1、第三篇第三篇 遗传信息的传递遗传信息的传递前前 言言19581958年年Francis Crick Francis Crick 提出提出遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则19701970年年D BaltimoreD Baltimore对遗传信息传递的中心法则作出补充对遗传信息传递的中心法则作出补充复制转录翻译逆转录蛋白质RNADNA复制RNA蛋白质翻译第十一章第十一章 DNADNA的生物合成的生物合成19531953年年James WatsonJames Watson和和Francis Crick Francis Crick 提出提出DNADNA双螺旋结双螺旋结构模型，并推测构模型，
2、并推测DNADNA的半保留复制的半保留复制19581958年，年，MeselsonMeselson和和StahlStahl利用利用15N15N标记大肠杆菌标记大肠杆菌DNADNA，证，证明了明了DNADNA半保留复制半保留复制19631963年，年，CairnaCairna利用放射性自显影的方法，首次观察到利用放射性自显影的方法，首次观察到大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的复制。的复制。第一节第一节 DNADNA复制的一般规律复制的一般规律一、 DNADNA半保留复制半保留复制（一）概念（一）概念亲代DNA复 制（二）（二）DNADNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明1.1.
3、同位素标记技术同位素标记技术1515N NH H4 4ClCl2.2. 细菌培养技术细菌培养技术3.3. DNADNA提取技术提取技术4.4. 密度梯度离心技术密度梯度离心技术-1515N NH H4 4Cl Cl 1414NHNH4 4ClCl15N-DNA14N-DNA混合混合15N-DNA亲代亲代14N-DNA子子 代代1 2 3（三）（三）DNADNA半保留复制的意义半保留复制的意义-AGAACTTAG-TCTTGAATC-AGAACTTAG-TCTTGAATC-AGAACTTAG-TCTTGAATC-1.遗传的保守性是相对的遗传的保守性是相对的2. 遗传的变异性是绝对的遗传的变异性是
4、绝对的 DNADNA复制的一般特点复制的一般特点1.1. 亲代亲代DNADNA的两条链均作为模板的两条链均作为模板2.2. DNADNA的局部需解旋，尚需拓扑异构酶松弛超螺旋的局部需解旋，尚需拓扑异构酶松弛超螺旋3.3. DNADNA聚合酶以聚合酶以55到到33的方向合成新链的方向合成新链4.4. DNADNA聚合酶需聚合酶需RNARNA引物引物5.5. DNADNA的合成是半不连续的的合成是半不连续的6.6. DNADNA复制高度精确（复制高度精确（DNADNA聚合酶的较读功能）聚合酶的较读功能）7.7. DNADNA的合成非常迅速的合成非常迅速8.8. 线性线性DNADNA末端（端粒）的复
5、制需端粒酶参与末端（端粒）的复制需端粒酶参与二、二、DNADNA的双向复制的双向复制复制起点复制起点(origin)：是含有：是含有100200个碱基对的一段个碱基对的一段DNA复制叉复制叉（replication fork）:复制子复制子（replicon）:人的基因组可能有人的基因组可能有104105个复制子个复制子新链增长的方向新链增长的方向:5 3 三、三、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制领头链（领头链（leading chainleading chain）: :后随链（后随链（lagging chainlagging chain）: :冈崎片段：后随链合成的小片段冈崎片段：后
6、随链合成的小片段DNADNA四、四、DNADNA复制需要复制需要RNARNA引物引物RNARNA引物约引物约1010个核苷酸个核苷酸五、五、DNADNA具有高度保真性具有高度保真性 严格遵守碱基配对原则严格遵守碱基配对原则 DNADNA聚合酶对碱基的选择功能聚合酶对碱基的选择功能 DNADNA聚合酶的校读功能聚合酶的校读功能 细胞修复系统（碱基错配的发生率为细胞修复系统（碱基错配的发生率为1010-1-11010-2-2，DNA-polDNA-pol较读功能使之降为较读功能使之降为 1010-5-51010-6-6，复制后的，复制后的校正修复系统使之降为校正修复系统使之降为1010-10-10
