1、DNADNA的生物合成的生物合成（复制）（复制）DNA BiosynthesisDNA Biosynthesis第第 九九 章章本章内容本章内容第一节第一节 DNADNA复制的特点复制的特点第二节第二节 DNADNA复制的酶学复制的酶学第三节第三节 DNADNA生物合成过程生物合成过程第四节第四节 逆转录逆转录第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 DNADNA是生物遗传的主要物质基础，生物体的是生物遗传的主要物质基础，生物体的遗传信息以密码的形式编码在遗传信息以密码的形式编码在DNADNA分子上，表现分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNADNA
2、的复制由的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译成特异的蛋然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。亲代相似的遗传性状。 中心法则中心法则19581958年年,Crick,Crick在总结了遗传信息从在总结了遗传信息从DNADNA到蛋白质的到蛋白质的流动方向之后，提出了中心法则（流动方向之后，提出了中心法则（central dogmacentral dogma） 中心法则中心法则 代表了大多数生物遗传信息
3、贮存和表代表了大多数生物遗传信息贮存和表达的规律，并奠定了在分子水平上研究生命科学达的规律，并奠定了在分子水平上研究生命科学关键问题的理论基础。关键问题的理论基础。从从DNADNA到蛋白质，通过转录和翻译，用基因的遗到蛋白质，通过转录和翻译，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质，传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质，这就是这就是基因表达（基因表达（gene expressiongene expression）。）。 19701970年，年，TeminTemin阐明了反转录现象的机制阐明了反转录现象的机制 Reverse transcriptionDNADNA复制的特点复制的特
4、点第一节第一节一、半保留复制一、半保留复制(semiconservative(semiconservative replication)replication)（一）概念（一）概念（二）实验依据：密度梯度实验（二）实验依据：密度梯度实验（三）生物学意义：（三）生物学意义： 1.1.保证遗传信息传递的忠实性保证遗传信息传递的忠实性 2.2.遗传和变异的统一遗传和变异的统一（一）（一）DNADNA半保留复制概念半保留复制概念 DNADNA进行复制时，双螺旋结构解开而成两股单进行复制时，双螺旋结构解开而成两股单链，各自作为模板（链，各自作为模板（templatetemplate），用于合成新的），用
5、于合成新的互补链（互补链（complementary strand complementary strand ）。子代细胞出）。子代细胞出现新的现新的DNADNA双链，其中双链，其中一股单链是从亲代完整地接一股单链是从亲代完整地接受过来的，另一股单链完全重新合成，受过来的，另一股单链完全重新合成，即两个子即两个子细胞的细胞的DNADNA双链，都和母细胞双链，都和母细胞DNADNA碱基序列完全一碱基序列完全一致。致。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGG
6、TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 19581958年由年由M. MeselsonM. Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的实所完成的实验所证明。验所证明。将大肠杆菌在含将大肠杆菌在含1515N N的培养基中培养约十五代，的培养基中培养约十五代，使其使其DNADNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为1515N N。然后将大肠杆。然后将大肠杆菌移至只含菌移至只含1414N N的培养基中同步培养一代、二代、的培养基中同步培养一代、二代
7、、三代。分别提取三代。分别提取DNADNA，作密度梯度离心，将具有，作密度梯度离心，将具有不同密度的不同密度的DNADNA分离开。分离开。（二）（二）DNADNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果二、双向复制二、双向复制(bidirectional replication)(bidirectional replication) 原核生物复制时，原核生
8、物复制时，DNADNA从起始点从起始点(origin)(origin)向向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。称为双向复制。A. A. 环状双链环状双链DNADNA及复制起始点及复制起始点B. B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter(termination, ter) )oriterA B C53oriorioriori535533553复制子复制子3真核生物复制多个起始点真核生物复制多个起始点三、半不连续复制三、半不连续复制(semi-discont
9、inuous (semi-discontinuous replication)replication)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链。领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链随从链。复制中的不连续片段称为。复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki(okazaki fragment) fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是领头链连续复制而
