1、课程安排 授课时间：1-6周 课程内容： 1、微生物药物的研究概况9月9日 2、微生物药物生产中的假设干重要问题9月16日 3、微生物药物作用机制9月23日 4、微生物的耐药性9月30日 5、新型微生物药物开发10月7日？ 6、微生物药物实践课程10月14日 成绩评定 A、出勤率20% B、课堂表现和成绩20% C、课程综合考察60%) 考核形式：课程论文 课程论文要求： 字数：3000-5000字 选题范围：与新型微生物药物相关的研究领域，尽可能具体和明确 格式：中文期刊发表综述的格式题目，中英文摘要，关键词，正文，参考文献课程综合考核专题一、 微生物药物的研究概况思考题1、什么是微生物药物
2、？2、微生物药物学主要研究什么？3、怎么样开展微生物药物研发？4、微生物药物学的开展方向是什么？ 从抗生素到微生物药物的开展概况 微生物药物的定义、组成及其研究内容 寻找微生物药物的根本途径和方法 微生物药物研究的热点及前沿问题主要内容I.从抗生素到微生物药物的开展概况 中国抗生素分布地图I-抗生素时代开创之前1876年，物理学家Tyndall曾记载过青霉菌属的一个菌株对细菌的生长有抑制作用，但他认为青霉菌的作用是阻碍细菌吸收氧气;1877年，Pasteur和Jonbert发现空气中某些细菌能够抑制炭疽杆菌的生长，但他们的注意力似乎集中在免疫学上面，而未注意到细菌间的拮抗作用。1885年，Ba
3、bes用固体培养基及液体培养基试验出一种微生物可以产生一种物质来阻止另一种微生物的生长。1887年，Garre记述了用明胶培养基检测拮抗性细菌的方法。1889年，Bouchard注意到铜绿假单胞菌有拮抗其他细菌的能力。II-抗生素时代的开创青霉素发现的前后19161940年1912年，从真菌中别离得到曲酸合成头孢类抗生素原料1913年，从真菌中别离得到青霉素酸1924年，报道白放线菌素和绿脓菌蓝素1927年，报道紫色杆菌素紫色色杆菌1929年，报道青霉素但不受重视1931年，发现橘霉素1939年，Dubos发现短杆菌素II-抗生素时代的开创青霉素的发现命名命名PenicillinPenicil
4、lin青霉素青霉素污染的青霉菌抑制周围葡萄球菌的生长污染的青霉菌抑制周围葡萄球菌的生长Alexander FlemingAlexander Fleming青霉素的发现Florey 和 Chain的作用 Florey是使青霉素重见天日的中心人物，他早期邀请Chain研究Fleming发现的具有抗菌作用的溶菌酶，从而熟悉了关于自然界的抗生物质的大量文献。青霉素的发现Florey 和 Chain的具体选择青霉素研究的原因 第一，Fleming已经指出青霉素对葡萄球菌有抗菌作用，他用纯度不到5%的粗品进展小鼠实验，取得了惊人的效果。而当时普遍使用的磺胺药对葡萄球菌相对来说已经没有作用。 第二，青霉素是
5、一个不稳定的化学物质，对作为生物化学家的Chain来说具有挑战性，他希望在青霉素提纯过程中有所创新。青霉素的发现希特利的功绩 由于由于ChainChain受溶菌酶的影响，认为青霉素也受溶菌酶的影响，认为青霉素也是一种蛋白质，故一直得不到纯品。希特是一种蛋白质，故一直得不到纯品。希特利创造了反萃取，得到了纯度很高的青霉利创造了反萃取，得到了纯度很高的青霉素。素。II-抗生素时代的开创实现青霉素工业化生产的主要奉献1 1、有机酸等浸没深层发酵技术已经成熟；、有机酸等浸没深层发酵技术已经成熟；2 2、用、用X-X-线照射进展青霉素菌种的诱变育种取线照射进展青霉素菌种的诱变育种取得了成功；得了成功；3