7、1010-8-8 ）第二节第二节 参与真核生物参与真核生物DNADNA复制的有关酶及蛋白因子复制的有关酶及蛋白因子复制体系的组分复制体系的组分模板模板亲代双链亲代双链DNA底物底物dATP、dGTP、dCTP、dTTP多种酶多种酶拓扑异构酶、引物酶、拓扑异构酶、引物酶、DNA聚合酶、解螺旋酶、聚合酶、解螺旋酶、DNA连接酶、核酸酶连接酶、核酸酶H、盖内切核酸酶、盖内切核酸酶I多种蛋白因子多种蛋白因子 单链单链DNA结合蛋白、复制蛋白结合蛋白、复制蛋白A、复制、复制因子因子C、增殖细胞核抗原、增殖细胞核抗原真核真核DNA复制的有关酶类及蛋白因子复制的有关酶类及蛋白因子酶及有关蛋白因子酶及有关蛋白
8、因子功功 能能DNA聚合酶聚合酶/引发酶引发酶引发及后随链的部分合成引发及后随链的部分合成DNA聚合酶聚合酶主要的主要的DNA复制酶复制酶拓扑异构酶拓扑异构酶松弛松弛DNA超螺旋，有利于复制超螺旋，有利于复制解螺旋酶解螺旋酶解开解开DNA双螺旋双螺旋单链单链DNA结合蛋白及复制蛋白结合蛋白及复制蛋白A与单链与单链DNA结合，防止再形成双结合，防止再形成双链链复制因子复制因子C（RFC）参与滑动夹子的装配参与滑动夹子的装配增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）滑动夹，与合成的连续性有关滑动夹，与合成的连续性有关核酸酶核酸酶H（RNaseH）去除去除RNA引物引物盖内切核酸酶盖内切核酸酶I去除
9、去除RNA引物的最后一个核苷酸引物的最后一个核苷酸DNA连接酶连接酶连接冈崎片段及参与修复连接冈崎片段及参与修复一、一、DNADNA聚合酶聚合酶3 3 55 的聚合功能，即以的聚合功能，即以DNADNA为模为模板，催化新链板，催化新链3 3 ，5 5 - -磷酸二酯磷酸二酯键的生成。键的生成。DNADNA聚合酶不能将两个核苷酸聚合，聚合酶不能将两个核苷酸聚合，故需一段故需一段RNARNA因物因物3 3 55 外切核酸酶活性（较读功外切核酸酶活性（较读功能）能）CHOHCH2POHOPOOHOPHOOOHOOHOPOHOPHOOOHOOH聚合方向5 3 真核细胞真核细胞DNADNA聚合酶的类别、
10、细胞定位、性质及功能聚合酶的类别、细胞定位、性质及功能DNADNA聚合酶聚合酶PolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPolPol相对分子量（相对分子量（KDKD） 250 25036363838160160300300170170256256细胞内定位细胞内定位核核核核线粒体线粒体核核核核相关酶活性相关酶活性5 5 33 聚合酶聚合酶有有有有有有有有有有3 3 55 外切酶外切酶无无无无有有有有有有引发酶引发酶有有无无无无无无无无功能功能引 物 合引 物 合成 及 后成 及 后随 链 的随 链 的其 始 合其 始 合成成碱基切除碱基切除修复修复线粒
11、体线粒体DNADNA复制复制主要主要复制复制酶酶不清楚，不清楚，复制或复制或修复修复损伤旁损伤旁路修复路修复损伤损伤旁路旁路修复修复损 伤 旁损 伤 旁路修复路修复 A-G-A-T-C-C-G-C-T-T-A-A-C-G-C-G-T-T-A-T-A-T-C-A-C-G-C-G-C T-C-T-AGGCGAATTGCGCAATATAGTGCGCG5 3 3 5 二、引发酶（引物酶）二、引发酶（引物酶）引发酶与引发酶与DNADNA聚合酶聚合酶形成复合体。形成复合体。引发酶负责合成约引发酶负责合成约1010个核苷酸的个核苷酸的RNARNA引物。引物。它的底物为核苷三磷酸。它的底物为核苷三磷酸。在引物
12、产生基础上后，在引物产生基础上后， DNADNA聚合酶聚合酶负责聚合负责聚合15153030个核苷酸个核苷酸，它，它的底物为脱氧核苷三磷酸。的底物为脱氧核苷三磷酸。3 A -A -T -A -U -A -G -U -G -C -G -C -GRNA引物5 CCGCUUAACGCG5 3 三、拓扑异构酶三、拓扑异构酶（topoisomerasetopoisomerase）拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。性质。解链过程中，解链过程中，DNADNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。拓扑异构酶具有内
13、切核酸酶及拓扑异构酶具有内切核酸酶及DNADNA连接酶的性质连接酶的性质 类型：类型： 型拓扑异构酶：切割型拓扑异构酶：切割DNADNA双链中的一股，双链中的一股，并适时连接，不需并适时连接，不需ATPATP参与复制和转录参与复制和转录型拓扑异构酶：切割型拓扑异构酶：切割DNADNA双链，并适时连接，双链，并适时连接， 需需ATPATP，参与复制，参与复制作用：松弛超螺旋作用：松弛超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用四、四、 解螺旋酶解螺旋酶（helicasehelicase）作用是解开局部一小段双链作用是解开局部一小段双链DNADNA形成单链，利于形成单链，