10、随从链不连续复制，就是复制复制的半不连续性。的半不连续性。3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)四、需要四、需要RNARNA引物引物(primer)(primer) DNADNA聚合酶不能直接聚合游离的聚合酶不能直接聚合游离的dNTPdNTP，必须由一，必须由一段核酸片段提供段核酸片段提供33OHOH末端。末端。DNADNA复制的酶学复制的酶学第二节第二节一、一、DNADNA复制的体系复制的体系 （一）底物：（一）底物：dNTPdNTP, N=A,T,C,G, N=A,T,C,G （二）模板：
11、（二）模板：DNADNA单链单链 （三）引物：（三）引物：RNARNA，提供，提供3 3 -OH-OH末端使末端使dNTPdNTP可可以依次聚合以依次聚合 （四）酶和蛋白质因子：（四）酶和蛋白质因子：(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 二、二、DNADNA复制的酶学复制的酶学 （一）（一）解螺旋酶解螺旋酶（helicasehelicase） 可以将可以将DNADNA双链解开成为单链。大肠杆菌中双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为发现的解螺旋酶为DnaBDnaB。（二）（二）DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶DNADNA （topoisomerasetopoiso
12、merase） 通过切断并连接通过切断并连接DNADNA双链中的一股或双股，改变双链中的一股或双股，改变DNADNA分子拓扑构象，避免分子拓扑构象，避免DNADNA分子打结、缠绕、连环，在复制分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。的全程中都起作用。 类型：拓扑异构酶类型：拓扑异构酶I I和拓扑异构酶和拓扑异构酶IIII。l拓扑异构酶拓扑异构酶I I：能切断能切断DNADNA双链中一股并再连接断双链中一股并再连接断端，反应不需端，反应不需ATPATP供能；供能；l拓扑异构酶拓扑异构酶IIII：能使能使DNADNA双链同时发生断裂和再连双链同时发生断裂和再连接，需接，需ATPATP供能。供
13、能。1010 8 8 局部解链后局部解链后 解链过程中，解链过程中，DNADNA分子会过度拧紧、打结、分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。缠绕、连环等现象。（三）（三）DNADNA单链结合蛋白单链结合蛋白 （single chain binding protein-SSBsingle chain binding protein-SSB） 可以维持模板的单链状态并保护模板不受核可以维持模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着酸酶的降解。随着DNADNA双链的不断解开，双链的不断解开，SSBSSB能不能不断的与之结合、解离。断的与之结合、解离。（四）引物酶（四）引物酶（primasepr
14、imase） 是一种是一种RNARNA聚合酶，在复制的起始点处以聚合酶，在复制的起始点处以DNADNA为模板，催化合成一小段互补的为模板，催化合成一小段互补的RNARNA。引物酶能直。引物酶能直接在单链接在单链DNADNA模板上催化游离的模板上催化游离的NTPNTP合成一小段合成一小段RNARNA，并由这一小段并由这一小段RNARNA引物提供引物提供3-OH3-OH， 经经DNADNA聚合酶聚合酶催化链的延伸。催化链的延伸。 （五）（五）DNADNA聚合酶聚合酶 全称：全称：依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent (DNA-dependent DNA p
15、olymerase)DNA polymerase) 简称：简称：DNA-polDNA-pol 活性活性： 5 53 3 的聚合活性的聚合活性 5 53 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 35 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 1 1、原核生物的、原核生物的
16、DNADNA聚合酶聚合酶催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状伤的应急状态修复态修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol I功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 60
17、4个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD) 2 2、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚
18、合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性DNA-pol 参与低保真度的复制参与低保真度的复制 DNA-pol 在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用复制中起催化作用DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol 校读、修复和填补缺口校读、修复和填补缺口（六）（六）DNADNA连接酶连接酶 （DNA ligaseDNA ligase） 连接连接DNADNA链链3 3 -OH-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链链5 5 -P-P末端，末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNAD
