1、gP96多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究gP96多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究北京大学人民医院胸部微创中心胸外科博士研究生： 李运导 师： 王俊 教授 研究背景研究背景全世界肺癌病例1910年gP96 or DC科研工作新问题单方面要素两方面要素gP96多价性特异性（抗原库）DC识别抗原激活细胞免疫（专职抗原呈递细胞）研究内容研究内容肺癌组织提取gP96SDSPAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析 蛋白定量分析RT-PCR检测RNA水平表达免疫组化检测蛋白水平表达第一部分第一部分 gp96多肽复合物提取鉴定多肽复合物提取鉴定 在肺癌组织中表达的研究在肺癌组织中表达的研究肺癌组
2、织gP96提取和鉴定；肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；目的目的流程流程定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1g/ul左右，相当于50-80ug/g组织。肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集 正常肺组织中细胞苏木素染色阴性 同一患者标本 GeneN (xs)T (xs)t valuep valuegp960.67250.47131.1100.4467-4.3180.001外周血单个核细胞提取及体外扩增流式细胞仪鉴定gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗体外CTL反应，INF-浓度淋巴细胞表型分析第二部分第二部分 gP96多肽复合物多肽复合物/DC疫苗体外疫苗体外 诱导诱导CTL反应实验研究反
3、应实验研究外周血来源DC培养和鉴定gP96多肽复合物/DC疫苗的制备gP96/DC体外实验 目的目的流程流程培养2-3天后的DC 培养7天后的DC A-1培养前CD1a- A-2. 培养后CD1a+ B-1. 培养前CD86- B-2. 培养后CD86+C-1. 培养前CD83- C-2. 培养后CD83+D-1. 培养前CD80- D-2. 培养后CD80+E-1. 培养前CD14+ E-2. 培养后CD14- CD14-；CD80+；CD83+；CD86+ 培养前淋巴细胞的CD3 培养10d后淋巴细胞的CD3 培养前淋巴细胞的CD4、CD8 培养10d淋巴细胞的CD4、CD8CD3/CD8
4、T细胞明显增加；CD8/CD4细胞比例增加00.10.20.30.40.50.60.70.80.91020040060080010001200Concentration (pg/ml)OD样本ELISA反应的OD值(XS)释放IFN-的量（pg/ml）gp96/DC2.2440.1334150.835gp961.6740.1623066.847DC0.1260.011122.966不同形式的肿瘤抗原负载DC后诱导的CTL反应050010001500200025003000350040004500释放IFN-的量（pg/ml）gp96/DCgp96DC建立动物模型以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤观
5、察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间第三部分第三部分 gP96多肽复合物多肽复合物/DC疫苗疫苗 动物体内实验研究动物体内实验研究 gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究 目的目的流程流程LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积020004000600080001000012000种植一周二周三周四周五周六
6、周肿瘤种植时间肿瘤体积（mm）615小鼠未免疫组615小鼠DC免疫组615小鼠GP96免疫组615小鼠GP96+DC免疫组100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（xs cm）组数处理动物数肿瘤植入后天数212835种植102.630.876.461.478.041.40GP968 0.330.27 0.700.621.491.17DC8 0.300.22 0.640.491.160.92GP96+DC8 0.210.220.320.30 0.620.30615-LA795：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05 ：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05 6
7、15小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数种植1052GP968 51.5DC8 58.5GP96+DC8 77SCID-PAa：与组比较， P0.05。：与组和组比较，P0.05 SCID小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积(XScm)组数处理动物数肿瘤植入后天数212832重建160.380.120.750.300.900.33GP9680.090.06 0.170.060.220.11DC80.080.060.150.080.240.11GP96+DC80.030.03 0.080.080.120.1387.5%100%SCID小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积0100200
8、300400500600700800种植一周二周三周四周肿瘤种植时间肿瘤体积（mm）SCID小鼠未免疫组SCID小鼠DC免疫组SCID小鼠GP96免疫组SCID小鼠GP96+DC免疫组SCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数重建1637GP96852DC852.5GP96+DC862讨讨 论论gP96在肺癌中的表达基因表达的检测 mRNA水平：原位杂交、Northern Blot、核酸酶保护分析 Real-time RT-PCR、半定量RT-PCR 。蛋白水平。 方法比较原位杂交 仅能提供mRNA在细胞内的定位信息，不能确定mRNA的含量，受人为因素影响大，无法检测极微
