1、不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细胞影响的体外观察质细胞影响的体外观察内容 研究的意义和主要内容研究的意义和主要内容 国内外研究进展国内外研究进展 实验方法和内容实验方法和内容 初步计划初步计划 经费预算经费预算 可行性预测可行性预测 不利因素不利因素 参考文献参考文献研究的意义和主要内容研究的意义和主要内容 医用臭氧是臭氧和氧气的混合物，应用于临床已有100多年的历史。医用臭氧技术在临床各专业中被广泛关注，并显示了良好的应用前景。在疼痛临床中，自1988年Verga将臭氧注入腰大肌及椎旁间隙治疗腰腿痛，臭氧开始越来越多的用于疼痛治疗。研究的意义和主要内容研究的意义和
2、主要内容 对于腰腿痛病人，医用臭氧椎间盘内和椎旁注射取得了良好的疗效。但是臭氧作为一种极强的氧化剂，在治疗过程中有可能会误入或渗入蛛网膜下腔，这是否会对中枢神经系统造成损伤，或是多大剂量能造成损伤，已经引起了临床医务工作者的关注和重视。研究的意义和主要内容研究的意义和主要内容 星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多的细胞，它的功能在近年来被人们越来越多地认识到，甚至有人把星形胶质细胞和神经元比作中枢神经系统中同等重要的功能伙伴。研究的意义和主要内容研究的意义和主要内容 并且星形胶质细胞参与构成了血脑屏障，最先接触蛛网膜下腔中的毒性物质，而它本身也有强大的抗氧化能力，因此星形胶质细胞在抵抗臭氧的
3、毒性作用中可能发挥了很大的作用，但广泛查阅未检索到相关报道。本研究拟从生化改变和形态学两方面观察不同浓度的医用臭氧对体外培养的星形胶质细胞的影响，以期为临床工作提供有意义的参考。国内外研究进展国内外研究进展 国内外关于臭氧的研究多集中于免疫系统、心血管系统、神经内分泌系统、呼吸系统等方面。在疼痛领域，对臭氧的研究都集中在臭氧的治疗作用，尤其是臭氧溶解椎间盘髓核作用和消炎止痛作用。国内外研究进展国内外研究进展 在臭氧的毒性方面，本科前期观察了不同浓度的医用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）经小脑延髓池注入蛛网膜下腔后，兔行为学未受到明显影响，而随着医用臭氧浓度的增加，脑脊液的
4、抗氧化水平逐渐提高，脂质过氧化反应被抑制；当超出机体抵抗氧化的代偿能力时，抗氧化水平不再继续提高，脂质过氧化反应短暂增强。这表明随着剂量的增加医用臭氧鞘内注射有潜在的神经毒性，研究结果发表在中华麻醉学杂志上，这一结论为进一步研究医用臭氧的神经毒性提供了初步的研究结果。国内外研究进展国内外研究进展 但关于臭氧对离体细胞作用的研究，国外多是集中在臭氧对血液细胞和支气管上皮细胞的作用上，国内几乎没有在此方面的研究；而对于离体神经细胞的作用，国内外都没有相关文献报道。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 参照Kim 等人的方法，并略作改动。大致步骤如下： （1）取12天龄的大鼠天龄的大鼠
5、，经75%乙醇消毒后，用手术剪将头部剪下，置于无菌培养皿中。 （2）沿纵轴剪开皮肤和颅骨，打开颅腔，取出脑组织并移入另一含有预冷生理盐水的培养皿中，去除嗅部，小心分离出两侧的大脑皮质大脑皮质。 注：在取材过程中，为防止污染，所用的消毒手术器械每一步骤均要加以更换。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （3）小心地撕去脑膜，通常脑膜呈粉红色，若皮质组织已不见该颜色一般说明脑膜已去除干净。 （4） 将组织切成约0.20.20.2mm3大小的碎块后，移入另一含有9ml生理盐水的培养皿中。 （5） 加入无菌的1ml0.25% 胰蛋白酶液胰蛋白酶液(预先用5%调节Ph7.3) , 置37水
6、浴振荡消化20-30分钟。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （6） 加入20ml含血清的血清的DMEM完全培养完全培养基基,并用吸管柔和的吹打3次。 （7） 静置数分钟待组织下沉后，将细胞悬液移入另一新的离心管，再加入15mlDMEM至剩余组织中，稍用力吹打3-4次后，再让组织下沉，收集细胞悬液。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （8） 重复步骤（7）3-4次，直至组织全部分散成细胞悬液。将收集的细胞悬液用130um的筛网筛网过滤过滤。 （9） 过滤后的细胞悬液用50ml的无菌离心管分装，以1000r/min离心离心10min。 （10） 尽可能吸去上清液，
7、每管加入10ml DMEM/F12，并柔和吹打3min,让细胞碎片和残余组织团块下沉后，收集细胞悬液。 （11） 用吸管将细胞悬液转移至细胞培养瓶，37C，5%CO2孵育40分钟，然后翻转培养瓶，将细胞悬液转移至另一培养瓶，重复此步骤34次以除去成纤维细胞。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （12） 取0.1%苔盼蓝与细胞悬液以1：1稀释后，检查活细胞的数量，将细胞密度稀释成检查活细胞的数量，将细胞密度稀释成1.5 106 ml , 接种入75cm2 的培养瓶中，5C0295 空气，37 ，饱和湿度培养。（培养液组成：DMEM /F12， 添加10胎牛血清、4mmolL 一谷