14、利于DNADNA合成合成五、单链五、单链DNADNA结合蛋白结合蛋白（single- strand DNA single- strand DNA binding protein,SSBbinding protein,SSB）作用：作用：SSBSSB与单链与单链DNADNA结合，阻止已解链的结合，阻止已解链的DNADNA重重新形成双链，利于新形成双链，利于DNADNA合成合成六、增殖细胞核抗原六、增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA PCNA ）是是DNADNA聚合酶聚合酶的辅助的辅助蛋白质。蛋白质。PCNAPCNA的三个亚的三个亚基绕着基绕着DNADNA形成一个滑形成一个滑动
15、夹子动夹子,DNA,DNA聚合酶聚合酶附附着于滑动夹子上沿着于滑动夹子上沿DNADNA向前移动，进行复制。向前移动，进行复制。七、复制因子七、复制因子C C（RFCRFC）是一种装载因子，它帮助是一种装载因子，它帮助PCNAPCNA环状滑动夹子的装环状滑动夹子的装配。此因子作为配。此因子作为DNADNA聚聚合酶合酶和和之间的连系之间的连系物或纽带，有助于前导物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。链和后随链的同时合成。八、核酸酶八、核酸酶H H（RNaseHRNaseH）和盖内切核酸酶和盖内切核酸酶（FEN1FEN1）它们参与去除它们参与去除RNARNA引物的作用。引物的作用。 RNaseH
16、RNaseH降解降解RNARNA引物，留下引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端，由一个核苷酸连在冈崎片段的末端，由FEN1FEN1完成去除最后完成去除最后一个核苷酸。一个核苷酸。九、九、 DNADNA连接酶连接酶（ligaseligase）作用：催化两个作用：催化两个DNADNA片段间形成片段间形成3 3 ，5 5 - -磷酸二酯键磷酸二酯键而将它们连接在一起。而将它们连接在一起。AAGC GTTGCGACCTGTTCGCAACGCT GGACATPAMP+PPi ATPAMP+PPi 第二节真核生物第二节真核生物DNADNA的复制过程的复制过程一、一、DNADNA复制的起始复制的起始起点辨
17、认复合物起点辨认复合物（ORC）辨认复制的起始点序列（此）辨认复制的起始点序列（此序列含有由序列含有由11个核苷酸组成的保守序列：个核苷酸组成的保守序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T），）， ORC具有弱解旋酶活具有弱解旋酶活性的小染色体维系蛋白性的小染色体维系蛋白(MCM)再与之结合，产生复制再与之结合，产生复制叉，形成复制泡，单链叉，形成复制泡，单链DNA结合蛋白（复制蛋白结合蛋白（复制蛋白A）与单链与单链DNA结合，解旋酶再结合到复制泡上。结合，解旋酶再结合到复制泡上。与与DNA-pol结合的引发酶在起始位点合成约结合的引发酶在起始位点合成约10个核苷个核苷酸酸 的的RNA引物
18、，然后由引物，然后由DNA-pol再形成再形成1530个核苷个核苷酸的酸的DNA片段。片段。二、二、DNA链的延伸链的延伸 DNA聚合酶聚合酶/引发酶产生引发酶产生RNA-DNA后（大约后（大约40个核苷酸），个核苷酸）， RFC紧密结合到引物紧密结合到引物-模板接合处，模板接合处，DNA聚合酶聚合酶与模板与模板DNA脱离。脱离。 RFC负责组装负责组装PCNA滑动夹子，然后滑动夹子，然后DNA聚合酶聚合酶结合到结合到PCNA组成的滑动夹子上，完成冈崎片段的延伸，最终长度组成的滑动夹子上，完成冈崎片段的延伸，最终长度达达130-200个核苷酸。个核苷酸。 前导链引物合成后由前导链引物合成后由D
19、NA聚合酶聚合酶连续连续延伸延伸DNA 链，长度可达链，长度可达5-10kb。三、三、DNA复制的终止复制的终止RNA引物的水解：首先由引物的水解：首先由RNase H降解降解RNA引引物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。然后，由盖内切核酸酶除去最后一个核苷酸。然后，由盖内切核酸酶除去最后一个核苷酸。DNA大分子的形成：大分子的形成：DNA连接酶将相邻的两连接酶将相邻的两个个DNA片段连接起来，形成大分子片段连接起来，形成大分子DNA链。链。 pol复制叉前进方向3 5 引 发 酶 /Pol-5 复制因子复制因子C增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原前导链前
