1、特殊毒性试验特殊毒性试验致癌作用及其试验方法致癌作用及其试验方法l致癌作用的基本概念l化学致癌物的分类基本概念基本概念l癌癌是上皮织织发生的恶性肿瘤，但在致癌作用概念中的“癌”既包括恶性肿瘤，也包括良性肿瘤。l致癌物致癌物是指具有诱发肿瘤形成能力的物质，致癌物诱导肿瘤发生和形成的过程称为致癌作用化学致癌物的分类化学致癌物的分类l遗传毒性致癌物l非遗传毒性致癌物l暂未确定遗传毒性的致癌物遗传毒性致癌物遗传毒性致癌物l 遗传毒性致癌物遗传毒性致癌物 能与DNA发生共价健结合，造成对DNA损伤的致癌物l直接致癌物：能直接与亲核分于(包括DNA)共价键结合形成加台物，这类物质绝大多数是合成的有机物，如
2、烯比环氧物、亚胺类、芥子气、活性卤代烃类等；l前致癌物：需要代谢活化后才能与洲A反应造成DN八损伤致癌，如苯并芘(3)、邻苯甲胺l无机致癌物：有些能损伤DNA或是通过改变DNA聚合酶的保真性而致癌，如镍、钛等非遗传毒性致癌物非遗传毒性致癌物 不与DNA发生反应的致癌物l促癌剂：单独不致癌，必须与致病物同时接触机体才呈现作用l激素l免疫抑制剂免疫抑制剂l过氧化物酶体增生剂过氧化物酶体增生剂暂未确定遗传毒性的致癌物暂未确定遗传毒性的致癌物l这类致癌物未能证明损伤未能证明损伤DNA，其致癌方式尚未完全阐明l四氯化碳、氯仿、高氯烷烃化学致癌机制化学致癌机制l体细胞突变学说体细胞突变学说： 正常体细胞的
3、基因在致癌物的作用下发生突变，进一步增殖形成肿瘤l亲电共价结合学说亲电共价结合学说：某些致癌物必须经过代谢活化而成为活性代谢产物(终致癌物），终致癌物合有亲电子中心，可与细胞大分子的亲核中心共价结合致癌l癌基因学说癌基因学说： 发现病毒致癌是由于携带了能致癌的遗传信息，即癌基因。病毒癌基因直接或经过逆转录后，整合于宿主细胞基因组内，从而发挥其致癌作用l化学致癌的阶段学说：化学致癌过程引起肿瘤可分为三个阶段分为三个阶段致癌试验方法致癌试验方法l致癌试验的目的是对某种化学物是否具有致癌的危险性进行评价，它包括短期致癌试验短期致癌试验和长长期致癌试验期致癌试验。 短期致癌试验短期致癌试验l恶性转化试
4、验l哺乳动物短期致癌试验恶性转化试验恶性转化试验l是指利用培养的哺乳动物细胞接触受试物后，观察细胞转化为癌细胞的试验。观察其细胞形细胞形态、细胞生长力、生化特性等变化、以及移植态、细胞生长力、生化特性等变化、以及移植于动物体内能形成肿瘤于动物体内能形成肿瘤的能力。l恶性转比的细胞偏大且大小不等细胞偏大且大小不等，核大而 畸形，核膜粗厚，染色质深染且粗糙，核质比例倒置，核仁增生肥大。核仁和脑质均由于RNA增多而偏酸性，故呈嗜碱性染色而偏增多而偏酸性，故呈嗜碱性染色而偏蓝，核分裂多见哺乳动物短期致癌试验哺乳动物短期致癌试验l又称有限动物试验有限动物试验，是指在有限的40周内，观察某个靶器官或组织l
5、小鼠肺肿瘤诱发试验l大鼠肝转变灶诱发试验l小鼠皮肤肿瘤诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验l多采用对肺肿瘤敏感的品系小鼠，于一次或多次给予受试物后或根据需要再多次给予促癌剂(常用丁基羟甲苯)，可在16-30周左右结束试验。若受试物具有诱发肿瘤作用，无论是大体解剖或者镜下都可见受试物诱发的肿瘤或癌。大鼠肝转变灶诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验l肝癌发生过程有明显的阶段性特点，且可则肝细胞病灶(肝转变灶)和瘤性结节。由于最早出现的肝转变灶可小到几个细胞组成，因此常规 切片病检技术易漏检。采用酶组织化学和免疫组织化学染色技术，可早期发现转变灶和瘤性结节中许多酶学改变，表明这些病变是肝癌细胞。哺乳
6、动物长期致癌试验哺乳动物长期致癌试验l物种选择l剂量与分组l染毒途径l试验期限与染毒时间l结果观察物种选择物种选择l在致癌试验中选择动物最重要的依据是诱发肿瘤的易感性，必须考虑物种、品系、年龄、性别和受试物特定的靶器官l大鼠对诱发肝癌敏感，金黄地鼠对诱发膀胱癌敏感l一般多用啮齿动物，因其敏感性高，寿命相对较短，实验动物的年龄多用幼年动物实验动物的年龄多用幼年动物，雌雄各半剂量与分组剂量与分组l一般设23个剂量组。原则上要尽可能采用较高剂量，以便缩短出现肿瘤的潜伏期，排除易感动物的个体差异，在较短时间内得出阳性结果。但剂量也不能过高。？但剂量也不能过高。？l高剂量组可采用动物的最大耐受量(MTD