8、氨酰胺、10万U青霉素10万U链霉素、15mmolLHEPES）。 (13) 接种三天后更换培养液，以后每隔两天换液一次。定期换液观察至培养第8天时细胞已融合，用025% 胰蛋白酶消化处理后传代传代，两次传代后约第三周时即可得纯化的星形胶质细胞。实验方法和内容实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （14） 星形胶质细胞的鉴定采用胶原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色： 以无水酒精固定贴壁细胞10 min，PBS漂洗；过氧化酶阻断剂，室温下孵育10 min；一抗(鼠抗)一抗GFAP抗体室温下60 min；生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min；链亲和素一过氧化物酶溶液，室温下孵育10 m
9、in；DAB染色，苏木精对比染色，中性树胶封固。进行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗血清反应，显示阳性反应的是星形胶质细胞。 GFAP鉴定星形胶质细胞纯度85%以上可用于实验。实验方法和内容实验方法和内容2 实验分组实验分组 将培养的细胞悬液分为纯氧组（O2组）及各浓度臭氧组（02-O3 10组，02-O3 20组，02-O3 40组，02-O3 60组，02-O3 80组）， 分组 平行试验数量 处理P组 O2 组 5 通入纯氧O2-O3 10组 5 通入10mg/L臭氧O2-O3 20组 5 通入20mg/L臭氧O2-O3 40组 5 通入40mg/L臭氧O2-O3 60组 5 通入60m
10、g/L臭氧O2-O3 80组 5 通入80mg/L臭氧说明： 医用臭氧是氧气和臭氧的混合物，臭氧代谢生成氧气。氧气具有生物活性，要全面的观察医用臭氧的生物效应除了要考虑到臭氧本身的作用外还要考虑到在混合气体中共同存在和经由代谢生成的氧气的作用。实验方法和内容实验方法和内容 3 干预手段 将各组细胞悬液中分别通入纯氧及臭氧（浓度各为10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L），体积与细胞培养液按体积以1：1计，在10分钟内通完，分别孵育2h,4h后进行显微镜下观察及生化检测。 臭氧抽取方法：将臭氧发生器接通电源，通过调校臭氧浓度及氧气输入量按钮或去所需浓度的医用臭氧。用
11、一次性注射器接至臭氧输出端口，并用力下压，臭氧即可依靠自身压力充满注射器，第一管废弃不用，获得的医用臭氧需立即使用。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 4.1相差显微镜下星形胶质细胞形态观察 星形胶质细胞形状不规则、呈多角形或星形，扁平状;胞体较大,直径大约为9-10um,胞质较丰富、胞突较多较长;细胞核大，呈圆形或卵圆形， 常偏于胞体一侧,染色质少。生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清，并可见细胞部分细微结构。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡，脂滴和其他颗粒状物质，细胞之
12、间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物，细胞死亡会崩解漂浮在培养液中。在受到外界损伤因素时，细胞会变得肿胀，突起增多。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 4.2 细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一，也是比较简便实用的观测指标。在细胞培养研究中，了解细胞的数量和存活情况是很重要的一个环节，由此可以判断培养条件和方法是否合适，而且通过细胞数量的变化可以初步了解所使用的某些因素对细胞的影响。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 细胞损伤或死亡时，由于细胞膜的结构或通透性发生改变，某些染料可穿透细胞膜进入细胞内，使细胞染色
13、，从而可以根据细胞是否着色来区分活细胞和死细胞，并根据活细胞和死细胞的比例即活细胞百分率来判断细胞受损的程度。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 4.3 生化指标 生物膜中的不饱和脂肪酸对自由基及脂质过氧化产物具有极强的敏感性,过量可导致损伤。文献表明，脊髓损伤后530min自由基即有升高，2小时后脂质过氧化产物升高最明显，此后不同性质损伤变化不同。这表明在脊髓损伤后的急性期改变中氧化-抗氧化系统失衡起重要作用。4.3.1超氧化物歧化酶（SOD） SOD是氧化-抗氧化系统中重要的酶, 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。 SOD专一以超氧阴离子自由基为底物，能清除自由基并终止其