9、量的mRNA Northern Blot 敏感性低，样品用量大，对实验条件要求高，需要应用放射性物质，不适合检测低丰度的mRNA Real-time RT-PCR 仪器和试剂盒价格昂贵，标准物难以获得 核酸酶保护分析 操作复杂，价格昂贵 半定量RT-PCR 高度敏感、准确、简便、快捷、对仪器要求低、可重复性强、易于掌握 与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因在mRNA水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以gp96为代表的HSPs合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。 半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺
10、癌组织正常肺组织免疫组化法蛋白水平引物设计循环次数操作中注意：模板内对照gP96的提取 提取gP96的经典方法（Srivastava）：饱和硫酸铵沉淀刀豆球蛋白A亲和层析DEAE离子交换层析（提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织 ）存在的普遍问题： 蛋白提取率低 ，尚无法满足临床需要解决：更改其中的试剂或步骤： 去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱 增加组织中gP96含量： 热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量 DC的来源来源培养方法建立比较脐带血 1992肿瘤患者
11、多无法获得 外周血 1994取材容易，操作简单，DC生成量大，纯度高，可以反复进行，患者痛苦小，便于临床应用，是目前获得DC的较理想的途径。 骨髓 1995穿刺操作复杂，获得细胞量少，需多点反复操作，可能会增加创伤，给患者造成极大的痛苦 DC的分离和培养分离纯化DC的方法 物理方法 根据细胞的黏附性进行分离 黏附分离法、尼龙毛分离法和羰基碳分离法等 根据细胞比重进行分离 葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心及E花环沉淀分离等方法 免疫分选 淘洗法、流式细胞技术、磁性细胞分离术等方法 密度梯度离心获取单个核细胞富集前体DC细胞因子体外扩增培养富
12、集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏附法直接黏附法对细胞干扰小，DC获得率高间接黏附法培养体系小，节省细胞因子，细胞损伤大，DC获得率低单抗法免疫磁珠和流式细胞技术需要大量的特殊抗体，细胞损失量大，价格昂贵，细胞因子 作用必需GM-CSF促进DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒细胞和巨噬细胞增殖争议TNF-促进DC成熟，抑制粒细胞产生 Flt3L促进DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-、INF-及IL-1等方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特别是CD83-树突状细胞的标志性分子准确功能状
13、态混合淋巴细胞反应DC的鉴定关于动物肿瘤模型动物模型的优越性：避免了在人身上进行实验所带来的风险 临床上少见疾病可用动物随时复制出来研究周期短，节省时间，克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点可在人为控制条件下进行实验可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性 取材方便，可以简化实验操作和样品收集成本低有助于更全面地认识疾病的本质 按产生原因 自发性肿瘤模型 实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病 诱发性肿瘤模型 使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物诱发肿瘤 移植性肿瘤模型 人类肿瘤移植动物按系统范围 疾病的基本病理过程模型 各种疾病共同的一些病理变化过程
14、的模型 各系统疾病模型 与人类各系统疾病相应的模型 按模型种类 整体 模型离体器官和组织 细胞株 分类已建立动物模型的人类肿瘤：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胶质瘤等常用的动物：小鼠、大鼠、兔、鸡胚等近交系小鼠：BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID小鼠等五十余种SCID小鼠16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突变基因重排异常免疫球蛋白重链T细胞抗原受体T、B淋巴细胞前体分化T、B淋巴细胞细胞免疫体液免疫免疫球蛋白缺如淋巴细胞严重减少对体外移植物免疫排斥低联合缺陷+1983年Bosma免疫重建1988年Moiser骨髓胸腺脾胎肝
15、外周血淋巴细胞腹腔皮下免疫系统恢复且具有人类免疫系统的特征与人体内环境极其类似保证了患者本身的安全带有人类肿瘤具有人类免疫系统研究肿瘤生长的理想动物模型gP96/DC在体外可诱发强烈的在体外可诱发强烈的CTL反应反应 在体内可有效抑制肿瘤生长在体内可有效抑制肿瘤生长 gP96+DC-特异性+多价性-避免了肿瘤的免疫逃逸探寻机制抗原肽（小分子）DCgP96+抗原肽CD91T淋巴细胞MHC分子、共刺激分子粘附分子体外扩增培养DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接与T淋巴细胞接触发生作用未接触肿瘤抗原不需激活肿瘤抗原非专职抗原呈递细胞抗原特异性免疫耐受专职抗原呈递细胞特异性免疫防御反应结结 论论gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长，延长宿主生存时间属于个体化治疗方案，是未来原发肿瘤切除后微小转移灶的预防和治疗的有效措施之一 gP96在肺癌组织中RNA和蛋白水平的表达明显高于正常肺组织gP96/DC疫苗在体外可激发更强烈的CTL反应，刺激T淋巴细胞增殖，CD8+/CD4+细胞比例增加，并使T淋巴细胞IFN-分泌明显增加
