1、第十三章第十三章 DNA的生物合成的生物合成 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和DNA的的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。要求同学们掌握：绍。要求同学们掌握： 1.参与参与DNA复制的主要酶类和蛋白质因子复制的主要酶类和蛋白质因子; 2.DNA的复制过程的复制过程; 3.反转录合成反转录合成DNA。遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储生物的遗传信息以密码的形式储
2、存在存在DNA分子上，表现为特定的核苷分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过通过DNA复制复制把亲代细胞所含的遗传把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过传信息通过转录转录传递给传递给RNA，再由，再由RNA通过通过翻译翻译转变成相应的蛋白质多转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来表现
3、出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的病毒能以自己的RNA为模板为模板复制复制出新出新的病毒的病毒RNA，还有一些，还有一些RNA病毒能以病毒能以其其RNA为模板合成为模板合成DNA，称为，称为逆转录逆转录这是中心法则的补充。这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的
4、理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目目 录录第一节第一节 DNADNA的复制的复制第二节第二节 逆转录作用逆转录作用第三节第三节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复第四节第四节 DNADNA突变突变 第一节第一节 DNA的半保留复制的半保留复制一一、概念概念和和实验依据实验依据二二、DNA聚合反应有关的酶类聚合反应有关的酶类及条件及条件三、三、DNA复制的特点复制的特点四、四、原核细胞原核细胞DNA的复制过程的复制过程五、五、DNA复制的忠实性复制的忠实性六、六、真核细胞真核细胞DNA的复
5、制的复制 DNA的半保留复制的概念的半保留复制的概念 DNA在复制时，两条在复制时，两条链解开分别作为模板，在链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组模板链互补的新链，以组成新的成新的DNA分子。这样新分子。这样新形成的两个形成的两个DNA分子与亲分子与亲代代DNA分子的碱基顺序完分子的碱基顺序完全一样。由于子代全一样。由于子代DNA分分子中一条链来自亲代，另子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制复制方式称为半保留复制。DNA的半保留复制实验依据 1958
6、1958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素示踪标记加密度示踪标记加密度梯度离心技术梯度离心技术实实验验, ,证明了证明了DNADNA是是采取半保留的方采取半保留的方式进行复制式进行复制.15N DNA14N- 15N DNA14N DNA14N- 15N DNA 出现上述三条带结果与半保留复制模式假设出现上述三条带结果与半保留复制模式假设是完全符合的。是完全符合的。复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验实验) 将将3H-胸苷标记大肠杆菌胸苷标记大肠杆菌DNA，经过，经过近两代近两代的时间，的时间，3
7、H-胸苷掺入大肠杆胸苷掺入大肠杆菌菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为
8、标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。微米。ABC环状环状DNA的复制的复制 ABC二、二、DNADNA聚合反应有关的酶类及条件聚合反应有关的酶类及条件 底物底物模板模板拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶解旋酶单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白引发酶引发酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶 DNA复制以四种脱氧核糖核苷酸为底物，复制以四种脱氧核糖核苷酸为底物，即即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi （一）底物（一）底物 聚合反应机理聚合反应机理5 3 OPGOPA模板链CTA35引 物3355OHOPG
9、OPAOOHTP模板链CTA35引 物333555POOHTPP35PPi DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲复制是模板依赖性的，必须要以亲代代DNA链作为模板。链作为模板。 亲代亲代DNA的两股链解开后，可分别作为的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。模板进行复制。（二）模板（二）模板 拓扑异构酶是一类可改变拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。在拓扑性质的酶。在复制时，复制时，随着复制叉的前进，将引起整个分子非随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。无法前进。 拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引
