1、.1.2 一、概述 二、杂质检查方法的建立 三、杂质检查方法学验证的要求 四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析.3 1、杂质检查方法和方法验证对仿制药的重要意义 （1）安全性的重要保证关注毒性杂质 （2）评价仿制药是否一致的关键指标之一 仿制药与被仿制药的质量一致 杂质的种类和数量不高于被仿制药 （3）杂质研究的基础 杂质检查方法不合适或方法学验证不完善，杂质检查不可靠，无法准确评价药品质量.4 仿制药与被仿制药一致性要求 药学方面一致（含量、结构、杂质、其他检查项等） 杂质的数量和种类低于被仿制药，否则需要分析杂质的安全性并提供有关数据，必要时应进行相关的安全性试验 建立杂质适宜的杂质检查
2、方法用于判断一致性 用语工艺优化、去除杂质、考察稳定性、控制药物质量一、概述.5 2、目前国内仿制药研究中杂质检查面临的困难 杂质来源不清：被仿制药和仿制药杂质的种类和数量不清，包括杂质产生和引入的过程、降解途径 杂质甲醇方法缺乏针对性：不知控制何种杂质以及为何控制，缺乏安全性数据的支持 杂质对照品制备困难（受限于工艺困难）：方法验证不充分 杂质检查结果难于评价：以及基础薄弱，需要提高杂质研究水平，包括杂质检查方法和验证水平，以体改仿制药研制水平一、概述.6 例 盐酸曲美他嗪片 进口标准采用梯度洗脱，对3种已知杂质、单个未知杂质及总杂质分别进行控制 国内仿制采用等度洗脱，仅对未知杂质（单个杂质
3、和/或总杂质进行控制） 国内同品种标准对有关物质的规定：总杂质不得过1.0一、概述.7 3、主要的技术指导原则和技术要求 化学药物杂质研究的技术指导原则 已有国家标准化学药品研究技术指导原则 过渡期品种集中审评（化学药品）技术要求 FDDA、ICH的相关指导原则 Guidances for Industry ANDAs:Impurities in Drugs Substances Chemistry、Manufacturing、Controles Information ANDAs:Impurities in Drugs Products Q3A(R) Q3B(R)一、概述.8 4、杂质的范围
4、 有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物，化学结构与活性成分的分子式类似或具渊源关系，通常称有关物质 无机杂质产生的无机物 残留溶剂生产过程中使用的有机溶剂 来源工艺杂质、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质（外源性杂质）等 结构杂质几何异构体、光学异构体、聚合物、其它甾体、其它氨基酸一、概述.9 目的 1、建立杂质检查方法是质控的要求 包括具体的分析操作方法，以及计算方法、限度要求 2、用语分析杂质谱 考察与被仿制药一致性，进而优化制备工艺及稳定性考察.10 1、杂质检查方法建立的前提 （1）被仿制药杂质谱如何： 参考公开信息：质量标准、说明书、有关文献和专利 （2）自身杂质如何？ 理论综合
5、分析（合成路线、反应条件、处方工艺、辅料等）、直接测试 用于未知杂质或未定性杂质的“标记”方法 LC-MS/GC-MS或CE-MS法 HPLC峰保留时间对比法 其它方法二、杂质检查方法的建立.11 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点 （1）参考被仿制药的方法： A、被仿制药杂质检查方法和限度如何？标准中控制了哪些杂质？ B、重要参考，为方法建立提供重要的信息，全面考察 C、不可简单套用 工艺或处方的不同，二者的杂质谱可能不同，被仿制药杂质加查方法可能不适 被仿制药标准较低，无杂质检查项或较为简单 被仿制药的杂质检查方法无法获得二、杂质检查方法的建立.12 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考