6、 3、使用玉米浆发酵使青霉素发酵单位有了很、使用玉米浆发酵使青霉素发酵单位有了很大的提高。大的提高。Selman Abraham Waksman 1888-1973III抗生素开展的黄金时代链霉素发现者生物化学家和微生物学家创造了一系列别离抗生素的方法和技术获得1952年诺贝尔生理和医学奖III-抗生素开展的黄金时代一是研究系统化一是研究系统化进展了有目的、有方案的科学进展了有目的、有方案的科学研究，并且所使用的方法也十分严谨；研究，并且所使用的方法也十分严谨；二是生产方法工业化二是生产方法工业化建立了大规模的抗生素制建立了大规模的抗生素制药工业，且产品到达一定的纯度以及有明确的作用药工业，且
7、产品到达一定的纯度以及有明确的作用和疗效；和疗效；三是传染病治疗方式的改变三是传染病治疗方式的改变推广了化学治疗的推广了化学治疗的范围并开辟了新的用途。范围并开辟了新的用途。 早期发现并在临床应用的一些重要的抗生素品种抗生素抗生素名称名称产生菌产生菌年份年份能被抑制的主要病原体能被抑制的主要病原体临床给药方法临床给药方法青霉素青霉素青霉菌青霉菌19291929革兰氏阳性细菌和部分阴性细菌革兰氏阳性细菌和部分阴性细菌注射、口服及外用注射、口服及外用灰黄霉素灰黄霉素青霉菌青霉菌19391939发癣菌及表皮癣菌发癣菌及表皮癣菌口服、外用口服、外用短杆菌素短杆菌素短杆菌短杆菌19391939革兰氏阳性
8、球菌革兰氏阳性球菌外用外用链霉素链霉素链霉菌链霉菌19441944革兰氏阳性及阴性细菌、结核杆革兰氏阳性及阴性细菌、结核杆菌菌注射、外用注射、外用氯霉素氯霉素链霉菌链霉菌19471947同上、立克次氏体及部分病毒同上、立克次氏体及部分病毒口服、外用口服、外用多粘菌素多粘菌素多粘杆多粘杆菌菌19471947革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌注射、外用注射、外用金霉素金霉素链霉菌链霉菌19481948革兰氏阳性及阴性细菌、立克次革兰氏阳性及阴性细菌、立克次氏体及部分病毒和原虫氏体及部分病毒和原虫口服、注射口服、注射新霉素新霉素链霉菌链霉菌19491949革兰氏阳性及阴性细菌、结核杆革兰氏阳性及阴性细菌、
9、结核杆菌菌局部局部制霉菌素制霉菌素链霉菌链霉菌19501950白念珠菌、酵母菌、阿米巴白念珠菌、酵母菌、阿米巴口服、局部口服、局部土霉素土霉素链霉菌链霉菌19501950同金霉素同金霉素口服、注射口服、注射粘菌素粘菌素细菌细菌19501950革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌口服、注射口服、注射四环素四环素链霉菌链霉菌19521952同金霉素同金霉素口服、注射口服、注射曲古霉素曲古霉素链霉菌链霉菌19521952白念珠菌、阴道滴虫、酵母菌白念珠菌、阴道滴虫、酵母菌口服、局部口服、局部红霉素红霉素链霉菌链霉菌19521952革兰氏阳性及阴性细菌、立克次革兰氏阳性及阴性细菌、立克次氏体及部分病毒氏体及部
10、分病毒口服口服碳霉素碳霉素链霉菌链霉菌19521952同上同上口服口服抗癌霉素抗癌霉素链霉菌链霉菌19531953吉田氏肉瘤细胞吉田氏肉瘤细胞注射注射竹桃霉素竹桃霉素链霉菌链霉菌19541954同红霉素同红霉素口服口服新生霉素新生霉素链霉菌链霉菌19551955革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌口服、注射口服、注射环丝氨酸环丝氨酸链霉菌链霉菌19551955革兰氏阳性细菌及结核杆菌革兰氏阳性细菌及结核杆菌口服口服两性霉素两性霉素B B链霉菌链霉菌19561956白念珠菌等白念珠菌等口服、注射口服、注射万古霉素万古霉素链霉菌链霉菌19561956革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌口服口服丝裂霉素丝裂霉素链霉