14、连锁反应，保护细胞免受损伤，同时本身被消耗。它的含量可反映体内自由基的变化情况，能够反映抵抗自由基损伤的能力。SOD活力的高低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、辐射、药物作用等有着密切的联系，对疾病的病因学探讨，诊断治疗的观察有着重要意义。4.3.2丙二醛（MDA） MDA为脂质过氧化物终产物之一,具有细胞毒性。其含量多少能体现机体的脂质过氧化程度，能够反映细胞受损的程度。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如:醛基(丙二醛)、酮基、羟基、氢过氧基或过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不
15、仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。4.3.2丙二醛（MDA） 因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH) 乳酸脱
16、氢酶是存在于细胞浆内参与糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一种催化酶。LDH在正常人体血浆中含有少量，均系来源于组织细胞，但在某些疾病时所累及的细胞会额外释放入血或脑脊液，故临床上常用血清或脑脊液LDH活性测定来诊断疾病和进行药物治疗作用的评价。4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH) 进行离体细胞培养时，如果培养的细胞受损，LDH也会由细胞漏出至培养液中，因此通过细胞培养液LDH漏出率的测定可以较客观地衡量细胞的受损程度。在相同的条件下细胞培养液LDH的漏出率高的细胞损伤程度就大。4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH
17、) 在本试验中，生物膜尤其是细胞膜中的不饱和脂肪酸对由臭氧产生的自由基及脂质过氧化物具有极强的敏感性，过量可导致损伤，而且细胞膜相对于胞内结构首先接触到内环境中的毒性物质，因而细胞膜是臭氧攻击的重要靶点，会更多的受到损伤。细胞膜损伤后会导致通透性增高，细胞内的成分会比较容易的漏出，LDH也会漏出。细胞膜损伤越严重，LDH就会漏出越多，因而测定LDH漏出率可以较特异的反应细胞膜的损伤程度。实验方法和内容实验方法和内容 4 观测指标 如上所述，LDH漏出率，MDA和SOD分别代表着损伤和抗损伤因素，并且对神经胶质细胞损伤反应灵敏，是分析医用臭氧对中枢神经系统有无毒性的合适指标。实验方法和内容实验方
18、法和内容 5 测定方法测定方法 5.1 相差显微镜直接观察法细胞形态观察 （1）调整好相差显微镜 （2）观察瓶皿准备 （3）调光 （4）调焦和摄影 （5）细胞观察实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法 5.2 细胞计数和活细胞百分率 （1）取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸轻轻拭干。 （2）取细胞悬液0.3ml，加入0.9ml0.5%浓度的台盼蓝（PBS配置），混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。 （3）在显微镜下用10X物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。细胞数/mL=(4大格细胞
19、数之和/4)X104X稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般台盼蓝染色可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。 细胞存活百分率=(4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数)x100%实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法 5.3 生化指标测定 5.3.1 SOD测定: 黄嘌呤氧化酶法。 原理是超氧阴离子自由基能氧化羟胺形成的亚硝酸盐并在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计可测其吸光度。当被测样品中含SOD时，对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少测定管的吸光度低,从而计算出被测样品中的SOD活力。 方法：作用终止后,吸去培养液
20、, 以冰生理盐水洗涤细胞2次,用细胞刮板刮下细胞,冰生理盐水收集,在冰浴中用超声细胞破碎仪破碎细胞,显微镜下观察无完整细胞后,按照试剂盒说明分别测定细胞内SOD活性,结果以Umg-1(pro)表示。实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法/生化指标测定生化指标测定 5.3.2 MDA测定: 硫代巴比妥酸(TBA)法。 原理是过氧化脂质在酸性条件下分解成MDA，MDA与TBA结合成红色色素，其吸收峰为535nm。 方法：作用终止后, 吸去培养液,以冰生理盐水洗涤细胞2次,用细胞刮板刮下细胞,冰生理盐水收集,在冰浴中用超声细胞破碎仪破碎细胞,显微镜下观察无完整细胞后,按照试剂盒说明分别测