20、导链5 3 冈崎片段冈崎片段（130-200nt）5 3 RNaseH和侧翼核酸和侧翼核酸内切酶（内切酶（FEN1）polDNA连接酶连接酶后随链后随链四、端粒四、端粒DNA的复制的复制（一）端粒（一）端粒1.1.什麽是端粒？端粒是指真什麽是端粒？端粒是指真核染色体两末端的一种特核染色体两末端的一种特殊的膨大结构。殊的膨大结构。2.2.端粒的构成：端粒由染色端粒的构成：端粒由染色体末端体末端DNADNA和和DNADNA结合蛋白结合蛋白组成的复合物。组成的复合物。3.3.端粒的作用是（端粒的作用是（1 1）保护染）保护染色体末端色体末端DNADNA不被核酸酶降不被核酸酶降解。（解。（2 2）避免
21、染色体间的）避免染色体间的融合。融合。4.4. 几种生物端粒几种生物端粒DNADNA的重复序列的重复序列生生 物物序列序列四膜虫四膜虫CCCCAACCCCAA（BlacburnBlacburn & Gall,1978 & Gall,1978）尖毛虫尖毛虫CCCCAAAA(KlobutcherCCCCAAAA(Klobutcher et al ,1981) et al ,1981)鞭毛虫鞭毛虫CCCTA(LeCCCTA(Le Blancq Blancq et al,1991) et al,1991)酵母酵母CCACACACACCACACACA鼠鼠CCCTAA(KiplingCCCTAA(Kipl
22、ing & Cooke,1990) & Cooke,1990)人人CCCTAA(MoyzisCCCTAA(Moyzis et al,1998) et al,1998)5.5. 不同生物端粒不同生物端粒DNADNA的长度的长度生物生物长度长度酿酒酵母酿酒酵母245bp245bp395bp395bp尖毛虫尖毛虫20bp20bp小鼠小鼠5kb5kb80kb80kb大鼠大鼠长达长达150kb150kb人人约约15kb15kb精子细胞精子细胞 15kb15kb血细胞血细胞 12kb12kb6.6.端粒端粒DNADNA的结构的结构端粒端粒DNADNA有三个结构功能区：端粒相关序列、端粒重复序列和有三个结构
23、功能区：端粒相关序列、端粒重复序列和3 3 单链单链悬突（两个重复序列的长度）。不同物种的端粒悬突（两个重复序列的长度）。不同物种的端粒DNADNA长长度差别很大。重复序列长度也不一样。度差别很大。重复序列长度也不一样。 3 3 单链单链悬突可能是端悬突可能是端粒的一个普遍特征。粒的一个普遍特征。真核生物的端粒真核生物的端粒DNADNA序列相当保守，一般有序列相当保守，一般有5 58bp 8bp 串联重复组成，串联重复组成，特征是富含特征是富含G/CG/C，在，在3 3 端超出互补链端超出互补链12121616个核苷酸。个核苷酸。端粒相关序列端粒相关序列端粒重复序列端粒重复序列3 3 端悬突端
24、悬突7.端粒端粒DNADNA结合蛋白结合蛋白包括与包括与3 3 单链单链悬突特异结合的蛋白质和与端粒双链悬突特异结合的蛋白质和与端粒双链DNADNA结结合的蛋白质。端粒蛋白与端粒合的蛋白质。端粒蛋白与端粒DNADNA结合，保护大约结合，保护大约100bp100bp的双链和末端单链的双链和末端单链DNADNA。端粒相关序列端粒相关序列端粒重复序列端粒重复序列3 3 端悬突端悬突（二）端粒酶（二）端粒酶1.1.什麽是端粒酶？端粒酶是由什麽是端粒酶？端粒酶是由RNARNA和蛋白质组成的一种和蛋白质组成的一种很特殊的核蛋白复合物。很特殊的核蛋白复合物。2.2.端粒酶的作用：端粒酶端粒酶的作用：端粒酶R
25、NARNA含有与端粒含有与端粒DNADNA互补的序互补的序列，并具有逆转录酶的性质。端粒酶负责端粒列，并具有逆转录酶的性质。端粒酶负责端粒DNADNA合合成。成。U（三）端粒（三）端粒DNADNA复制复制-爬行模型爬行模型（四）端粒、端粒酶与衰老（四）端粒、端粒酶与衰老1.1. 通过对体内外细胞端粒平均长度研究，发现同一种细胞不同生通过对体内外细胞端粒平均长度研究，发现同一种细胞不同生长时期端粒长度不同，且端粒长时期端粒长度不同，且端粒DNADNA序列重复程度与细胞的寿命呈序列重复程度与细胞的寿命呈正相关。正相关。2.2. 人类细胞体外分裂时，通常细胞每分裂一次，端粒人类细胞体外分裂时，通常细