10、入负超螺拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。的合成。 有有和和两种类型两种类型 （三）拓扑异构酶（三）拓扑异构酶（topoisomerase） 拓扑异构酶是一类可改变拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。在拓扑性质的酶。在复制时，复制时，随着复制叉的前进，将引起整个分子非随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。无法前进。 拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及旋，有利
11、于复制叉的行进及DNA的合成。的合成。 有有和和两种类型两种类型 首先在大肠杆菌中被发现，它可使首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。需供给能量。 另外，另外，DNA复制时负超螺旋的消除，复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶亦由拓扑异构酶来完成，但它对正超螺来完成，但它对正超螺旋无作用。旋无作用。型拓扑异构酶型拓扑异构酶 由两个由两个A亚基和两个亚基和两个B亚基组成，即亚基组成，即A2B2。它能使。它能使DNA的两条链同时发生断的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉
12、前进带来的扭曲张力时，需要由制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。提供能量。 两种拓扑异构酶在两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和复制、转录和重组中均发挥重要作用重组中均发挥重要作用。型拓扑异构酶型拓扑异构酶 DNA解旋酶解旋酶(helicase)（解链酶）（解链酶） 功能功能：DNA的双螺旋解链（解的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，双链），解开一对碱基，需需2分子分子ATP， 作用点作用点：DNA上局部单链处，上局部单链处，向双链方向解链。向双链方向解链。 种类：种类：E.coli有四种解螺旋酶，有四种解螺旋酶，I、II、III和和rep蛋白。蛋白。 I、II、III中任一
13、种沿模板中任一种沿模板5-3 方向移方向移动，动，rep蛋白沿模板蛋白沿模板3 -5方向方向移动。移动。5353rep 要将要将DNA双链解开，主要依赖于双链解开，主要依赖于DNA解旋酶（也称为解链酶），还需要参与起解旋酶（也称为解链酶），还需要参与起始反应的多种蛋白因子，如始反应的多种蛋白因子，如DnaA。 DnaA能够识别大肠杆菌复制原点能够识别大肠杆菌复制原点OriC富含富含A/T的的3个个13个个bp的重复序列区，使双的重复序列区，使双链链DNA连续变性，启动解链过程。连续变性，启动解链过程。 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding protein
14、, SSB）又称螺旋降稳蛋白（）又称螺旋降稳蛋白（HDP）。能）。能够与单链够与单链DNA结合的蛋白质因子，其作用为：结合的蛋白质因子，其作用为： 使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳单链能够稳定存在，即稳定单链定单链DNA，便于以其为模板复制子代，便于以其为模板复制子代DNA；防；防止止DNA链重新结合。链重新结合。 保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 （五）单链（五）单链DNA结合蛋白结合蛋白 分子量约为分子量约为60kDa的单肽链，每个细胞的单肽链，每个细胞约有约有50-100个分子，该酶单独存在时活性低，个分子，该酶单独存在时活性低，
15、只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，这种复合体称为引发体体时才有活性，这种复合体称为引发体（primosome）。）。（六）引发酶（六）引发酶 引物酶本质上是一种依赖引物酶本质上是一种依赖DNA的的RNA聚合聚合酶（酶（DDRP），该酶以），该酶以DNA为模板，聚合为模板，聚合一段一段RNA短链引物短链引物(primer)，以提供自由，以提供自由的的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。 合成的引物是长约合成的引物是长约5-100个核苷酸的个核苷酸的RNA。一旦一旦RNA引物合成，就可以由引物合成，就可以由DNA聚合
16、酶聚合酶在它的在它的3-OH上继续催化上继续催化DNA新链的合新链的合成。成。 DNA聚合酶是以聚合酶是以DNA为模板，催化底物（为模板，催化底物（dNTP）合成合成DNA的酶类，普遍存在于生物体内。它们的的酶类，普遍存在于生物体内。它们的作用方式基本相同，都需要作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板、模板DNA和引物，在和引物，在DNA模板指导下，催化底物加到模板指导下，催化底物加到引物的引物的3-OH上，形成上，形成3，5磷酸二酯键，由磷酸二酯键，由53方向延长方向延长DNA链。引物是链。引物是DNA合成所必需合成所必需的。的。（七）（七）DNA聚合聚合酶酶 在大肠杆菌中，目前发