11、菌链霉菌19561956癌及革兰氏阳性细菌癌及革兰氏阳性细菌注射注射巴龙霉素巴龙霉素链霉菌链霉菌19561956革兰氏阳性细菌及结核杆菌革兰氏阳性细菌及结核杆菌注射注射卡那霉素卡那霉素链霉菌链霉菌19581958革兰氏阳性细菌及结核杆菌革兰氏阳性细菌及结核杆菌注射注射利福霉素利福霉素链霉菌链霉菌19591959革兰氏阳性细菌及结核杆菌革兰氏阳性细菌及结核杆菌口服、注射口服、注射 -内酰胺类、氨基糖苷类和大环内酯类抗生内酰胺类、氨基糖苷类和大环内酯类抗生素素及其衍生物仍是目前临床上应用的主要抗及其衍生物仍是目前临床上应用的主要抗生素生素思 考 题 根据抗生素作用机理，大致可以分为哪几类？作用于细
12、胞壁作用于细胞膜作用于DNA作用于蛋白质代谢类似物参见教材参见教材-抗生素产品树抗生素产品树P4IV-微生物药物的最新组成-微生物来源的其他生理活性物质 微生物来源酶抑制剂筛选的先驱梅泽滨夫Hamao Umezawa 发现卡那霉素上世纪50年代寻找抗肿瘤抗生素-sakamycin60年代酶抑制剂概念的提出 -抗蛋白酶、弹性蛋白酶抑制剂等1914-1986，JapanIV-微生物药物的最新组成1-已经用于临床的HMG-CoA复原酶抑制剂 开创了治疗高血脂症的新纪元 日本“生命科学与工业杂志引述医药界权威的评价，认为这种新型药物对治疗高血脂症是一场革命，其深远影响就如同青霉素治疗感染性疾病一样 普
13、伐他丁（Pravastatin）洛伐他丁（Lovastatin）乙酰CoA+乙酰乙酰CoA甲羟戊二酰CoAL-甲羟戊酸鲨烯羊毛胆固醇2,4-脱氢胆固醇7-脱氢胆固醇胆固醇胆固醇生物合成途径甲羟戊二酰CoA复原酶甲羟戊二酰CoA复原酶HMG-CoA 复原酶抑制剂的发现1976年远藤等从桔青霉中发现；1979年远藤等从红曲霉中发现，并命名为monacolin K；1980年Alberts从土曲霉中发现mevinolin洛伐他丁（Lovastatin）用于临床的HMG-CoA复原酶抑制剂销售情况 1987年美国默克公司率先上市销售洛伐他丁 IV-微生物药物的最新组成2-已经用于临床的alpha-葡萄
14、糖苷酶抑制剂 开创治疗糖尿病的新方法 阿卡波糖 伏格列波糖 米格列醇 乙格列酯阿卡波糖米格列醇IV-微生物药物的最新组成3-已经用于临床的免疫抑制剂 环孢菌素A：作用于T细胞，抑制其增殖和分化 他克莫司tacrolimus，FK-506 西罗莫司sirolimus；也称雷帕霉素，rapamycin 环孢菌素A他克莫司IV-微生物药物的最新组成4-已经用于临床的其他微生物药物 免疫增强剂：乌本美司 胰脂酶抑制剂：奥利司他 抗帕金森氏：溴隐亭 耐药肿瘤细胞外泵抑制剂：PSC833乌本美司II.微生物药物的定义、组成以及研究内容 抗生素的定义 “抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生
15、物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质。 - Selman Abraham Waksman 1942 1888-1973抗生素的一般定义 “抗生素是在卑微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的、是在微生物生命过程中产生的具有生物活性的次级代谢产物及其衍生物。 次级代谢产物：指微生物生长到一定阶段才产生的化学构造十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质在稳定期活菌数目到达顶峰期，细胞内大量积累代谢产物微生物药物的定义 由微生物包括重组微生物在其生命活动过程中产生的、在卑微浓度下具有生理活性的次级代谢产物及其衍生物。 这些具有生理活性的次级代谢产物包括：具有抗微