26、胞每分裂一次，端粒DNADNA序列丢失序列丢失约约50bp50bp200bp200bp，细胞停止分裂，处于静止状态。说明端粒，细胞停止分裂，处于静止状态。说明端粒DNADNA序列的缩短与细胞增殖受限有关。随着年龄的增加，细胞的连序列的缩短与细胞增殖受限有关。随着年龄的增加，细胞的连续分裂，端粒续分裂，端粒DNADNA逐渐缩短，甚至丢失，细胞老化并丧失增殖能逐渐缩短，甚至丢失，细胞老化并丧失增殖能力而死亡。力而死亡。3.3. 老年人的端粒老年人的端粒DNADNA长度明显短于年轻人。因此，端粒长度明显短于年轻人。因此，端粒DNADNA缩短是缩短是细胞衰老的普遍现象。原因可能是人体端粒酶的活性低。研
27、究细胞衰老的普遍现象。原因可能是人体端粒酶的活性低。研究发现，精子细胞和肿瘤细胞中的端粒酶活性极高。发现，精子细胞和肿瘤细胞中的端粒酶活性极高。二、线粒体二、线粒体DNADNA复制复制-D-D环复制环复制线粒体线粒体DNADNA有两个复制起有两个复制起点。第二个复制起点开点。第二个复制起点开始复制时，第一个复制始复制时，第一个复制起点已复制达全环的起点已复制达全环的2/3 2/3 ，并将外环取代出，并将外环取代出来。电镜下观察此结构来。电镜下观察此结构似似D D形，故称形，故称D D环复制。环复制。D D环复制时两条新链的起环复制时两条新链的起始时间不同，因此复制始时间不同，因此复制是不对称的
28、。是不对称的。第四节第四节 原核生物原核生物DNADNA的复制的复制.一、参与原核生物一、参与原核生物DNADNA复制的酶类及蛋白因子复制的酶类及蛋白因子原核生物（细菌）原核生物（细菌）真核细胞真核细胞功能功能DNA-Pol III（核心酶）（核心酶）Pol 主要合成酶主要合成酶蛋白蛋白拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构拓扑异构gyrase（旋转酶）（旋转酶）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构拓扑异构DnaB蛋白蛋白解旋酶（解旋酶（T抗原）抗原） 解双螺旋解双螺旋DnaC蛋白蛋白解旋酶（解旋酶（T抗原）抗原） 解双螺旋解双螺旋单链单链DNA结合核蛋白结合核蛋白复制蛋白复制蛋白A维持维持DNA单链状态单链状
29、态DnaG蛋白（引物酶）蛋白（引物酶）Pol /引发酶引发酶合成合成RNA引物引物Pol III的的亚基亚基增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原滑动夹滑动夹Pol III的的亚基复合物亚基复合物 复制因子复制因子C装载滑动夹装载滑动夹DNA 连接酶连接酶DNA连接酶连接酶I连接连接DNA片段片段DNA-Pol RNaseH、 FEN1 去除去除 RNA引物引物细菌（细菌（E.Coli） DNA聚合酶聚合酶分类分类主要功能主要功能Pol合成冈崎片段、合成冈崎片段、DNA修复、切除引物修复、切除引物Pol 参与参与DNA修复修复Pol 主要复制酶主要复制酶Pol 损伤旁路修复损伤旁路修复Pol 损伤旁路修
30、复损伤旁路修复原核生物（原核生物（E.coli）三种）三种DNA-pol的比较的比较DNA-pol（1955）DNA-pol (1970)DNA-pol （1971）肽链数目（条）肽链数目（条）1 2 22分子量（分子量（kD）109120250具有的酶活性具有的酶活性5 3 聚合酶活性聚合酶活性+3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性+5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 +-聚合速度（个核苷酸聚合速度（个核苷酸/分钟）分钟）10005010000在复制中的作用在复制中的作用切除切除RNA引物并引物并填补缺口、参与填补缺口、参与DNA损伤修复损伤修复参与参与DNA损伤修复损伤修复真正的真正的复
31、制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶I的结构的结构DNA聚合酶聚合酶的结构的结构二、原核生物二、原核生物（E.coliE.coli）DNADNA的复制过程的复制过程（一）复制的起始（一）复制的起始有一个复制的起点和一个复制的终有一个复制的起点和一个复制的终点。采取双向复制。复制起点有点。采取双向复制。复制起点有特殊的序列特殊的序列（一）复制的起始（一）复制的起始-引发体的生成引发体的生成（二）（二）DNADNA片段的延长片段的延长（三）复制的终止（三）复制的终止3355复制起始点复制起始点拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶：松弛超螺旋DnaADna A :辨认复制的起始点Dna B :解开双螺旋DnaBD