19、NA链链连接成一条完整的链。连接成一条完整的链。POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353酶-AMP-P-DNA酶-AMPEnzyme-三、三、DNADNA复制的保真性复制的保真性（一）酶学依据：（一）酶学依据： 1.1.核酸外切酶活性和校读；核酸外切酶活性和校读； 2.2.复制的保真性和碱基选择。复制的保真性和碱基选择。（二）机制：（二）机制： 1.1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2.2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能； 3.3.复制出错时有即时的校读功能。复制出错时有即时的校读功能。DNADN
20、A生物合成过程生物合成过程第三节第三节一、原核生物一、原核生物DNADNA生物合成生物合成（一）起始阶段（一）起始阶段 1.1.辨认起始点，形成单链辨认起始点，形成单链 2.2.合成引发体合成引发体 3.3.合成引物合成引物E.coliE.coli复制起始点复制起始点 oriCoriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174
21、 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 3个个13bp串联重复序列：串联重复序列：AT丰富，易丰富，易解链解链4个个9bp （2组）反向重复序列组）反向重复序列复制子 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复复制起始区域的复合结构称为制起始区域的复合结构称为引发体。引发体。 理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链
22、DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNARNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶（二）延长阶段（二）延长阶段 复制的延长指在复制的延长指在DNA-polDNA-pol催化下，催化下，dNTPdNTP以以d
23、NMPdNMP的的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。是磷酸二酯键的不断生成。 领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成目目 录录复复制制过过程程简简图图目目 录录3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向3 35 53 33 35 5冈崎片段冈崎片段复制叉引导的复制方向复制叉引导的复制方向亲代亲代DNA双链双链前导链前导链 随从链随从链冈崎片段冈崎片段RNA引物引物5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接
24、随从链上不连续性片段的连接复复 制制 过过 程程 动动 画画滚环复制（滚环复制（rolling circle replicationrolling circle replication）：）：简单低等生物的复制方式。简单低等生物的复制方式。+-+-+-+-553333+-533+-533355+-5335+-+-+切断外环外环5结合特殊蛋白，5以内环为模板复制外环不断剥离内环外环的互补链间断合成核酸酶切核酸酶切（三）终止阶段（三）终止阶段 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，双向复制的复制片，双向复制的复制片段在复制的终止点段在复制的终止点(ter(ter) )处汇合。处汇合。o
25、riter E.coli8232 ori terSV40500oriC82ter32二、真核生物二、真核生物DNADNA生物合成生物合成（一）（一）DNADNA的复制只发生在的复制只发生在S S期期（二）多复制子（二）多复制子（三）真核细胞含有（三）真核细胞含有5 5种种DNADNA聚合酶聚合酶（四）端粒复制（四）端粒复制 染色体两端染色体两端DNADNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNARNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。真核生物每个染色体有多个起始点，是真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子多复制子复制复制。复制有时序性复制有时序性，即复制子以分组方式激活，即复制子以
26、分组方式激活而不是同步起动。而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-polDNA-pol（引物酶活性）（引物酶活性）和和polpol（解螺旋酶活性）（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制参与。还需拓扑酶和复制因子因子(replication factor, RF)(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear (proliferation cell nuclear antigen, PCNA)antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。 哺乳动物的哺
27、乳动物的细胞周期细胞周期DNADNA合成期合成期G1G2SM3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 1 1、端粒（、端粒（telemertelemer）：）： 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNADNA分子末端的分子末端的结构。结构。 2 2、结构特点：、结构特点：（1 1）由末端单链）由末端单链DNADNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。（2 2）末端）末端DNADNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G G、C C碱碱基的短序列