17、现的在大肠杆菌中，目前发现的DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）有三种：）有三种： DNA聚合酶聚合酶（pol ） DNA聚合酶聚合酶（pol ） DNA聚合酶聚合酶（pol ） 这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与酶。参与DNA复制的主要是复制的主要是pol 和和pol 。 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶由一条分子量为由一条分子量为101kDa的单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。每的单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。每个大肠杆菌细胞约有个大肠杆菌细胞约有400个分子的个分子的DNA聚合酶聚合酶。 Arthur Korn
18、berg于于1957年分离出来，因此年分离出来，因此获获得得1959年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。 分离工作十分艰巨，用了分离工作十分艰巨，用了100kg细菌分离到细菌分离到500mg的纯酶（的纯酶（polymerase ），或称），或称Kornberg酶。它是一个多功能酶。酶。它是一个多功能酶。 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶的功能如下：的功能如下：53聚合酶活性聚合酶活性，即当底物和模板存在时，即当底物和模板存在时，DNA聚合酶聚合酶可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的3-OH末端的多核苷酸链上，在末端的多核苷酸链上，在37条件下，每分子条件下，每分子DNA
19、聚合酶聚合酶每分钟可以催化大约每分钟可以催化大约1000个脱氧核个脱氧核苷酸的聚合；苷酸的聚合；53外切酶活性外切酶活性，它可以及时切除复制起始合成，它可以及时切除复制起始合成的的RNA引物；引物；35外切酶活性外切酶活性，起校对功能，它可以切除聚合，起校对功能，它可以切除聚合上去的错误的核苷酸，从而可使复制的忠实性提上去的错误的核苷酸，从而可使复制的忠实性提高高1000倍。倍。DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应5 RNA引物引物子链3 355335533 5 模板链DNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺
20、口5 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点 DNA聚合酶的校对作用DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶为多亚基酶，由分子量约为为多亚基酶，由分子量约为88kDa的多肽链组成，其活力比的多肽链组成，其活力比DNA聚合酶聚合酶高，每分钟可高，每分钟可催化约催化约2400个核苷酸的聚合，每个大肠杆菌细胞约含个核苷酸的聚合，每个大肠杆菌细胞约含有有100个分子的个分子的DNA聚合酶聚合酶。 功能：功能：53聚合酶活性聚合酶活性 35核酸外切酶活性核酸外切酶活性 但无但无53外切酶活性。外切
21、酶活性。 它也只是修复酶，而非真正的复制酶。它也只是修复酶，而非真正的复制酶。DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶被认为是真正的被认为是真正的DNA复制酶复制酶(replicase)，全酶由，全酶由、等等10种亚基组成，也含有锌原子，分子量大种亚基组成，也含有锌原子，分子量大约约900kDa，以二聚体起作用。，以二聚体起作用。亚基主要有亚基主要有53聚合活性，聚合活性，亚基具有亚基具有35核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，2个个亚基充当亚基充当“滑动夹子滑动夹子”，它通过，它通过复合物夹子载复合物夹子载体组装到体组装到DNA上。上。2个个亚基围绕双螺旋形成一个亚基围绕双螺旋形成一个环，以利于聚
22、合酶沿着模板滑动。环，以利于聚合酶沿着模板滑动。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化 DNA聚合酶聚合酶：强催化活性、忠实性、：强催化活性、忠实性、持续性。持续性。 DNA聚合酶聚合酶可连续催化几千个磷酸可连续催化几千个磷酸二酯键的形成。所以它催化的合成速度达二酯键的形成。所以它催化的合成速度达到了体内到了体内DNA合成的速度。合成的速度。 它还有它还有35核酸
23、外切酶活性，使得复核酸外切酶活性，使得复制的忠实性由制的忠实性由710-6提高至提高至510-9，但，但DNA聚合酶聚合酶无无53外切活性。外切活性。大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸核酸外切酶作用外切酶作用5 -3 核酸核酸外切酶作用外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+-50比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶切除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶
24、年发现聚合酶 和和，它们涉及，它们涉及DNA的错误倾的错误倾向修复（向修复（errooune repair） DNA DNA连接酶连接酶(DNA ligase(DNA ligase) )可催化两段可催化两段DNADNA片段片段之间磷酸二酯键的形成，使两段之间磷酸二酯键的形成，使两段DNADNA连接起来。连接起来。 DNADNA连接酶催化的条件是：连接酶催化的条件是： 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而另一段，而另一段DNADNA片片段具有段具有5-Pi5-Pi基；基； 未封闭的缺口位于双链未封闭的缺口位于双链DNADNA中，即其中有一条中，即其中有一条链是完整的；链是
