1、化妆品微生物检验化妆品微生物检验 化妆品因含有水分，油脂，蛋白质，多元醇等，为微生物的生长创造了良好的条件，造成产品变质。 为了抑制微生物的繁殖和消费者使用过程中的产品污染，往往在化妆品中加入防腐剂(尼珀尔金甲脂、乙酯、丙脂及苯氧乙醇等)，但不能过量。 因此，化妆品一方面为微生物的生长繁殖提供了良好的环境；另一方面由于防腐剂的应用又可抑制微生物的生长。 为了避免测试结果可能出现假阴性（实际应该生长或是污染了，由于防腐剂的存在而导致结果不生长或是结果偏小），需要添加中和剂。化妆品中常用的中和剂样品中：国际方法：尼泊金酯类防腐剂的中和剂：吐温80（30g/L）和卵磷脂(3g/L)+普通肉汤。化妆品
2、安全技术规范：培养基成分中直接有卵磷脂（1g）吐温80（7g）。（稀释法也能同步起到中和的效果）生产用水中的余氯：每125ml水样中加入0.1mg硫代硫酸钠。（注意添加方式和使用范围）化妆品卫生标准微生物检验方法（2015版化妆品安全技术规范）GB/T 7918.1-1987 化妆品微生物标准检验方法 总则 菌落总数 （2015版化妆品安全技术规范）GB/T 7918.2-1987 化妆品微生物标准检验方法 耐热大肠菌群（2015版化妆品安全技术规范）粪大肠菌群：GB/T 7918.3-1987 化妆品微生物标准检验方法 铜绿假单胞菌 （2015版化妆品安全技术规范）GB/T 7918.4-1
3、987 化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 （2015版化妆品安全技术规范）GB/T 7918.5-1987 化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌 霉菌和酵母菌：（2015版化妆品安全技术规范） 方法比较侧重点侧重点2007版化妆品卫生规范版化妆品卫生规范2015版化妆品安全技术规范版化妆品安全技术规范仪器和设备 规格没有规定有：天平/培养箱样品采集全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。直接删除如为5mL 则加到45mL 灭菌生理盐水
4、，混匀后，制成1：10 检液。直接删除2007版化妆品卫生规范与2015版化妆品安全技术规范对比：总则总则重点1.具有代表性。2.不少于2个包装单位的取样中共取10g或10mL。3.供检样品，应严供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。在检验前不得打开，防止样品被污染。4.应置于室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。4.宜先取出部分样品做微生物检验。5.严格上微生物无复测一说。（可能的因素多），因此对微生物检验人员要求严格。6.生物安全开始重视。详细操作步骤侧重点侧重点2007版化妆品卫生规范版化妆品卫生规范2015
5、版化妆品安全技术规范版化妆品安全技术规范菌落总数定义嗜中温的需氧性菌落总数需氧性和兼性厌氧菌落总数TTC121 /20min 高压灭菌溶解后过滤除菌，或115高压灭菌20minWHO更改粪大肠菌群（Fecal coliforms）耐热大肠菌群 Thermotolerant coliform bacteria大肠培养温度和培养时间置440.5培养箱中培养24h48h置44.50.5培养箱中培养24h，如既不产酸也不产气，继续培养至48h霉菌和酵母菌置282培养72h 置282培养5d（读数时间灵活）详细操作步骤重点1.所配制培养基可冷藏和冷却备用为分步骤检测提供基础。2.菌落总数和霉菌酵母菌总数
6、a.单位CFU/g或CFU/ml。b.二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。c.“不可计”注明稀释度。Colony Forming Unitsd.特有的形态和培养特性（霉菌和酵母菌）。样品的制备 液体样品 膏、霜、乳剂半固体状样品 固体样品样品的制备注意事项无菌容器、材料及操作样品的均一性玻璃珠磁力搅拌均质器样品的检验及保管 及时检验样品应放在室温阴凉干燥处样品先进行微生物检验(原料)，再做其他指标须防止微生物的再污染和扩散测试方法：菌落总数检验 菌落总数（Aerobic bacterial count）：化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培
