分子用32P作末端标记，并用作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的
32、用量使分子，并控制酶的用量使之达到平均每条之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。链只发生一次磷酸二酯键断裂。2.DNaseI足迹试验足迹试验v 如果蛋白质提取物中不存在与如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质结合的特异蛋白质，经，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、个、2个、个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。片段梯度群体。v 如果有一种蛋白质已经结合到如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区分子的某一特定区段上，那么，它
33、就将保护这一区段的段上，那么，它就将保护这一区段的DNA免受免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹足迹”。作业：作业：1 1、凝胶电泳的原理是什么？有哪两种，分辨范围各是多、凝胶电泳的原理是什么？有哪两种，分辨范围各是多少？凝胶的浓度和分辨率的关系是什么？少？凝胶的浓度和分辨率的关系是什
34、么？2 2、什么是核酸分子杂交？几种杂交方法的过程各是什么？、什么是核酸分子杂交？几种杂交方法的过程各是什么？3 3、探针的类型有哪些？叙述一种探针的制作过程。、探针的类型有哪些？叙述一种探针的制作过程。4 4、什么是细菌转化？其步骤如何？、什么是细菌转化？其步骤如何？5 5、什么是基因体外扩增？步骤如何？、什么是基因体外扩增？步骤如何？6 6、SangerSanger双脱氧链终止法的原理和过程各是什么？双脱氧链终止法的原理和过程各是什么？（七）实时荧光定量（七）实时荧光定量PCRPCRv定义定义：在：在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个利
35、用荧光信号累积实时监测整个PCRPCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法析的方法 。实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法介绍的几种方法介绍： 1 1、SYBR SYBR Green IGreen I法：法：SYBR Green SYBR Green I I是一种只与是一种只与DNADNA双链双链的的小沟部位结小沟部位结合的荧光染合的荧光染料。料。基本过程是：基本过程是：v开始反应，当开始反应，当SYBR GreenSYBR Green染料与染料与DNADNA双链结合时发出荧光。双链结合时发出荧光。vDNADNA变性时，变性时，SYB
36、R GreenSYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。染料释放出来，荧光急剧减少。v在聚合延伸过程中，引物退火并形成在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCRPCR产物。产物。v聚合完成后，聚合完成后，SYBR GreenSYBR Green染料与双链产物结合，定量染料与双链产物结合，定量PCRPCR系统检测到荧光的净增量加大。系统检测到荧光的净增量加大。v因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNADNA分子的分子的数量。数量。 2 2、TaqManTaqMan探针技术探针技术 |TaqManTaqMan探针法是高度特异的定量探针法是高度特异的定
37、量PCRPCR技术，其技术，其核心是利用核心是利用TaqTaq酶的酶的5 35 3外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。板的数量。v 在在TaqManTaqMan探针法的定量探针法的定量PCRPCR反应体系中，包括一对反应体系中，包括一对PCRPCR引物和一条引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。v 探针的探针的55端标记有报告基团端标记有报告基
38、团(Reporter, R)(Reporter, R) ，33端标记有荧光端标记有荧光淬灭基团淬灭基团(Quencher, Q)(Quencher, Q) 。v 当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着仪器检测不到信号。随着PCRPCR的进行，的进行，TaqTaq酶在链延伸过程中遇到酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其与模板结合的探针，其5 35 3外切核酸酶活性就会将探针切外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被
39、吸收，即产生荧光信号。号。v 每经过一个每经过一个PCRPCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNADNA的拷贝数。的拷贝数。通过通过CtCt值和标准曲线对起始模板进行定量分析：值和标准曲线对起始模板进行定量分析： |CTCT值定义为在值定义为在基线上方产生基线上方产生可检测到的统可检测到的统计学上显著的计学上显著的荧光发射时所荧光发射时所对应的对应的PCRPCR循循环次数环次数 确定未知样品的确定未知样品的 C(tC(t) )值后通过标准曲线由未值后通过标准曲线由未
40、知样品的知样品的C(tC(t) )值推算出其初始量值推算出其初始量F通过一系列酶作用，使总通过一系列酶作用，使总mRNAmRNA转变成双链转变成双链cDNAcDNA并插入到适当的载体分子上，转化大肠并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的序列的cDNAcDNA基因文库。基因文库。1 1、总、总RNARNA的提取的提取|TrizolTrizol试剂试剂( (苯酚苯酚- -异硫氰酸胍）提取法：异硫氰酸胍）提取法：| 液氮研磨材料，匀浆，加入液氮研磨材料，匀浆，加入TrizolTrizol试剂进一步破碎试剂进一步破碎细胞并溶
41、解细胞成分；细胞并溶解细胞成分；| 加入氯仿抽提、离心，分离水相和有机相，收集含加入氯仿抽提、离心，分离水相和有机相，收集含有有RNARNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的mRNAmRNA；| 通过通过ODOD260260和和ODOD280280测定测定RNARNA的纯度和浓度，并用含有甲的纯度和浓度，并用含有甲醛的凝胶电泳检测醛的凝胶电泳检测RNA.RNA.2 2、mRNAmRNA的纯化的纯化寡聚寡聚- -纤维素柱色谱法；纤维素柱色谱法； PromegaPromega公司的公司的PolyATPolyAT TtractTtract mRNA mRNA 分