6、虑点 （2）结合杂质的理化特点： 根据杂质谱，考虑杂质结构、理化性质 例如： 阿司匹林比色法游离水杨酸（CP2005） 葡萄糖注射液UV法5-羟甲基糠醛（CP2005） 氨基酸原料药TLC法其它氨基酸（CP2005）二、杂质检查方法的建立.13 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点 （3）结合杂质的毒性特点： 安全性控制的需要 被仿制药和自身杂质的毒性如何？重视药理毒理及临床安全性研究结果的作用 对于有些分子通过以下化学反应可能产生潜在的遗传毒性作用 烷基化 交联 脱嘌呤 可参考遗传毒性库 遗传毒性杂质或具有可能引起遗传毒性的结构的杂质需要建立灵敏的试验方法 EMEA遗传毒性杂质限度指导原则
7、：毒理学担忧阈值（TLC)1.5mg/人/日二、杂质检查方法的建立.14 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点 （4）考虑不同检查方法的特点： 主要是灵敏度和专属性能否符合要求 痕量杂质和遗传毒性杂质的严格控制，对方法要求较高 化学法TLC法HPLC法 HPLC/MS，HPLC/荧光 CE法可用于微量样品 GC适用于挥发性杂质检查二、杂质检查方法的建立.15 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点 （5）注意多种方法联用： 由杂质多样性复杂性和方法局限性所决定 单一方法不能满足多个杂质的检测时，可采用两种以上的方法互为补充，控制杂质 化学法色谱法光谱法生物检定法 同一方法采用不同测试条件 如
8、正相HPLC、反相HPLC、不同流动相的反相HPLC等 分离技术于检测手段联用，较为有效，如HPLC、GC、LC-MS、GC-MS 、HPLC-PDA、CE 等二、杂质检查方法的建立.16 2、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点 （6）综合药学的其他研究结果： 杂质检查与药物外观色泽、含量等项目间存在密切联系，如果这些项目发生明显变化，而杂质基本不变时，应分析原因，关注杂质检查方法的可行性。二、杂质检查方法的建立.17 3、杂质检查常见方法介绍 HPLC法 考虑被仿制药的色谱条件 考察同类物质质量标准中的杂质检查方法 一般选择多种色谱条件：正相和反相 方法包括：固定相、流动相、洗脱方式、波长、
9、测试样品的处理、具体操作、计算方法二、杂质检查方法的建立.18 3、杂质检查常见方法介绍 （1）固定相的选择 根据特征研究的药物的特性选择合适填料的柱子。常用RP-HPLC，色谱柱多选C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱也有使用 C18柱时，流动相有机溶剂通常5 流动相的pH值28 pH8，溶解硅胶载体，宜选用耐碱填充剂，包覆聚合物、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶或有机-无机杂化填充剂 pH2，键合相水解脱落，宜选用耐酸性填充剂：有机-无机杂化填充剂、具有大体积侧链的二异丙基或二异丁基取代C18键合硅胶等二、杂质检查方法的建立.19 3、杂质检查常见方法介绍 （1）固定相的选择
10、 注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究： a、当杂质峰与主峰的分离情况不十分完美 b、确定辅料峰的相对保留时间（用于定位扣除辅料的干扰） c、确定特定杂质的相对保留时间 d、确定有关物质出峰完毕的保留时间 当不同品牌而引起以上各因素不固定时，应在标准中注明品牌二、杂质检查方法的建立.20 3、杂质检查常见方法介绍 （2）流动相的选择 尝试多种流动相 结合杂质的性质 手性杂质 无紫外吸收杂质 一般杂质 （3）洗脱方式的选择 等度洗脱 梯度洗脱 极性大的化合物可能被掩盖，极性小的化合物难以被洗 脱，甚至保留在柱上，可使用梯度洗脱法二、杂质检查方法的建立.21 3、杂质检查常见方法介绍 （4）波长的选