32、naCDnaGDna C :协助Dna B前移及解螺旋Dna G :负责合成RNA引物SSB单链DNA结合蛋白（SSB）：与单链DNA结合polSSB复制叉前进方向3 5 Dna B :解开双螺旋DnaBDnaCDnaGDna C :协助Dna B前移及解螺旋Dna G :负责合成RNA引物5 pol前导链前导链5 5 5 5 冈崎片段冈崎片段（1000-2000nt）后随链后随链DNA连接酶连接酶第五节第五节 反转录过程反转录过程一、逆转录的概念：是指以一、逆转录的概念：是指以RNARNA为模板，在逆转录酶的催化下合成为模板，在逆转录酶的催化下合成DNADNA的过程。的过程。二、逆转录酶具有
33、的酶活性：二、逆转录酶具有的酶活性：1.1.RNARNA依赖性依赖性DNADNA聚合酶活性：以聚合酶活性：以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA单链单链2.2.核糖核酸酶核糖核酸酶H H（RNaseHRNaseH）活性：水解模板）活性：水解模板RNARNA3.3.DNADNA依赖性依赖性DNADNA聚合酶活性：以合成的聚合酶活性：以合成的DNADNA单链为模板合成另一单链为模板合成另一条条DNADNA链链三、逆转录酶需要引物：三、逆转录酶需要引物：1.1.细胞内合成需宿主细胞细胞内合成需宿主细胞tRNAtRNA作为引物作为引物2.2.体外合成可人工合成引物体外合成可人工合成引物四、逆转
34、录过程四、逆转录过程cDNAcDNA（互补（互补DNADNA）: :指以指以RNARNA为模板生成为模板生成的双链的双链DNADNA。 逆转录的意义：可能与逆转录的意义：可能与细胞分化与胚胎发生有细胞分化与胚胎发生有关关 逆转录的应用：基因工逆转录的应用：基因工程中获得程中获得cDNAcDNAdNTPPPi53ACUGUAUCGUA53ACUGUAUCGUARNA依赖性DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性dNTPPPi-TGACATAGCATtRNA5-TGACATAGCATtRNA5DNA依赖性DNA聚合酶活性-TGACATAGCATtRNA553ACUGUAUCGUA五、致癌五、致癌RNARN
35、A病毒的致癌机理病毒的致癌机理前病毒学说前病毒学说. .第六节第六节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复一、一、 DNADNA损伤损伤（一）何谓（一）何谓DNADNA损伤？损伤？在某些理化因素的作用下，在某些理化因素的作用下，DNADNA结构发结构发生的任何改变都称为生的任何改变都称为DNADNA损伤。损伤。（二）（二）DNADNA损伤的形式损伤的形式碱基的更替、缺失、插入、链的断裂、碱基的更替、缺失、插入、链的断裂、链内或链间的交联、链内或链间的交联、DNADNA重排等。重排等。（三）损伤因素（三）损伤因素紫外线、电离辐射、烷化剂、碱基类紫外线、电离辐射、烷化剂、碱基类似物、修饰剂化学诱变
36、剂等似物、修饰剂化学诱变剂等二、基因突变二、基因突变（一）基因突变：基因突变是指（一）基因突变：基因突变是指DNADNA分子中碱基分子中碱基组成发生改变。组成发生改变。（二）突变类型（二）突变类型1.1.点突变（碱基错配）：是指点突变（碱基错配）：是指DNADNA分子中一个碱基的改变。分子中一个碱基的改变。包括转换和颠换包括转换和颠换2.2.插入突变：是指插入突变：是指DNADNA分子中插入多余的碱基。分子中插入多余的碱基。3.3.缺失突变：是指缺失突变：是指DNADNA分子中碱基的丢失。分子中碱基的丢失。4.4.三联体扩增：三联体扩增：（三）突变可自发发生和诱发发生（三）突变可自发发生和诱发
37、发生. .自发突变自发突变DNADNA复制过程中的碱基错配（碱基错配的发生率为复制过程中的碱基错配（碱基错配的发生率为1010-1-11010-2-2，DNA-polDNA-pol较读功能使之降为较读功能使之降为 1010-5-51010-6-6，复制后，复制后的校正修复系统使之降为的校正修复系统使之降为1010-10 -10 ）碱基的氨基碱基的氨基- -亚氨基异构体互变亚氨基异构体互变2.2.诱发突变：诱发突变：指各种引起指各种引起DNADNA损伤的因素损伤的因素所造成的突变。所造成的突变。当当DNADNA暴露与暴露与260nm 260nm 的紫外线时，的紫外线时，DNADNA链相邻的嘧啶碱