25、完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由需要消耗能量，在原核生物中由NADNAD+ +供能，供能，在真核生物中由在真核生物中由ATPATP供能。供能。（八）（八） DNADNA连接酶连接酶连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链三、三、DNADNA复制的特点复制的特点 复制起始点复制起始点 复制终止点复制终止点 需要引物需要引物 复制的方向性复制的方向性 半不连续复制半不连续复制
26、 DNADNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序（特定的位点）的片段，即有特定核苷酸排列顺序（特定的位点）的片段，即复制起始点（复制原点复制起始点（复制原点 oriori）。）。 在在DNADNA复制时，两条亲代链在复制起点处部分分开，复制时，两条亲代链在复制起点处部分分开，此时形成一种动态的此时形成一种动态的Y Y字型结构，称之复制叉，即字型结构，称之复制叉，即复制正在发生的部位，同时进行着解链和合成。复制正在发生的部位，同时进行着解链和合成。 在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核在原核生物中，复制起始点通常为一个，而
27、在真核生物中则为多个。生物中则为多个。 1. 1. 复制起始点复制起始点在环形在环形DNA中，整个结构象字母中，整个结构象字母 在电镜下观察犹如一在电镜下观察犹如一只眼睛，称为复制眼。对只眼睛，称为复制眼。对于环状于环状DNA，复制眼使其，复制眼使其成为成为结构。结构。n真核生物染色体真核生物染色体DNA复制方式复制方式n 多复制子复制，多复制子复制，即即DNA上先形成多上先形成多个复制眼，双向复个复制眼，双向复制。制。“眼眼”扩大互扩大互相相连，形成相相连，形成“大大眼睛眼睛”最后完成整最后完成整个个DNA的复制，形的复制，形成两个成两个DNA分子。分子。 原核生物复制起始点的结构原核生物复
28、制起始点的结构 E.coliE.coli的复制起点的复制起点OriOri大约长大约长245bp245bp，包括，包括两个关键序列两个关键序列：13bp13bp的序列和的序列和9bp9bp序列序列, ,它它是决定和控制是决定和控制E.coliE.coli染色体复制的唯一片染色体复制的唯一片段。段。 13bp13bp序列区，每一个顺序都由序列区，每一个顺序都由GATCGATC开始，开始，富含富含A A和和T T，有助于螺旋解开，控制复制何，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。时开始。 9bp9bp重复序列，重复出现重复序列，重复出现4 4次，能与起次，能与起始蛋白始蛋白dnaAdnaA特异结合，当特
29、异结合，当dnaAdnaA蛋白（约蛋白（约2020种）结合于种）结合于oriori的的4 4个部位上时复制开始。个部位上时复制开始。 dnaAdnaA蛋白（一种专一的蛋白）和蛋白（一种专一的蛋白）和oriori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaAdnaA蛋白与启动解链有关蛋白与启动解链有关,dnaA,dnaA蛋白是起始的蛋白是起始的关键成分。关键成分。大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋
30、白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型2. 2. 复制终止点复制终止点 在复制子的末端，由一段特殊的序列，称为复制在复制子的末端，由一段特殊的序列，称为复制的终止位点（的终止位点（terter），完成复制的终止），完成复制的终止 。 在环型在环型E.coli的染色体双向复制中，复制的终止位的染色体双向复制中，复制的终止位点是在两个复制叉的会合处。点是在两个复制叉的会合处。 由一个复制起始点进行到终点结束，完成整个染由一个复制起始点进行到终点结束，完成整个染色体色体DNA分子的复制，
31、即复制单位。分子的复制，即复制单位。DNA复制单复制单位亦称为复制子（重点概念）。位亦称为复制子（重点概念）。 一个复制子只含有一个专一的复制起点和一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次胞周期只复制一次( (真核真核) )。 原核生物染色体和质粒都是独立（只有单原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。子组成。3. 需要引物需要引物 参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一聚合酶，必须以一段具有段具有3端自由羟基
32、（端自由羟基（3-OH）的）的RNA作作为引物为引物(primer)，才能开始聚合子代才能开始聚合子代DNA链。链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为引物的大小，在原核生物中通常为510个核苷酸个核苷酸，RNA引物的碱基顺序，引物的碱基顺序，与其模板与其模板DNA的碱基顺序相配对。的碱基顺序相配对。 DNARNA引物AUTOH5 5每一DNA片段都有自己的RNA的引物 复制正在发生的位点（复制叉）35 3A 单向复制单向复制：即只形成一个复制叉（：即只形成一个复制叉（replication fork） 双向复制双向复制：即形成两个复制叉。如：即形成两个复制叉。如E.coliDNA等。等。2
