1、实验专题模块五实验专题模块五 RNA的提取及定量的提取及定量PCR检测技术检测技术总总RNARNA的提取的提取反转录反转录实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR1感谢你的观看2019年8月29p RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。p 获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern杂交及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。p RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%85%；tRNA及核内小分子RNA占15%20%；mRNA仅占1%5%。从基因克隆、表达与诊断的目的出发，
2、目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。2感谢你的观看2019年8月29 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响后续RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度相对较大。在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶；另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。3感谢你的观看2019年8月29注意与要求：注意与要求： RNA操作应在专门
3、的区域进行，离心机、移液枪、试剂等均应专用。 操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。 实验使用枪头、离心管等塑料制品需均经由0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡过夜，然后灭菌，烘干。所有玻璃制品都必须在180烘烤2小时。尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。 配制溶液用的酒精，异丙醇等应使用RNA实验专用的试剂。4感谢你的观看2019年8月29 提取获得的组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，即可以利用逆转录酶进一步反转录成cDNA。再以cDNA为模板进
4、行PCR扩增，从而获得目的基因或检测目的基因的表达。 鉴于基因表达差异分析在临床实践中的广泛应用，本模块主要以食管癌细胞中目标基因如LCN2 (lipocalin 2) 转录表达水平的定量检测为例，旨在使学生能够系统地理解RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR检测过程，熟练使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案，并能够评价与实施这一方案。5感谢你的观看2019年8月29实验一实验一 总总RNA的提取的提取一、实验目的一、实验目的1. 了解并掌握总RNA提取的基本原理。2. 熟悉TRIzol法提取细胞总RN
5、A的具体操作过程。6感谢你的观看2019年8月29二、实验原理二、实验原理 总RNA的提取围绕着一条主线，即保护RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。围绕这条主线，要关注RNase-Free工作环境的建立、反应中RNase-Free条件的保持、RNA的保存等一系列细节问题。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即1）样品细胞或组织的有效破碎；2）有效地使核蛋白复合体变性；3）对内源RNA酶的有效抑制；4）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。7感谢你的观看2019年8月29TRIzol试剂提取总试剂提取总RNA该法是(异)硫氰酸胍
6、-酚氯仿一步法的改进方法，其产率与(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。它是以(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚而得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）
7、也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。8感谢你的观看2019年8月29三、三、 实验操作实验操作1. 样品处理：a 单层培养细胞：细胞接种在12孔培养板中，待细胞满度达90%以上或成融合状态时，弃去培养基，用1ml枪头将剩余培养基吸干，每个孔直接加入500l的TRIzol试剂裂解细胞（每10cm2面积加1ml试剂）将培养板放在三维迷你摇床上，室温（15-30）下充分裂解，至少需5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。将裂解液转移至1.5ml离心管中。（注：加TRIzol之前勿需洗涤细胞。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取
8、决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有基因组DNA污染。）9感谢你的观看2019年8月292. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。3. 4下，11000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。4. 把水相转移到新管中，加入0.5ml异丙醇（1ml TRIzol的用量），充分混匀后，室温放置10分钟，以沉淀水相中的RNA。5. 4下，11000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。弃去上清。6. 用75乙醇洗
9、涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。4不超过7500g离心5分钟，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，让残留乙醇挥发，时间约为5分钟。（注意不要完全晾干，否则会导致RNA的溶解性降低）10感谢你的观看2019年8月297. 加入10l DEPC水，盖紧盖子，轻弹管底，使RNA沉淀充分溶解，冰上放置10分钟。8. RNA含量测定：紫外分光光度法测量所提RNA的浓度与纯度，并登记在实验记录本上。剩余RNA保存于-80C冰箱中，备用。注：RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1c