28、。基的短序列。 3 3、功能：、功能：（1 1）维持染色体的稳定性）维持染色体的稳定性（2 2）维持）维持DNADNA复制的完整性复制的完整性 4 4、端粒酶：、端粒酶：由由RNARNA和蛋白质组成和蛋白质组成（1 1）RNARNA发挥模板作用发挥模板作用（2 2）蛋白质发挥逆转录酶活性）蛋白质发挥逆转录酶活性l端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase)的的组成组成 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase assoc
29、iated (human telomerase associated protein 1, hTP1)protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)transcriptase, hTRT) 端粒酶：为端粒酶：为RNA-RNA-蛋白质复合物蛋白质复合物端粒酶端粒酶RNARNA与端粒与端粒DNA(telomereDNA(telomere DNA sequence DNA sequence TEL)TEL)互补。互补。人端粒酶人端粒酶RNAR
30、NA（hTRhTR）模板序列为）模板序列为5CUAACCCUAA-5CUAACCCUAA-3 3 。端粒酶是一种特殊的反转录酶。以端粒酶端粒酶是一种特殊的反转录酶。以端粒酶RNARNA为为模板催化端粒模板催化端粒DNADNA重复序列延长。重复序列延长。胚胎组织有活性；正常体细胞中除睾丸、卵巢、胚胎组织有活性；正常体细胞中除睾丸、卵巢、造血干细胞外均无端粒酶活性。造血干细胞外均无端粒酶活性。细胞老化端粒缩短，甚至消失。细胞老化端粒缩短，甚至消失。某些恶性肿瘤可见端粒缩短、端粒酶激活。某些恶性肿瘤可见端粒缩短、端粒酶激活。端粒端粒DNADNA重复序列与端粒酶对基因组起双重保重复序列与端粒酶对基因组
31、起双重保护作用。护作用。端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）4、端粒和端粒酶的生物学意义端粒和端粒酶的生物学意义逆转录逆转录(reverse transcription)(reverse transcription) 第四节第四节一、概念一、概念 逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，是，是RNARNA指导下指导下的的DNADNA合成过程，即以合成过程，即以RNARNA为模板，四种为模板，四种dNTPdNTP为原料，为原料，合成
32、与合成与RNARNA互补的互补的DNADNA单链。单链。 逆转录逆转录酶酶二、逆转录酶二、逆转录酶(reverse transcriptase)(reverse transcriptase) 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNARNA病毒中都病毒中都含有此酶。含有此酶。 具有三种酶活性：具有三种酶活性： RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 RNARNA酶活性酶活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性三、合成过程三、合成过程 RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆
33、转录酶双链双链DNA病毒病毒RNARNA经反转录形成的双链经反转录形成的双链DNADNA，在宿主细胞内有，在宿主细胞内有如下作用：如下作用：可通过基因重组作用插入到宿主基因组中，并随可通过基因重组作用插入到宿主基因组中，并随宿主细胞复制表达。这种在活细胞内的基因重组宿主细胞复制表达。这种在活细胞内的基因重组又称为又称为整合（整合（integrationintegration）。这可打乱宿主细胞）。这可打乱宿主细胞遗传信息的正常秩序，甚至由此导致细胞恶性变；遗传信息的正常秩序，甚至由此导致细胞恶性变；以以DNADNA为模板，转录生成大量病毒为模板，转录生成大量病毒RNARNA；以以DNADNA为
34、模板，转录生成病毒为模板，转录生成病毒mRNAmRNA，进一步翻译，进一步翻译生成若干种病毒蛋白，用以包装病毒，使之成为生成若干种病毒蛋白，用以包装病毒，使之成为有感染力的病毒颗粒，扩大感染。有感染力的病毒颗粒，扩大感染。逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNAcDNA法。法。 以以mRNAmRNA为模板，经逆转录为模板，经逆转录合成的与合成的与mRN
35、AmRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNAcDNA complementary DNA l逆转录发现的意义：逆转录发现的意义：对传统的生物学中心法则提出挑战。对传统的生物学中心法则提出挑战。RNARNA同样兼有同样兼有遗传信息携带和表达功能。遗传信息携带和表达功能。RNARNA在进化过程中可能在进化过程中可能比比DNADNA出现更早。出现更早。为进一步研究病毒致癌机理、肿瘤病因等树立了为进一步研究病毒致癌机理、肿瘤病因等树立了一个新的里程碑。为探索肿瘤、爱滋病等病因，一个新的里程碑。为探索肿瘤、爱滋病等病因，在设计治疗策略上均起到了重要的推
36、动作用。在设计治疗策略上均起到了重要的推动作用。 反转录酶已成为重要的工具酶之一，具有重要的反转录酶已成为重要的工具酶之一，具有重要的应用价值（如构建应用价值（如构建cDNAcDNA文库、筛选目的基因、应文库、筛选目的基因、应用反转录用反转录PCRPCR扩增目的基因等）。扩增目的基因等）。DNADNA损伤与修复损伤与修复第五节第五节DNADNA的变异（的变异（variationvariation）：）：是指是指DNADNA分子中分子中一个或多个碱基的结构或功能的异常变化。有一个或多个碱基的结构或功能的异常变化。有的可称的可称突变（突变（mutationmutation）。对 机 体 有 害 的