33、.都是都是5 33 方向合成方向合成1. 1. 单向复制单向复制, ,也可以是双向复制也可以是双向复制 4. 复制的方向性复制的方向性DNA的双向和单向复制的双向和单向复制环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的Q结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制5. 半不连续复制半不连续复制 复制过程中，催化复制过程中，催化DNADNA合成的合成的DNADNA聚合聚合酶只能催化核苷酸从酶只能催化核苷酸从5 5 33 方向合成，以方向合成，以3 3 5 5 链为模板时，新生的
34、链为模板时，新生的DNADNA以以5 5 33 方向连续合成；而以方向连续合成；而以5 5 33 为模板只能合为模板只能合成若干反向互补的成若干反向互补的冈崎片段冈崎片段，这些片段再，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续复制。相连成完整的新链，故称半不连续复制。 日本科学家日本科学家OkazakiOkazaki（冈崎）（冈崎）认为复制时复制叉向认为复制时复制叉向前移动，留下两条单链分别做模板，一条是前移动，留下两条单链分别做模板，一条是35方方向，以它为模板合成的新链是向，以它为模板合成的新链是53方向，是连续的，方向，是连续的，称为称为前导链前导链（leading strand）；）；
35、而另一条模板链是而另一条模板链是53方向，以它为模板，合成方向，以它为模板，合成的新链是不连续的的新链是不连续的DNA片段，称作片段，称作冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragment）。）。 由多个冈崎片段连接而成的这条新的子代链，称由多个冈崎片段连接而成的这条新的子代链，称为为滞后链滞后链(lagging strand)。 前导链和随后链前导链和随后链随后链随后链前导链前导链冈崎片段冈崎片段复制叉前进的方向复制叉前进的方向在一个复制叉内，两条新链的合成都在一个复制叉内，两条新链的合成都是是5353方向。方向。 四、原核细胞四、原核细胞DNADNA的复制过程的复制过程复制的起始复制的起始
36、复制的延伸复制的延伸复制的终止复制的终止1. DNA双螺旋的解开双螺旋的解开 (1) 在大肠杆菌中，解链酶在复制叉内解在大肠杆菌中，解链酶在复制叉内解开亲代双螺旋开亲代双螺旋; (2) 分开的双链再和分开的双链再和SSB结合，防止链内结合，防止链内退火重新复性成为双链，使局部解开的两条退火重新复性成为双链，使局部解开的两条单链可以作为复制模板。单链可以作为复制模板。 （一）复制的起始（一）复制的起始 (3) 拓扑异构酶拓扑异构酶II作用作用 不论线状或环状不论线状或环状DNA分子，局部解链会分子，局部解链会导致超螺旋应力的增加，阻碍解链的前进。导致超螺旋应力的增加，阻碍解链的前进。因此必须放出
37、超螺旋应力。在大肠杆菌中是因此必须放出超螺旋应力。在大肠杆菌中是由拓扑异构酶由拓扑异构酶II，即旋转酶切开环状超螺旋，即旋转酶切开环状超螺旋的两股，释放出超螺旋应力，而后再封口，的两股，释放出超螺旋应力，而后再封口，除去环状除去环状DNA分子中的超螺旋。分子中的超螺旋。2. RNA引物的合成引物的合成 在合成在合成DNA链之前必须有一种引物。链之前必须有一种引物。引物就是在引物就是在DNA模板链上装配的一小段模板链上装配的一小段互补互补RNA，而末端有一个游离的，而末端有一个游离的3-OH。 DNA聚合酶只能把底物（聚合酶只能把底物（dNTP）转）转移到引物游离的移到引物游离的3-OH上去。上
38、去。 （二）复制的延伸（二）复制的延伸1. 半不连续复制半不连续复制(semicontinuous replication) （1）DNA酶酶作用作用 （2）在引物上加入底物）在引物上加入底物 dNTP （3）方向）方向 5 3（4）半不连续性复制）半不连续性复制先导链与后随链的矛盾如何解决？先导链与后随链的矛盾如何解决？ 根据计算，每一复制叉仅含根据计算，每一复制叉仅含1个个DNA聚合酶聚合酶全酶，这说明前导链和随后链全酶，这说明前导链和随后链上的上的DNA合成是由同一复制体负责的。合成是由同一复制体负责的。但但DNA两股链上的两股链上的DNA合成不是同步进合成不是同步进行的，并且方向相反，
39、那么复制体是怎行的，并且方向相反，那么复制体是怎样工作的呢？样工作的呢？ 为此提出了模型认为：当为此提出了模型认为：当前导链上前导链上开始开始DNA合成和复制叉向前移动时，合成和复制叉向前移动时，随随后链即向后回折成环后链即向后回折成环。5533355335回环模型（三）复制的终止（三）复制的终止 在单方向复制的环状分子中，复制在单方向复制的环状分子中，复制的终点就是它的复制原点，在双方向复的终点就是它的复制原点，在双方向复制的环状分子中，大多数是两个生长点制的环状分子中，大多数是两个生长点的简单碰撞。的简单碰撞。 1. 去除引物，填补缺口去除引物，填补缺口 2. 连接冈崎片段连接冈崎片段大肠
40、杆菌染色体大肠杆菌染色体复制的终止复制的终止oric复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶连锁染色体连锁染色体1. 去除引物，填补缺口去除引物，填补缺口 在原核生物中，由在原核生物中，由DNA聚合酶聚合酶来水解去除来水解去除RNA引物，并由引物，并由该酶该酶催化延长引物缺口处的催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。 在真核生物中，在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由殊的核酸酶来水解