10、m光径，用DEPC水稀释DNA样品n倍并以DEPC水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）= 40OD260读数稀释倍数(n)/1000（RNA纯品的OD260 /OD280的比值为2.0，故根据OD260 /OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质和基因组DNA污染；比值太高，则提示RNA有降解）11感谢你的观看2019年8月29实验二实验二 反转录反转录一、实验目的一、实验目的了解并掌握cDNA合成的基本原理及其具体操作过程。12感谢你的观看2019年8月29二、实验原理二、实验原理 反转录是进行基因工程过程中，人为
11、地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。13感谢你的观看2019年8月29 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。 DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA
12、为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3末端以53方向合成DNA。反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。 RNase H活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA 5端水解掉RNA分子。 DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。14感谢你的观看2019年8月29 反转录反应使用反转录酶，以随机引物、Oligo (dT)或基因特异性的引物起始。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种引物都可采用。 随机引物适用于任
13、何类型的RNA模板，但由于特异性低，主要用于单一模板的RT-PCR反应。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo (dT)只适用于具有PolyA尾巴的RNA，对无PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不适用。由于PolyA RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 基因特异性引物是根据模板序列设计的互补引物，特异性好，但仅适用于目的序列已知的情况。15感谢你的观看2019年8月29
14、 cDNA合成的模板可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物，无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无基因组DNA的污染。目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。本实验将以TaKaRa公司提供的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒（Code No. RR037A）为例进行介绍。16感谢你的观看2019年8月2917感谢你的观看2019年8月2918感谢你的观看2019年8月29三、三、 实验操作实验操作*1：Oligo dT Primer和Random 6 mers同时使用，可有效将全长mRNA反转录成cDNA.*2：10l反转录
15、反应体系可最大使用500ng的Total RNA。1. 反转录反应体系配制：按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。轻柔混匀后立即进行反转录反应。19感谢你的观看2019年8月292. 反应条件(注：上述反转录过程可在PCR仪中操作完成)第一步，37，15 min（反转录反应） 第二步，85，5 sec（反转录酶的失活反应）第三步，4注：1. 将得到的 RT 反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过PCR 反应体积的 1/10（V/V
16、）量。2. 合成的cDNA需要长期保存时，请于-20或更低温度保存。20感谢你的观看2019年8月29实验三实验三 实时荧光定量实时荧光定量PCR一、实验目的一、实验目的1. 了解并掌握实时荧光定量PCR的基本原理2. 熟悉使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案。21感谢你的观看2019年8月29二、实验原理二、实验原理 实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real-Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核
17、酸定量技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的cDNA的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中cDNA拷贝数最敏感、最准确的方法。22感谢你的观看2019年8月29 荧光定量检测系统由实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量试剂，通用电脑，自动分析软件等构成。设备由荧光定量系统和计算机组成（见图3-2），用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化
18、处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据（见图3-3）。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。23感谢你的观看2019年8月29图3-2 7500 型实时荧光定量PCR系统24感谢你的观看2019年8月29图3-3 扩增曲线对数图谱 线性图谱qPCR的扩增曲线有两种视图方式：线性图谱和对数图谱。25感谢你的观看2019年8月291基线的定义（见图3-4）是指在PCR
19、扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线。图3-4 基线对数图谱 线性图谱26感谢你的观看2019年8月292荧光域值（threshold）的设定（见图3-5）一般将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期。对数图谱 线性图谱图3-5 阈值27感谢你的观看2019年8月293Ct值的定义（见图3-6）在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经