16、生物感染、抗肿瘤和抗病毒的所谓传统的抗生素,以及具有调节原核生物和真核生物生长、复制等生理功能的特异性酶抑制、免疫调节、受体拮抗、抗氧化等作用的化学物质。 p微生物药物学的研究内容：p产生菌的菌种选育p产物的别离纯化p微生物药物生物合成的代谢调控p作用机制和耐药机制的研究p寻找新微生物药物的方法和途径微生物药物的应用 临床医学 农业 畜牧业 食品保藏 工业 科学研究中在全球临床上所使用的药物总量中，约有30%40%来源于微生物产生的代谢产物或其半合成化合物，而在我国那么超过50%.发现微生物新药的情况 在20世纪40年代，仅发现了20种抗生素； 50年代为300400种； 60年代大约8001
17、000种； 至70年代已经发现了2500种抗生素；至那时起，大约每隔10年被发现的化合物数量翻倍； 至80年代约发现了5000种； 至90年代约发现了10000种； 至2000年已经发现了20000种抗生素类化合物； 至2002年，在各种文献和专利中发表的具有生理活性的微生物次级代谢产物数量已经超过22000种； 目前还以每年发现约500种新化合物的速度增加微生物学微生物学样品的采集样品的采集各种各样菌种的分离各种各样菌种的分离发酵培养以增加代谢产物多样性发酵培养以增加代谢产物多样性再次发酵再次发酵提高目标物的产量提高目标物的产量菌种分离菌种分离分子生物学、药理学分子生物学、药理学 作用靶选择
18、作用靶选择 筛选方法设计筛选方法设计/ /实施实施 高产出筛选系统高产出筛选系统 活性的鉴定活性的鉴定 有效性研究有效性研究 作用机制作用机制 化学化学 活性化合物的鉴定活性化合物的鉴定 理化属性理化属性/ /排重排重 分离分离/ /纯化纯化 结构阐明结构阐明微生物代谢产物筛选系统中各学科分支的配合与交叉微生物代谢产物筛选系统中各学科分支的配合与交叉菌种分离其 他筛选模型无活性或未能确定活性评 价发 酵初 筛分 离纯 化菌株选择预处理选择条件预筛（初步分类）全液过滤提取部分纯化产物（纯度：1015）层析结晶其他提取、吸附离子交换体外试验 色谱层析（体内初步试验和毒性）培养基和培养参数改变纯产物
19、（纯度：80100）物理化学试验（紫外、红外、高效液相、核磁）体内和更进一步体外试验毒性 阐明结构放大临床前研究其他活性办理专利临床试验有用的化合物的化合物复筛新的化合物发现微生物新药的根本途径过程过程适用的信息适用的信息菌株采集菌株采集地理和生态环境地理和生态环境菌株分离菌株分离生长特性、分离条件和形态学生长特性、分离条件和形态学菌株发酵菌株发酵在不同培养条件下的生长特性在不同培养条件下的生长特性样品制备样品制备粗略估计化合物的极性和酸碱度粗略估计化合物的极性和酸碱度初筛初筛在靶测定体系中的灵敏度、特异性和活性在靶测定体系中的灵敏度、特异性和活性再次发酵再次发酵重现性和稳定性重现性和稳定性扩
20、大生物试验扩大生物试验关于活性、特异性、生物和微生物活性的进一步信息关于活性、特异性、生物和微生物活性的进一步信息分离和纯化分离和纯化理化性质理化性质(如溶剂分配系数、如溶剂分配系数、TLC、HPLC以及光谱分析以及光谱分析等等)结构测定结构测定已知或新结构已知或新结构菌种分类菌种分类种的确定种的确定排重数据库的产生IV.微生物药物的热点及前沿问题寻找新微生物药物的主要途径建立新的筛选模型寻找微生物新药扩大微生物来源寻找微生物新药以微生物来源的生理活性物质为先导化合物，进展化学改造寻找效果更好的微生物药物应用次级代谢产物的生物合成原理，“创造微生物新药利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因