38、基可形成链相邻的嘧啶碱基可形成5 5，6 6双双键，产生嘧啶二聚体键，产生嘧啶二聚体TTTT、 TCTC或或CCCC，最常见为，最常见为TTTT二聚体。人皮肤二聚体。人皮肤细胞受紫外线照射形成二聚体的细胞受紫外线照射形成二聚体的可达可达5 510104 4/ /细胞细胞/ /小时。此外，紫小时。此外，紫外线还可引起外线还可引起DNADNA链间交联、链间交联、DNADNA与蛋白质交联、甚至断链。与蛋白质交联、甚至断链。（四）基因突变后果1.1.突变是生物进化和分化的分子基础。突变（特突变是生物进化和分化的分子基础。突变（特别是点突变），不一定就是有害突变别是点突变），不一定就是有害突变2.2.突
39、变是某些疾病的分子基础突变是某些疾病的分子基础三、三、DNADNA损伤的修复损伤的修复（一）（一） DNADNA损伤的修复的定义损伤的修复的定义在一定条件下，损伤的在一定条件下，损伤的DNADNA分子恢复正常的过程。分子恢复正常的过程。（二）修复方式：（二）修复方式：光修复、切除修复、重组修复、旁路修复和光修复、切除修复、重组修复、旁路修复和SOSSOS修复修复1.光复活酶直接修复嘧啶二聚体光复活酶直接修复嘧啶二聚体HNONORPRHNONOCH3CH3HNONORPRCH3NHNOOCH3UVUV照射照射光复活酶光复活酶300600nm2.2.切除修复切除修复最普遍的修复方式最普遍的修复方式
40、切除修复需要切除修复需要DNADNA特异内切酶、核酸外切酶、糖苷酶、特异内切酶、核酸外切酶、糖苷酶、DNADNA聚聚合酶和合酶和DNADNA连接酶的参与。包括单个核苷酸切除和核苷酸连接酶的参与。包括单个核苷酸切除和核苷酸片段切除修复。片段切除修复。 人类着色性干皮病人类着色性干皮病（xeroderma pigmentosis,XPxeroderma pigmentosis,XP）常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，毛细血管扩张，局限性萎缩，疣状增生，浅表毛细血管扩
41、张，局限性萎缩，疣状增生，浅表溃疡，最后可癌变。溃疡，最后可癌变。这种病人的这种病人的XPXP类基因（类基因（XPAXPA、XPBXPB、 XPCXPC、XPFXPF、XPG XPG ）有缺陷，导致）有缺陷，导致DNADNA损伤后的修复障碍。损伤后的修复障碍。3.重组修复重组修复 DNA-pol3 555553RecA5553 5RecARecA具有交换具有交换DNADNA链的功能链的功能，并具有内切酶活性，并具有内切酶活性replication53 555DNA-PolDNA-Pol DNA-ligaseDNA-ligase3 555RecBRecB、C CRecRec A A4.旁路合成修
42、复旁路合成修复5.SOS5.SOS修复修复诱导修复诱导修复SOSSOS修复是细胞修复是细胞DNADNA受到广泛损伤而难以复受到广泛损伤而难以复制的紧急情况下，细胞为求生存而出制的紧急情况下，细胞为求生存而出现的一种应急反应。此时，细胞需调现的一种应急反应。此时，细胞需调动其所有的修复系统进行修复。动其所有的修复系统进行修复。2020世纪世纪5050年代，年代，WeigleWeigle首次在首次在E .coliE .coli中中发现发现SOSSOS修复系统。修复系统。19731973年，年，RaelmanRaelman首次称为首次称为SOSSOS修复。修复。SOSSOS反应诱导的修复系统包括避免
43、差错修反应诱导的修复系统包括避免差错修复（光修复、切除修复和重组修复）复（光修复、切除修复和重组修复）和倾向差错修复。诱导产生缺乏校正和倾向差错修复。诱导产生缺乏校正功能的功能的DNADNA聚合酶，一方面进行修复，聚合酶，一方面进行修复，同时也容易造成碱基错配的机会而产同时也容易造成碱基错配的机会而产生新的损伤。但总的结果是细胞可以生新的损伤。但总的结果是细胞可以生存下去。生存下去。SOSSOS反应是由反应是由RecARecA 蛋白和蛋白和LexALexA阻遏物蛋白阻遏物蛋白相互作用引起的，相互作用引起的， LexALexA（22kD22kD）阻遏）阻遏物蛋白是许多基因的阻遏物。物蛋白是许多基
44、因的阻遏物。 RecARecA 蛋白是蛋白是SOSSOS反应的最初发动因子。反应的最初发动因子。 在在ATPATP存在时，存在时，RecARecA被损伤的被损伤的DNADNA激活而激活而表现出蛋白水解没活力，水解表现出蛋白水解没活力，水解LexALexA阻阻遏物蛋白，使与修复有关的基因开放，遏物蛋白，使与修复有关的基因开放，表达产物即可对损伤的表达产物即可对损伤的DNADNA进行修复。进行修复。 历史故事历史故事一一1958年，提出年，提出DNA复制为半保留复制复制为半保留复制 美国科学家美国科学家马修马修.梅塞尔梅塞尔(Matthew Meselson)于于1930年出生在科罗拉多州的丹佛。