20、历的循环数。图3-6 Ct值的定义28感谢你的观看2019年8月294Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（见图3-7）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图3-7如何使用Ct值计算结果29感谢你的观看2019年8月295荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。不同的仪器可选用的荧光标记组合不一（见图3-8）。图3-8 7500 型实时荧光定量PCR系统可使用
21、的荧光标记30感谢你的观看2019年8月291）TaqMan荧光探针（见图3-9）：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53 核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分
22、析的首选技术平台。31感谢你的观看2019年8月29图3-9 TaqMan荧光探针32感谢你的观看2019年8月292）SYBR荧光染料（见图3-10）：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。图3-10 SYBR荧光染料33感谢你的观看2019年8月29本实验将以TaKaRa公司提供的TB Green Fast qPCR Mix试剂盒（Code No. RR430B）为例进行介绍。34感谢你的观看2019年8月29 使用注意以下为
23、使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1. 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。试剂混合不均匀会造成反应效果不佳。(1) 请勿涡旋振荡混匀。(2) TB Green Fast qPCR Mix (2)在-20保存时，可能会产生白色或淡黄色的沉淀。可用手握缓慢溶解，或于室温短时间避光放置后，上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。(3) 沉淀会导致试剂组份不均匀，必须混匀后再使用。2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。3. 本制品中含有荧光染料TB Green，配制PCR 反应液时应避免强光照射。4. 反应液的配制、分装请一定使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。35感
24、谢你的观看2019年8月29三、三、 实验操作实验操作1. 建立Real-time PCR反应体系：于冰上溶解TB Green Fast qPCR Mix，cDNA模板，引物（LCN2和-actin）和RNase-free dH2O，混匀。依次在8联管内加入下列试剂（10 l反应体系）：*2：ROX Reference Dye II（50）比ROX Reference Dye（50）浓度低，使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 时，使用ROX Reference Dye II（50）。注：反应体系可随需要调整，反应液配制在冰上进行，多个样品同时操作时，
25、可以先配制一个Master Mix，再分装到各管。36感谢你的观看2019年8月292. 进行Real-time PCR反应PCR 反应条件第一步，预变性： 95，30 sec 第二步，PCR反应： 95，5 sec，60，34 sec，40 个循环。第三步，溶解曲线分析注：1. 选择所使用的荧光通道（FAM、ROX）; 2. 采用两步法PCR反应程序进行反应，当出现模板浓度过低引起非特异性扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，可尝试进行三步法PCR扩增反应。37感谢你的观看2019年8月293 将反应体系（8联管）置于荧光定量PCR仪中，设置相应的反应条件（注意
26、设置荧光收集），开始反应。定量PCR反应是在7500型实时荧光定量PCR-Life Tech（applied biosystems）系统上进行的。4反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线（是否具有特征性的三个增长阶段，见图3-11）和融解曲线；通过分析溶解曲线来判断反应的特异性（见图3-12），理想的溶解曲线是单峰型，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体或其它非特异扩增的存在。38感谢你的观看2019年8月29图3-11 正常扩增图3-12单一PCR产物的熔解曲线39感谢你的观看2019年8月295 实验数据的处理：Comparative Delta-delta Ct法法
27、Comparative Delta-delta Ct法是常用的一种相对定量方法，是基于荧光定量的数学计算模型的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率。其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。注：在使用该法展开实验前，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。
28、反之，如果M差值大于0.1，则需换用其它的相对定量方法。40感谢你的观看2019年8月29数据分析步骤：1）同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增2）在Excel软件计算（2 -Ct）：其中Ct目的基因Ct值看家基因Ct值；Ct值实验样品Ct对照样品Ct。最终结果以柱形图进行呈现（对照样品数值为1，实验样品数值为2 -Ct ）。ControlCt-geneCt-actinCtSampleCt-geneCt-actinCt-Ct2-CtPG-B1N129.2615.3513.91PG-B1T229.7116.8912.821.092.128740365例：2 -Ct = POWER(2, -C
29、t)41感谢你的观看2019年8月29四、预期结果四、预期结果 扩增曲线、溶解曲线、标准曲线42感谢你的观看2019年8月291. 到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。请尝试用你学到的相关知识，设计一个可能的实验方案。2. 荧光定量PCR被广泛用于H7N9人感染禽流感检测，请谈谈还有哪些常用的实验技术手段可应用于禽流感的检测。课堂分组讨论课堂分组讨论43感谢你的观看2019年8月2944感谢你的观看2019年8月29