41、，而冈崎片段仍由DNA聚合聚合酶来延长。酶来延长。 2. 连接冈崎片段连接冈崎片段 在在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。长链。 原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向旋转酶旋转酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5 RNA引物引物3 3 五、复制的忠实性五、复制的忠实性 DNA
42、复制过程是一个高度精确的过程，据估复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌计，大肠杆菌DNA复制复制5 109碱基对仅出现一个误碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下几点差，保证复制忠实性的原因主要有以下几点: DNA聚合酶的高度专一性聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基（严格遵循碱基配对原则，但错配率为配对原则，但错配率为7 10-6 ） DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能（错配碱基被（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除） 起始时以起始时以RNA作为引物作为引物 聚合时的方向聚合时的方向 修复作用修复作用DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配碱基错配
43、碱基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸起始时以起始时以RNARNA作为引物的作用作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。聚合过程高度精确的又一措施。已知已知DNA 聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶功能校对复制过程中的核外切酶功能校对复制过程中的核苷酸苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决
44、定了它不能从头开总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当DNA开开始聚合以后再以始聚合以后再以53 外切酶的功能切除，以高忠实性的脱外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。聚合时的方向聚合时的方向 现在已知现在已知DNADNA的聚合都是的聚合都是5353，为什么不能从，为什么不能从3535端聚合呢？端聚合呢？原来，如果按原来，如果按5353聚
45、合，一旦出现碱基错聚合，一旦出现碱基错配，可由配，可由DNADNA聚合酶聚合酶从从33端切除聚合上的错端切除聚合上的错误的核苷酸，剩下误的核苷酸，剩下3-3-羟基，后者可以接受由羟基，后者可以接受由以以dNTPdNTP为原料而生成的单核苷酸，为原料而生成的单核苷酸， 即即dNTPdNTP可以可以和上一个核苷酸的游离和上一个核苷酸的游离3-3-羟基生成羟基生成33，5-5-磷酸二酯键，磷酸二酯键，dNTPdNTP自身水解掉焦磷酸。自身水解掉焦磷酸。 真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 真核生物的真核生物的DNADN
46、A聚合酶聚合酶 端粒（端粒（telemeretelemere）复制）复制真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 分子量分子量亚基数亚基数细胞内分布细胞内分布酶活力百分比酶活力百分比外切酶活力外切酶活力DNA聚合酶聚合酶 110-23，000多个多个细胞核细胞核80%无无120，000一个一个细胞核和线粒体细胞核和线粒体2 15%无无-400，000一个一个细胞核细胞核+10 25% 5 -3 外切酶外切酶DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 45，000一个一个细胞核细胞核10 15%无无端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在
47、线形DNA分子末端不可能分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的模板的DNA片段的片段的合成，使复制以后的线形合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变
48、。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 TTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTT
49、GGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸真核和原核真核和原核DNA细胞复
50、制比较细胞复制比较第三节 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于用于DNA，造成，造成DNA结构和功能的破坏，称为结构和功能的破坏，称为DNA的损的损伤伤. DNA的修复主要有以下类型的修复主要有以下类型:暗修复暗修复四、四、诱导修复诱导修复（SOS修复）修复）一、一、光裂合酶修复光裂合酶修复二二、切除修复切除修复三、三、重组修复重组修复 DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于、