11、择 选择的原则是大部分主要杂质与主成分均在此波长下有吸收：二极管阵列法 无紫外吸收或检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在单一检测波长处不能检出 兼顾各杂质吸收情况：特定波长检测特定杂质 必要时，该用其它类型的检测器二、杂质检查方法的建立.22 3、杂质检查常见方法介绍 （5）样品的处理和配制 预处理样品考虑 乳膏 提取可能导致的杂质漏检和失真 衍生化处理导致杂质丢失 样品浓度的影响 浓度高利于杂质检出，但防超载 低浓度样品杂质的检查难题？二、杂质检查方法的建立.23 3、杂质检查常见方法介绍 （6）杂质的定量计算方法 杂质对照品法杂质对照品法：定量准确，已知杂质，需用杂质对照品 校正因子
12、的主成分自身对照法校正因子的主成分自身对照法：定量准确，已知杂质，无需长期提供杂质对照品 不加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法：前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同，有一定的误差，可用于未知杂质，已知杂质对主成分的响应因子在0.91.1之间 峰面积归一化法峰面积归一化法：简便，因杂质与主成分响应因子不同，线性范围不同、仪器对他们的积分精度及准确度不同等因素，有一定的局限性二、杂质检查方法的建立.24目前定量方法中存在的主要问题杂质对照品法杂质对照品法：使用较少主成分自身对照法主成分自身对照法：较少采用校正因子计算（杂质无法进行归属或杂质对照品无法得到，校正因子无法计
13、算）常见的是对未知杂质，不加校正因子的主成分自身对照或面积归一化法（无法准确定量，无法有效检测杂质）TLC法设备和操作简便，一些特定杂质的检查灵敏度较差、定量不够精确，分离度欠佳，有时无法满足需要仅限于限度检查（半定量），结合不同原理的检视技术能使各杂质斑点均可显示，弥补HPLC的不足。需做好系统实用性试验二、杂质检查方法的建立.25 定量方法 限度检查（半定量）限度检查（半定量） 对照品比较法对照品比较法：已知杂质，对照品 自身对照法：已知杂质、未知杂质、色调一致 检视技术：显色、荧光、自身颜色 LC-MS、GC-MS、GC-IR、CE-MS法 分离技术和鉴别技术联用，为解析化合物的结构提供
14、直接证据 有助于杂质谱的分析和定性二、杂质检查方法的建立.26方法验证的目的 考察分析方法十分适用于杂质的检测和定量方法验证中面临的困难 杂质谱不清 杂质对照品无法获取验证的具体要求.27 1、专属性 指在可能的共存主分存在时，对被分析无物准确测定的能力 分离度：专属性指标、杂质谱的明确是基础 杂质可得最难物质分离对得分离试验、粗品中间体分离试验、辅料与杂质及主成分得分离试验 杂质不可得强制降解试验、与另一成熟方法比对 峰纯度二极管阵列、质谱；改变流动相的比例 方法不够专属时，应多个方法予以补充三、杂质检查方法验证的要求.28降解试验的注意点降解程度当降解产物、中间体、副产物吸收波长不同时的处
15、理制剂降解破坏消除辅料的干扰，当无法避开辅料的干扰时应对辅料进行定于予以扣除三、杂质检查方法验证的要求.29 破坏性试验酸降解：一般采用0.1mol/L1mol/L的盐酸或硫酸碱降解：一般采用0.1mol/L1mol/L的氢氧化钠溶液氧化降解采用合适的过氧化氢溶液必要时可以加热或提高浓度对高温试验通常温度高于加速试验温度的10，如50 、60 对于原料药有需要考虑水溶液或混悬液的降解考虑在不同pH值条件下的降解光照试验可采用4500Lx三、杂质检查方法验证的要求.30存在的主要问题（1）主药完全降解，无法对降解产物进行检测（2）由于选择降解条件强度不够，使药物未能降解，而误以为药物稳定（3）不
16、能选择合适的测定方法测定降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低（4）未考虑破坏性试验时产生的聚合物三、杂质检查方法验证的要求.31 2、灵敏度 试样中能被检测（或定量）的最低量 通常用检测限及定量限表征，可根据直观评价、信噪比、响应值的标准差和斜率获得。 应满足质控需要 信噪比的方法 3、精密度 在规定的测试条件下，同一个均匀样品经多次取样测定所得结果之间的接近程度。 重复性、中间精密度、重现性三、杂质检查方法验证的要求.32 4、准确度 测定结果与真实值或参考值接近程度 已知杂质：回收率（根据精密度、专属性、线性）推断 未知杂质：与另一成熟方法比对、根据质量平衡原理结合含量等结果进行粗略判