7、)，较低剂量组为前一级高剂量组的14-13，最低剂量组相当于人类实际接触的剂量。同时应同时应设阳性对照组及阴性对照组设阳性对照组及阴性对照组l每组动物数雌雄至少各25-50只，在出现第一个肿瘤时每组动物数不应少于25只染毒途径染毒途径l 在选样染毒途径时应考虑试验目的、受试物的性质及用途以及人类实际接触情况等试验期限与染毒时间试验期限与染毒时间 l试验期限：要求长期或终生、一股情况下小鼠最少1.5年大鼠2年；可能时分别延长至2年至2.5年。染毒时间可从实验动物断奶实验动物断奶时时开始，不迟于出生后7-9周。结果的观察、分析评定结果的观察、分析评定l试验过程中应每天密切观察动物1-2次，除一般综
8、合性指标外，主要观察肿瘤出现时间、发生部位、数目、性质和大小。濒死或死亡动物 和试验结束时即刻处死的动物，都应进行病理检查观察指标观察指标l潜伏期：是指从动物接触受试物开始，到出现第一个肿瘤的天数l肿瘤发生率：是指试验终了时患瘤动物总数在有效动物总数有效动物总数中所占的百分率l多发性：是指一个动物或一个器官出现多个肿瘤，肿瘤的多发性是化学致癌的特征致癌物评价程序致癌物评价程序l化学物的结构分析l短期致突变试验l短期动物致癌试验l长期动物致癌试验l肿瘤流行病学研究致畸作用及试验方法致畸作用及试验方法l 胚胎在发育过程中，由予各种原因造成器官形态结构的异常，称为畸形具有畸形的胚胎或胎仔，称为畸胎。
9、凡能引起胚胎发生畸形的化学物称为致畸物或致畸原。化学物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。广义的致畸作用还包括引起胚胎发育迟缓、功还包括引起胚胎发育迟缓、功能不全和胚胎死亡能不全和胚胎死亡。致畸物致畸物l化学致畸物：烷化剂、反应停烷化剂、反应停、激素、孕激素、抗代谢物、甲级汞等影响致畸作用的因素影响致畸作用的因素l化学物的理化性质l作用时机l剂量l遗传因素l其他因素致畸作用机制致畸作用机制l突变引起胚胎发育异常 化学物作用于生殖细胞，引起遗传基因突变所产生的子代畸形具有遗传性，作用于胚胎体细胞引起的畸形是非遗传性的l胚胎细胞代谢障碍 胚胎排除化学物的速度比母体慢，又因胎儿缺乏肝
10、微粒体酶，这致使某些致畸物在胚胎或胎儿期体内的生物转化过程与成人不同，以至于在胚胎内蓄积、造成胚胎中间代谢障碍和能量供应不足影响DNA复制、细胞分裂及组织分化过程而导致畸形l细胞毒性作用 化学致畸物进入胚胎后，表现出细胞毒性作用，引起细胞死亡或细胞增殖抑制，导致这些组织器官畸形l胚胎组织发育过程的不协调 胚胎正常结构的形成、依赖于多种细胞和组织在增殖、分化和生长上的高度协调。某些化学物对胚胎发育过程中的某些细胞或组织增殖分化过程的干扰，可造成各种细胞和组织之间在时间和空间关系上的紊乱，导致特定的组织、器官、系统的发育异常。致畸试验方法致畸试验方法l物种选择l剂量与分组l动物交配处理l致畸效应检
11、查物种选择物种选择l 致畸试验中动物的选择除参照一般毒性试验的原则外，还应选择孕期较短、每窝产仔数孕期较短、每窝产仔数较多、胎盘结构和代谢途径与人类接近较多、胎盘结构和代谢途径与人类接近的动物，其自然畸形发生率要低。一般首选大鼠其次是小鼠或家免。剂量的设置剂量的设置l 受试动物分为2-3个剂量组，另设阳性对照组和阴性对照组。先求出成年雌鼠的LD50，以15-13LD50为高剂量组，l100-130 LD50为低剂量组，若实际接触量作为低别量组；并以其10倍左右为高剂量组组动物的交配处理动物的交配处理l将性成熟的动物按雌雄1：1或2：1比例同笼交 配，并准确查知其受精日期。为此，每日清晨进行雌性动物雌性动物阴栓脱落阴栓脱落，以确认雌件动物是否受精 阴栓是排鼠精囊与凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，交配后能在雌鼠阴道外部出现。大鼠的阴拴极易脱落，次日可在笼下的载盘中发现。小鼠的阴拴不易脱落，在阴道内才能查到。染毒时间的控制染毒时间的控制l 由于致畸作用有明显的有明显的敏感期敏感期，所以给于受试物的时间极为重要，应在器官发生期的开始阶段。过早给予将影响受精卵着床，过迟则对发育成热的胚胎不能显示致畸作用、大鼠为受大鼠为受孕后第孕后第8天，小鼠为第天，小鼠为第5天，家免第天，家免第9天，猴第天，猴第10天天致畸效应检查致畸效应检查l母体检查l胎仔检查l迟发作用的检测