45、他毕业于加年出生在科罗拉多州的丹佛。他毕业于加州工学院物理化学专业。毕业后留校，州工学院物理化学专业。毕业后留校，1976年到年到哈佛大学工作。哈佛大学工作。福兰克林福兰克林. .斯塔尔斯塔尔(Franklin Stahl)(Franklin Stahl)于于1929年出年出生于马萨诸塞州的波士顿。曾求学于哈佛大学及罗生于马萨诸塞州的波士顿。曾求学于哈佛大学及罗切斯特大学。切斯特大学。1955年至年至1958年在加州工学院工年在加州工学院工作，其后在密苏里大学工作一年。作，其后在密苏里大学工作一年。1970年受聘于年受聘于俄罗冈大学任教授。俄罗冈大学任教授。 1957年，梅塞尔和斯塔尔在加州工
46、学院工作期间，利用大肠杆菌研究遗传物质DNA。他们先将大肠杆菌放入含有N15的培养基中标培养，然后将这些大肠杆菌转移到N14的培养基中培养，最后把大肠杆菌经密度梯度离心。他们发现提取的DNA有三条带。它们分别为只含有N15的DNA，只含有N14的DNA，和既含有N15的DNA又含有N14的DNA。将含有N15的DNA又含有N14的DNA进行加热，DNA分为两半，一条是含有N15的DNA的重链，另一条是含有N14的DNA的轻链。他们得出的结论是新合成的DNA两条链，一条由遗传来的重链，另一条来自新合成的轻链。1958年，他们证实细胞分裂时，DNA的复制是半保留的。既DNA两条链解开，每条单链均成
47、为模板形成一条与之对应的新链，然后一同进入子细胞中。 二二. DNA聚合酶的发现：聚合酶的发现：20世纪50年代末到20世纪60年代初，科学家们对DNA 怎能执行它的遗传功能进行了大量的研究。1955年Kornberg 从E.Coli 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制打下了基础。为此，Kornberg 1959年获得诺贝尔奖。 亚瑟亚瑟.科恩伯格科恩伯格（Arthur.Kornberg）1918年3月出生在美国纽约。1941年23岁的他获得罗彻斯特大学医学博士学位，1960年和1962年获得法学和科学博士学位。1942年，在做了一年的实习医生后，科恩伯格的一篇关于“黄疸症”的论文引起了美
48、国国家卫生研究院（NIH）院长戴尔的注意。他被调到NIH生理学部营养学分部工作。一年后，他放弃了临床医学志愿，开始更新的工作。1947年，他开始组建NIH酶学与新陈代谢分部并兼任主任。1953年，科恩伯格来到华盛顿大学医学院，担任微生物系主任。科恩伯格是生物化学特别是酶学的专家。美 国 科 学 家 , Kornberg 1955年从E.Coli 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制打下了基础。为此，Kornberg 1959年获得诺贝尔奖。Arthur Kornberg从1950年起，科恩伯格等人开始寻找合成DNA和RNA的酶类。他们首先研究了核酸的基本成分，以及细胞如何制造这些组件，接着又
49、研究这些基本单元如何在酶的帮助下一步步的组装成DNA 和RNA。1955年，科恩伯格终于从大肠杆菌中分离出DNA聚合酶聚合酶，它可以忠实的复制DNA。DNA聚合酶的发现，为理解遗传机制以及现代DNA重组技术的发展作出了重要的贡献。科恩伯格及其同事奥乔亚共享1959年诺贝尔奖生理学及医学奖。三三.逆转录酶的发现逆转录酶的发现美国加州理工学院的教授戴维戴维和美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授侯活侯活于1970年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。于1975年获得诺贝尔奖。 巴尔的摩巴尔的摩(David Baltimore)(David Baltimore) 1938年3月7日出生于美国
50、纽约市。在中学时代就对生物学产生了浓厚的兴趣。曾有一年，他在实验室里度过整个夏天。1956年，他进入宾夕法尼亚州斯沃思莫尔大学学习。他不但在生物学方面取得优异的成绩，还获得了文学学士学位。并且在化学方面也有一些独到之处。大学毕业后他到麻省理工学院，在著名的分子生物学家Zingr的指导下从事研究工作。在导师的指导下，他废寝忘食地工作，同时攻读哲学博士学位。1964年，他转入阿尔伯特-爱因斯坦医学院从事研究，接着又学习动物病毒专业。后来，他到加利福尼亚的一个研究所任副研究员。同后来获得诺贝尔奖的杜尔贝克博士一起工作，得到很大教益。1968年，他在麻省理工学院任付教授，并开始对肿瘤病毒进行研究。19