37、 变 异 称对 机 体 有 害 的 变 异 称DNADNA的损伤（的损伤（DNA DNA damagedamage）。）。有益的变异是进化、分化的分子基础。有益的变异是进化、分化的分子基础。一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素二、引发突变的因素（一）物理因素：（一）物理因素：紫外线紫外线(ultra violet, UV)(ultra violet, UV)、 各种辐射各种辐射
38、UV（二）化学因素：（二）化学因素：常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型（一）错配（一）错配 (mismatch)(mismatch) DNA DNA分子上的碱基错配称点突变分子上的碱基错配称点突变(
39、point (point mutation)mutation)。 1.1.转换：转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 2.2.颠换：颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbSHb (HbS) ) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbAHb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu
40、glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二）（二）缺失缺失 (deletion) (deletion)、插入、插入 (insertion) (insertion) 1.1.缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNADNA大分子大分子上消失。上消失。 2.2.插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到入到DNADNA大分子中间。大分子中间。 3.3.缺失或插入都可导致框移缺失或插入都可导致框移(frame-shift)(frame-shift)突变。突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成框移突变是指三联体密码的阅读方
41、式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变（三）重组（三）重组(recombination)(recombination) DNADNA分子内较大片段的交换，称为重分子内较大片段的交换，称为重组或重排。组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型四、四、DNADNA损伤的修复损伤的修复（一）（一）光修复光修复(light repairi
42、ng)(light repairing)光修复酶光修复酶(photolyase) UV（二）切除（二）切除修复修复(excision repairing)(excision repairing) 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polDNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。 核酸内切酶（核酸内切酶（切开切开）；）； 核酸外切酶（核酸外切酶（ DNA-polDNA-pol的的55，3 3 外切酶活性）（外切酶活性）（切除切除） DNA-polDNA-pol（合成合成） DNADNA连接酶（连接酶（连接连接）UvrAUvrBUvrCOHPDNA
43、聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATPE.coli的的切切除除修修复复机机制制参与的酶有参与的酶有 核酸内切酶核酸内切酶，polpol, ,DNADNA连接酶连接酶特异核酸内切酶pol DNA连接酶 核酸内切酶 切开 核酸外切酶 切除 DNA聚合酶 合成 DNA连接酶 连接（三）重组（三）重组修复修复(recombination repairing)(recombination repairing)l发生在发生在DNADNA损伤范围较大、尚未完成修复即开始损伤范围较大、尚未完成修复即开始复制时。又称复制后修复；复制时。又称复制后修复；lE.ColiE.Coli的重组基因的重组基因recre
44、c （A A、B B、C C、D D）编码的）编码的重组蛋白重组蛋白RecRec BCD BCD、RecARecA；lRecARecA可识别双链可识别双链DNADNA中一条单链上的空缺，并可中一条单链上的空缺，并可进行单链交换作用将正常母链中相应片段移至子进行单链交换作用将正常母链中相应片段移至子链空缺处进行重组。链空缺处进行重组。重组蛋白重组蛋白RecARecA，polpol，连接酶参与，连接酶参与, ,损伤会保留下损伤会保留下去去（四）（四）SOSSOS修复修复当当DNADNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。系列复杂的反应。在在E. coliE. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子为调节子(regulon(regulon) )的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过通过SOSSOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而然而DNADNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。变。