21、工程菌利用宏基因组技术发现新的活性物质或基因一建立新的筛选模型寻找微生物新药生物杀虫剂-Bt 伴孢晶体蛋白鳞翅目昆虫：斜纹夜蛾双翅目昆虫：埃及伊蚊直翅目昆虫：蝗虫线虫、螨类、原生动物抗癌活性二扩大微生物来源寻找微生物新药 稀有放线菌是发现微生物新药的重要源泉 黏细菌是一类值得关注的微生物资源 从植物内生菌中筛选微生物新药 从海洋微生物中筛选微生物新药三以微生物来源的生理活性物质为先导化合物进展化学改造寻找效果更好的微生物药物NCHSCCHCH3CH3HCCNHOCRCOOHONCHSCCHCH3CH3HCCH2NOCOOH青霉素分子的化学构造6APA的化学构造HOCH2CH2H3CCH2CHC
22、HCH2H3C(CH2)3CH2H3C(CH2)5CH2H2CCHCH2SCH2CH3OCH(CH2)2CH2NH2HOOC序号序号侧侧 链链 R R学学 名名俗俗 名名1 1对羟基苄青霉素对羟基苄青霉素青霉素青霉素X X2 2苄青霉素苄青霉素青霉素青霉素G G3 3戊烯戊烯22青霉素青霉素青霉素青霉素F F4 4戊青霉素戊青霉素青霉素二氢青霉素二氢F F5 5庚青霉素庚青霉素青霉素青霉素K K6 6丙烯巯甲基青霉素丙烯巯甲基青霉素青霉素青霉素O O7 7苯氧甲基青霉素苯氧甲基青霉素青霉素青霉素V V8 84 4氨基氨基4 4羧基羧基丁基青霉素丁基青霉素青霉素青霉素N N三以微生物来源的生理活
23、性物质为先导化合物进展化学改造寻找效果更好的微生物药物构造修饰始于上世纪50年代末：6-氨基青霉烷酸6-APA高潮时期是上世纪60年代后期：7-氨基头孢烷酸7-ACA各年代新上市的医用抗生素中合成品占有率三以微生物来源的生理活性物质为先导化合物进展化学改造寻找效果更好的微生物药物 构造修饰中可供选择的改造措施 1扩展抗菌谱：改变极性 2增强抗菌活性 3抑制耐药性 4改善药代动力学性能 5降低毒副作用 6增强稳定性 7适应制剂要求：调节溶解度 8副作用的利用：红霉素四应用次级代谢产物的生物合成原理，“创造微生物新药野生型产生菌独需型突变株AB正常途径某抗生素阻断变株A阻断变株BAB+BA+ABA
24、BA，B为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培养时添加的AB的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理诱变突变生物合成出发菌株的选择诱变处理阻断突变株筛选琼脂块法选择有生理活力的突变株无生理活力的突变株摇瓶复筛有生理活力的突变株无生理活力的突变株区段合成产物，连接酶等生化特性的研究有区段合成产物、无连接酶等活性的突变株有区段产物A有连接酶等活性的突变株有区段产物B有连接酶等活性的突变株发酵培养添加结构类似物A或B样品收集TLC、HPLC检测及制备结构检测突变生物合成的根本流程突变生物合成的根本流程菌种菌种抗生素抗生素
25、特殊营养特殊营养增补物增补物新抗生素新抗生素伊尼奥小单孢菌伊尼奥小单孢菌西梭霉素西梭霉素DOS链霉胺等链霉胺等突变霉素突变霉素1等等绛红小单孢菌绛红小单孢菌庆大霉素庆大霉素DOS链霉胺等链霉胺等2羟基羟基GM等等红霉素链霉菌红霉素链霉菌红霉素红霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鉴别未鉴别弗氏链霉菌弗氏链霉菌新霉素新霉素DOS链霉胍等链霉胍等杂交霉素杂交霉素A，B加利利链霉菌加利利链霉菌阿克拉霉素阿克拉霉素阿克拉酮阿克拉酮紫红霉酮等紫红霉酮等11羟基阿克拉霉羟基阿克拉霉素素A灰色链霉菌灰色链霉菌链霉素链霉素紫红霉酮等紫红霉酮等2脱氧链霉胍脱氧链霉胍strepto