21、定细胞内MDA含量,结果以nmolmg-1(pro)表示。实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法/生化指标测定生化指标测定 5.3.3 LDH测定：比色测定法。 原理 乳酸与氧化型辅酶I (NAD)在LDH催化作用下生成丙酮酸和还原型辅酶I ( NADH )，丙酮酸再和2,4一二硝基苯肼反应生成2,4一二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，从而通过比色法测定丙酮酸含量推算出LDH的活力。实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法/生化指标测定生化指标测定 5.3.3.1细胞培养液LDH活性测定 实验终止后，吸出待测培养孔内的培养液，以3000rpm离心10分钟，取上清液进行
22、检测，用乳酸脱氢酶试剂盒测定LDH含量。按照LDH测定试剂盒说明,在分光光度计上于340 nm处检测,结果以UL-1表示。实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法/生化指标测定生化指标测定/LDH 5.3.3.2 细胞匀浆液LDH活性测定 将待测培养孔内的培养液吸出后，加入等量PBS液，用细胞刮板刮取细胞并收集到相应编号的容器内，在超声波破碎上将细胞破碎，然后进行细胞匀浆液LDH活性的测定。按照LDH测定试剂盒说明,在分光光度计上于340 nm处检测,结果以UL-1表示。实验方法和内容实验方法和内容 5 测定方法测定方法/生化指标测定生化指标测定/LDH 5.3.3.3 细胞培养液L
23、DH漏出率的测定 细胞培养液LDH漏出率(%)=:培养液LDH总活性/(培养液LDH总活性+细胞匀浆液LDH总活性)X 100%注:： 1）培养液LDH总活性=培养液LDH的活性X培养液的体积; 2) 细胞匀浆液LDH总活性二细胞匀浆液LDH的活性X细胞匀浆液蛋白含量X细胞匀浆液的体积; 3)计算时一定要注意单位的换算。 初步计划初步计划 2007、4-2007、5 准备试剂、材 料、联系相关科室。 2007、5-2007、7 预实验阶段。 2007、7-2007、11 正式实验阶段，并进行实验总结。 2007、11-2008、2 整理材料、分析结果、论文撰写、准备答辩。经费预算经费预算 神经
24、胶质细胞培养：2000元； SOD、MDA、LDH测定：4000元； 显微镜下细胞形态观察、计数 ：2000元。可行性预测可行性预测 1 本科室技术力量雄厚，科研能力强。 2 已开展的相关研究提供了可借鉴的理论指导和实践经验。不利因素不利因素 1 相关基础研究报道较少，缺少直接借鉴的经验。 2 所需科研经费数目较大。 3 神经细胞培养比较困难。参考文献参考文献张维， 傅志俭，谢珺田，赵学军。鞘内注射医用臭氧对兔行为学和脑脊液超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影响，中华麻醉学杂志, 2006，26：552-554;Hall ED,Branghler JM. Role of lipid peroxida
25、tion in post-traumatic spinal cord degeneration.Cent Nerv Syst Trauma,1986,3(4):281;3 L. JANSK1, P. REYMANOV1, J. KOPECK .Dynamics of Cytokine Production in Human Peripheral Blood,Mononuclear Cells Stimulated by LPS or Infected by Borrelia Physiol. Res. 52: 593-598, 2003 ;4 Velio BocciCA.Ozone as Ja
26、nus: this controversialgas can be either toxic ormedically useful Mediators of Inflammation, 2004 13(1), 3_/11;5 杨志军, 魏玲. 星形胶质细胞生物学功能研究进展,华神经医学杂志2003，2（5）：396-398;6 BocciV OZONE 2004;7 郑志袨,林玲.神经细胞培养理论与实践,科学技术出版社,2002;8 庞占军,周玫,陈瑗.自由基医学研究方法,人民卫生出版社,2000;9 G. Valacchi , Velio BocciCA.Studies on the bio
27、logical effects ofozone: 10. Release of factors from ozonated human platelets,Mediators of Inflammation, 8, 205209 (19);10 Albert Grnicki, Aleksander Gutsze.In vitro effects of ozone on human erythrocyte membranes:An EPR study, 2000, 47( 4):963971.不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细胞影响的体外观察胞影响的体外观察分组细胞形态细胞计数 活细胞百分率生化指标SODMDALDH漏出率空白对照组 O3 大鼠星形胶质细胞 2h ,4hO2组O2-O3 10 组O2-O3 20 组O2-O3 40 组O2-O3 60 组O2-O3 80 组