42、离系统分离系统v将用生物素标记将用生物素标记的寡聚的寡聚( (dTdT) )引物与引物与细胞总细胞总RNARNA共温育，共温育，加入与微磁球相连加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡用磁场吸附通过寡聚聚( (dTdT) )引物与抗生引物与抗生物素蛋白及强力微物素蛋白及强力微磁球相连的磁球相连的mRNAmRNA。3 3、cDNAcDNA的合成的合成v第一链的合成：以第一链的合成：以mRNAmRNA为模板，反转录成为模板，反转录成cDNAcDNA，由反转录酶催化，并由，由反转录酶催化，并由oligodToligodT作作引物。引物。OligodTOligodT引物由引物由
43、12122020个个dTdT构成，后面加上一个构成，后面加上一个具有具有XhoXho等酶切位点的连接引物。等酶切位点的连接引物。&在在cDNAcDNA 合成过程中，应选用活性较高的反转合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及甲基化录酶及甲基化dCTPdCTP，保证新合成的保证新合成的cDNAcDNA链被甲链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割；切割；&cDNAcDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链保证所获得双链cDNAcDNA的方向性。的方向性。v 第二链的合成：以第一链为模板，由第二
44、链的合成：以第一链为模板，由DNADNA聚合聚合酶催化，以酶催化，以RNaseHRNaseH切割杂合链中的切割杂合链中的mRNAmRNA序列产序列产生的小片断为引物，由生的小片断为引物，由DNADNA连接酶连接成完整连接酶连接成完整的的DNADNA链。链。v 同时加入另一个酶切位点的黏性接头同时加入另一个酶切位点的黏性接头（EcoREcoR)，与，与cDNAcDNA连接后用连接后用XhoXho酶切。酶切。4 4、cDNAcDNA文库的构建：基因重组文库的构建：基因重组5 5、基因文库的筛选：、基因文库的筛选： 核酸杂交法核酸杂交法 PCRPCR筛选法筛选法 免疫筛选法免疫筛选法（九）（九）SN
45、PSNP的理论与应用的理论与应用&单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotide single nucleotide polymorphismpolymorphism，SNPSNP），），主要是指在基因组水主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的平上由单个核苷酸的变异所引起的变异所引起的DNADNA序列序列多态性。多态性。 v 通常所说的通常所说的SNPSNP都是二等位多态性的，这种变异可能都是二等位多态性的，这种变异可能是转换（是转换（C TC T，在其互补链上则为，在其互补链上则为G AG A），也可能是颠），也可能是颠换（换（C AC A，G TG T，C GC G，A T
46、A T），具有转换型变异的），具有转换型变异的SNPSNP约占约占2/32/3； v 转换的几率之所以高，可能是因为转换的几率之所以高，可能是因为CpGCpG二核苷酸上的二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。嘧啶。1 1、根据、根据SNPSNP在基因组中的分布位置可分为：在基因组中的分布位置可分为：F 基因调控区基因调控区SNP(pSNPSNP(pSNP) )；F 基因间随机非编码区基因间随机非编码区SNP(rSNPSNP(rSNP
47、) )；F 基因编码区基因编码区SNP(cSNPSNP(cSNP) )。基因编码区基因编码区SNP(cSNPSNP(cSNP) )分为两种：分为两种： 一种是同义一种是同义cSNPcSNP（synonymous synonymous cSNPcSNP），即），即SNPSNP所所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；同； 另一种是非同义另一种是非同义cSNPcSNP（non-synonymous non-synonymous cSNPcSNP），），指碱基序列的改
48、变可使以其为蓝本翻译的蛋白质指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能 。2 2、SNPSNP的特点的特点: :| 密度高：密度高：SNPSNP在人类基因组的平均密度估计为在人类基因组的平均密度估计为3003001000 1000 bpbp, ,在整个基因组的分布达在整个基因组的分布达3 3 10106 6 个个, , 遗传距遗传距离为离为2-3cm,2-3cm,密度比微卫星标记更高密度比微卫星标记更高, ,可以在任何一个可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。待研究基因的内部或附近提供一系列标记。| 富有代表
49、性：某些位于基因内部的富有代表性：某些位于基因内部的SNP SNP 有可能直接有可能直接影响蛋白质结构或表达水平影响蛋白质结构或表达水平, ,因此它们可能代表疾病因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。遗传机理中的某些作用因素。| 遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比, , SNPSNP具有更高的遗传稳定性。具有更高的遗传稳定性。| 易实现分析的自动化：易实现分析的自动化：SNP SNP 标记在人群中只有两种标记在人群中只有两种等位型等位型(allele), (allele), 故也称为双等位标记故也称为双等位标记( (bialleli
50、cbiallelic marker)marker)。这样在检测时只需一个。这样在检测时只需一个 +/- +/- 或或 全全/ /无无 的方式的方式, , 而无须象检测限制性片段长度多态性而无须象检测限制性片段长度多态性, , 微微卫星那样对片段的长度作出测量卫星那样对片段的长度作出测量, , 这使得基于这使得基于SNP SNP 的的检测分析方法易实现自动化。检测分析方法易实现自动化。3 3、SNPSNP的检测分析技术的检测分析技术 （1 1）基因芯片技术）基因芯片技术(gene chips)(gene chips) 基因芯片又称基因芯片又称DNADNA芯片芯片( (DNAchipsDNAchi