26、mutin A卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素卡那霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基GM等等雪白链霉菌雪白链霉菌新生霉素新生霉素氨基香豆氨基香豆氨基香豆素同系物氨基香豆素同系物未鉴明未鉴明核糖苷链霉菌核糖苷链霉菌核糖霉素核糖霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基RSMC等等普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Omycaminosyl narbonolide龟裂链霉菌龟裂链霉菌巴龙霉素巴龙霉素DOS链霉胍链霉胍杂交霉素杂交霉素C巴龙链霉菌巴龙链霉菌尼可霉素尼可霉素尿嘧啶尿嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素尼可霉素Z等等突变生物合成产生的
27、新抗生素突变生物合成产生的新抗生素五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌1、抗生素基因工程常用载体及技术载体宿主系统质粒载体：pIJ101变青链霉菌、SLP1.2、SCP2(天蓝链霉菌)噬菌体载体：KC404温和噬菌体C31粘粒载体：pKC505宿主菌：链霉菌五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌B、基因工程宿主菌要求：1遗传背景清楚，不带内生质粒；2宿主菌的原生质体制备和再生必须要容易；3宿主菌相当于载体上的标记必须是“缺陷的；4宿主菌必须没有限制作用；5常用宿主菌株：变青链霉菌1326、TK24、TK54等五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌C、外源基
28、因导入方法A转化：质粒；需要聚乙二醇；电激法B转导五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌2、抗生素生物合成基因的克隆技术1将目的基因克隆到标准宿主中，然后检测个别基因产物要知道何种酶参与生物合成具有检测此酶的灵敏分析方法不需要了解抗生素生物合成途径的遗传信息五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌举例：直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非生产菌中 完整的放线紫红素生物合成基因克隆至一个非产生菌的小小链霉菌中，使小小链霉菌产生放线紫红素五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌3、基因工程技术在新抗生素研究中的应用1应用PCR技术筛选新抗生素：抗肿瘤抗生素筛选2基因
29、图谱和菌种分类3杂合抗生素的产生：聚酮类化合物生物合成酶五利用基因工程技术构建能产生微生物新药的基因工程菌4、利用基因工程技术改进微生物药物生产菌种1解除限速步骤，提高抗生素产量2阻断支路代谢，增加有效组分的含量3引入血红蛋白基因增加抗生素产量4引入抗性基因和调节基因，提高抗生素产量六利用宏基因组技术发现新的活性物质或基因转化宿主细胞环境样品总DNA提取DNA片段与适当载体连接宏基因组文库基于功能的鉴定基于序列的分析新功能基因的鉴定系统进化和功能分析p不同环境样品：极端环境，特殊生境等p 举例：南极土-抗肿瘤活性的基因海洋-聚酮类生物合成新途径讨论与课后作业1、你对微生物药物学中的哪一局部或者哪几局部内容更感兴趣，为什么？2、已学的各种生物技术在微生物药物学研究中的应用.
