1、医学微生物学实验室规则医学微生物学实验室规则：v学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒；反折，要经常清洗消毒；v进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内；存放指定的储物柜内；v严禁在实验室进食、饮水和抽烟；严禁在实验室进食、饮水和抽烟；v手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；液泡手；v实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的垃圾不得随意抛掷，要扔在指定的
2、桶内的垃圾不得随意抛掷，要扔在指定的桶内新乡医学院基础医学院科教科新乡医学院基础医学院科教科 3029945 主讲：马玉龙主讲：马玉龙 15903060813 15903060813 Email: Email: 形态学检查分类形态学检查分类 一、不染色标本检查一、不染色标本检查( (活体）活体） 悬滴法悬滴法 压滴法压滴法 二、染色标本检查二、染色标本检查 单染法：简单染色，一种染料单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色）（美兰染色） 复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染 色、抗酸染色）色、抗酸染色）染色标本检查法的一般步骤染色标本检查法的一般步骤 一、
3、涂片制备一、涂片制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 二、染色二、染色 初染初染 媒染媒染 脱色脱色 复染复染 注：固定的目的注：固定的目的 1、杀死细菌、杀死细菌,保持细菌原有的形态和结构保持细菌原有的形态和结构 2、增加细菌的通透性，使细菌易于着色、增加细菌的通透性，使细菌易于着色 3、使细菌牢牢地黏附在玻片上，不至于在染色、使细菌牢牢地黏附在玻片上，不至于在染色 过程中被水冲掉过程中被水冲掉革兰染色革兰染色(Gram stain)(Gram stain)v18841884年由丹麦医师年由丹麦医师GramGram创立创立v革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初革兰染色是最常用的一种染色
4、方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义上具有非常重要的意义一、目的一、目的1 1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法2 2、了解革兰染色的原理和临床意义、了解革兰染色的原理和临床意义 1 1、通透性学说、通透性学说 2 2、等电点学说、等电点学说 3 3、化学学说、化学学说二、原理二、原理 通透性学说通透性学说G+菌菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易进入度高，脂质含量少，乙醇不易进入G-菌菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层
5、薄且交联度细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易渗入。低，含大量脂质，乙醇易渗入。 等电点学说等电点学说G+菌菌等电点（等电点（pI23）G-菌菌等电点（等电点（pI45） 在相同在相同pH条件下条件下G+菌所带负电荷比菌所带负电荷比G-菌菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。牢固，不易脱色。化学学说化学学说G+菌菌菌体内含有大量菌体内含有大量核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐，可，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色已着色的细菌不易被乙醇脱色G-菌菌 菌体内含菌体内含核糖核酸镁盐核
6、糖核酸镁盐很少，故易很少，故易被脱色被脱色 1、菌种、菌种 葡萄球菌葡萄球菌 大肠杆菌大肠杆菌 2、试剂、试剂 革兰染色液革兰染色液 初染液初染液 结晶紫结晶紫 媒染液媒染液 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 脱色液脱色液 95%95%乙醇乙醇 复染液复染液 稀释石碳酸复红稀释石碳酸复红 3、其它、其它 载玻片载玻片 染色盘染色盘 接种环接种环 酒精灯等酒精灯等三、器材和试剂三、器材和试剂冲洗冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果 四、方法与步骤四、方法与步骤 1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗1、细菌涂片的制备、细菌
7、涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2、染色、染色 初染（结晶紫）初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液）媒染（卢戈氏碘液） 脱色脱色（95%乙醇）乙醇） 复染（稀释石碳酸复红）复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸水纸吸干吸干 v无菌操作（接种环灭菌和取菌）无菌操作（接种环灭菌和取菌）v涂片的厚度要适中涂片的厚度要适中v染色的时间控制，一一半半染色的时间控制，一一半半v冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗五五、注意事项、注意事项一 一 半 半G G+ +菌菌G G- -菌菌结晶紫结晶紫卢戈氏碘液卢戈氏碘液95%95%乙醇乙醇石碳酸复红石碳酸复红初染 媒染 脱色 复染六、结果
8、六、结果图一图二 七、七、临床意义临床意义1 1、鉴别细菌、鉴别细菌2 2、研究与致病性的、研究与致病性的 关系关系3 3、指导临床用药、指导临床用药G G+ +G G- -G G+ + 致病致病 外毒素外毒素G G- - 致病致病 内毒素内毒素G G+ + 青霉素、头孢菌素等青霉素、头孢菌素等G G- - 链霉素、庆大霉素等链霉素、庆大霉素等细菌的特殊结构（示教）细菌的特殊结构（示教）（二毛荚一胞）（二毛荚一胞）从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（功能：鞭毛
9、运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H H抗原）抗原）菌发出比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属菌发出比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质荚膜荚膜细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度0.2m0.2m边界边界明显者称为荚膜，厚度明显者称为荚膜，厚度0.2m0.2m者称为微荚膜者称为微荚膜功能：荚膜护菌强致病功能：荚膜护菌强致病-抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗吞噬作用、抗
10、有害物质损伤、抗干燥作用、黏附作用抗干燥作用、黏附作用菌体内部物质缩水（菌体内部物质缩水（6060）形成圆或卵圆形小体。形成圆或卵圆形小体。功能：芽胞形态辨细菌，功能：芽胞形态辨细菌，灭菌标准抗力强。灭菌标准抗力强。 实验报告实验报告一、目的一、目的二、原理（主要）二、原理（主要）三、材料三、材料四、方法四、方法五、五、结果（结果（2+3幅图）幅图）六、意义六、意义七、注意事项七、注意事项实验结果实验结果v1、绘制所涂片染色的、绘制所涂片染色的G+及及G-菌的形态图并菌的形态图并注注 明放大倍数明放大倍数v2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注明放大倍数
11、明放大倍数 透镜 折光率 油 1.515 1.0 空气 玻 1.52 璃 空 气 油镜原理示意图油镜原理示意图物物 镜镜工作距离工作距离(mm)(mm)低倍目镜低倍目镜105.40高倍目镜高倍目镜400.39油镜头油镜头1000.11油镜的使用方法油镜的使用方法1.寻找视野：寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。野的中心。2.增大光照强度：增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。光圈开到最大。3.转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转高倍镜头
12、、滴加镜油、换油镜头：转动转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。片为宜。4.调试观察：调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按：理想要重新寻找，在加油区之外重找时
13、应按：低倍低倍高倍高倍油镜程序。在加油区内重找应按：油镜程序。在加油区内重找应按：低倍低倍油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。镜头。5.清洗镜头：清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。干擦镜纸擦干净。油镜的使用方法油镜的使用方法革兰染色临床意义革兰染色临床意义临床意义临床意义1 1、鉴别细菌、鉴别细菌2 2、研究与致病、研究与致病 性的关系性的关系3 3、指导临床、指导临床 用药用药G G+ +G G- -G G+ + 致病致病 外毒素外毒素G G- - 致病致病 内毒素内毒素G G+ + 青霉素、头孢菌素等青霉素、头孢菌素等G G- - 链霉素、庆大霉素等链霉素、庆大霉素等预预 习习v细菌的生化反应。病原菌的分离技术细菌的生化反应。病原菌的分离技术v见见P61-67