17、定，必要时研究几种不同色谱条件甚至不同测定原理的方法进行比较选用 5、线性 在设计范围内，检测响应值与待测物质量之间成正比例关系的程度三、杂质检查方法验证的要求.33 6、范围 检测方法能达到一定精密度、准确度和线性的高、低浓度或量的区间 范围应在规定限度的20间或定量限至限度的+20间，若含量测定和杂质检查同用一套色谱系统，则线性范围应为杂质限度的-20至含量限度（上限）的+20 7、耐用性 指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度 HPLC：流动相的组成比例及pH值、不同厂家或批号的色谱柱、柱效、柱温、流速等及被测溶液的稳定性、样品提取的次数和时间等建议固定上述测定条件的参数，如
18、柱长、填料的粒度、温度、流速，甚至品牌三、杂质检查方法验证的要求.347、耐用性TLC：适当改变展开剂比例及pH值，考察耐用性。如对色谱条件苛刻时，规定最难分离物质对试验。较容易忽略8、溶液的稳定性考察一般在常温、常光情况下进行，对同一份样品溶液进行长时间的测定，以杂质量的变化进行考察光或温度引起应在标准中说明避光或试验温度9、系统适用性理论板数、柱拖尾因子、难分离物质对的分离、对照溶液重复进样的偏差否则，应对色谱系统作必要的调整或更换色谱柱三、杂质检查方法验证的要求.351、简单套用被仿制药的检查方法，未建立针对性的方法 例：盐酸伪麻黄碱，分别采用人工合成与植物提取工艺，有机溶剂残留量、有关
19、物质均不同2、方法学验证不充分 强制降解条件过于剧烈，无法判断主峰与降解产物的分离情况 样品经降解、氧化破坏后主药被完全破坏，无法说明其降解物与主峰的分离情况 调整降解条件的剧烈程度3、检查方法对杂质的控制不全面，尤其是对毒性杂质.36建议的质量保证策略 过程控制：控制合成原料的纯度 终产品控制：检查终产品残留的结构异构体4、方法灵敏度不够eg:有关物质检查法的定量限未0.75ng，标准规定杂质限度不得过1.0，折算为0.5ng，表明此方法不能有效检测产品的杂质，需重新建立有效的杂质检测方法.375、方法缺乏互补性eg：（1）合成重要中间体在选定的检测波长处物吸收，建立的有关物质检测方法无法检
20、测该物质（2）建立该中间体适宜的检测方法6、积分时间不充分，不能有效检测杂质氧化破坏试验中，主峰保留时间的3倍处，仍有降解峰出现，色谱图记录至2倍，不能有效检测出有关物质7、检测波长缺乏针对性220nm附近的吸收强度远高于278nm波长处提供检测波长选择的依据.388、供试液制备处理欠妥eg：（1）有关物质检查中供试验制备经过了碱化、萃取等复杂的过程，是否会引起产品中有关物质的变化而影响了检出的结果（2）供试液的制备经过了固相萃取过程，测定结果可能难以如实反映产品中的杂质情况.391、复方制剂的杂质研究 如何进行研究？ 主药的稳定性 将不稳定主药的降解产物和主药带进的毒性杂质或含量较高的杂质（
21、尤其已知杂质）作为杂质研究检测的重要内容，无法兼顾其它杂质时，首先保证此类杂质的监控 制药之间的相互作用，应作为复方制剂杂质研究的重点.40 杂质检测方法的建立参考各原料药的杂质研究，并尽量采用杂质对照品法参照单方制剂杂质研究，难以实现杂质的检测时，综合质量研究的其他项目总体把握杂质的控制 进行其中一个成分的杂质检查 总杂质按其中一个成分的峰面积进行自身对照法测定 总杂质按照两个成分的平均峰面积进行自身对照法测定 按照出峰时间段对两个成分的杂质分别进行自身对照法测定 关键是对杂质的归属和确证.412、多手性中心的手性杂质检查 方法建立较为困难 结合中间过程控制杂质（质量研究源于设计） 计算方法 用响应的异构体的对照品的外标法（或用相应的异构体的对照品定位采用归一化法） 用消旋体的对照品的外标法（或用相应的消旋体的对照品定位采用归一化法） 采用相对保留时间或以出峰次序定位的归一化法.42 药品杂质是否被全面准确地控制，直接关系到药品地质量可控与安全有效 杂质检查依赖于对杂质谱地基础研究 与被仿制药地杂质比较仍是一个难题.43