7、养时间、pH值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性和兼性厌氧菌落总数。 测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。 测试流程48小时出结果（30-300）：数据数据处理处理混合平板混合平板的制备的制备细菌的培细菌的培养养检查结果、检查结果、观察与计数观察与计数供试液供试液的制备的制备书写检验书写检验记录单记录单TTC亦不可多加会抑制菌落生长 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色
8、，而化妆品的颗粒颜色无变化。接种阳性菌计算回收率 推荐了解： 人员培训能力掌握的检验重要指标。 有条件可做视具体样品测试结果。 在膏霜类化妆品中,微生物都是吸附或附着于颗粒状的原料中,检测时不易洗脱下来,因此,需要验证检测方法的有效性。耐热大肠菌群 未检出2天，检出3-4天 耐热大肠菌群 Thermotolerant coliform bacteria系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5培养24h48h能发酵乳糖产酸并产气。 该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量, 推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。产酸：黄色产酸：黄色产气：气泡产气：气泡产
9、酸产气产酸产气书写检验书写检验记录单记录单不产酸不产气不产酸不产气增增菌菌培培养养供试供试液的液的制备制备配培配培养基养基和稀和稀释液释液检查检查结果结果判断判断44.544.50.50.524-24-48h48h分离培养分离培养蛋白胨水蛋白胨水培养培养最终结最终结果判断果判断44.544.50.50.5 24242h2h靛基质靛基质特特征征菌菌落落36361 1 1824h1824h双倍胆盐乳糖双倍胆盐乳糖EMBEMB琼脂琼脂液面玫瑰红色液面玫瑰红色紫黑色紫黑色粪大肠菌群检查流程图粪大肠菌群检查流程图镜检镜检结果报告铜绿假单胞菌 未检出2天，检出4天 铜绿假单胞菌（Pseudomonas a
10、eruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在 421条件下能生长。 该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。在自然界中分布甚广，空气、水、土壤最终结最终结果判断果判断增增菌菌培培养养供试供试液的液的制备制备书写检验书写检验记录单记录单分分离离纯纯化化无菌落或无特征菌落无菌落或无特征菌落配培配培养基养基和稀和稀释液释液革兰染色、镜检革兰染色、镜检 氧化酶试验氧化酶试验 绿脓菌素试验绿脓菌素试验生化试验生化试验 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 4242生长试验生长试验 明胶液化试验明胶液化试验铜绿假单胞菌检查流程图
11、铜绿假单胞菌检查流程图SCDLPSCDLP培养基培养基十六烷三甲基十六烷三甲基溴化铵琼脂溴化铵琼脂3636111824h1824h3636111824h1824h特征菌落特征菌落灰白色、扁灰白色、扁平、周围有平、周围有水溶性蓝绿水溶性蓝绿色素色素镜检镜检十六烷三甲基溴化铵平板十六烷三甲基溴化铵平板SCDLP培养基培养基黄绿色黄绿色菌膜菌膜灰白色灰白色湿润湿润氧化酶试验氧化酶试验粉红粉红/紫红色紫红色绿脓菌素试验绿脓菌素试验盐酸层呈粉紫色盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色氯仿层呈蓝绿色硝酸盐还原产气试验硝酸盐还原产气试验N2明胶液化明胶液化试验试验明胶培养基（高层）明胶培养基（高层）明胶液化明胶液化结
12、果报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌未检出2天，检出3天金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。革兰染色、镜检革兰染色、镜检 生化试验生化试验: :血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验甘露醇发酵试
13、验最终结最终结果判断果判断增增菌菌培培养养供试供试品的品的处理处理书写检验书写检验记录单记录单分分离离纯纯化化无菌落或无特征菌落无菌落或无特征菌落配培配培养基养基和稀和稀释液释液363611363611SCDLPSCDLP培养基或培养基或7.5%NaCl7.5%NaCl肉汤肉汤24242h hBaird ParkersBaird Parkers或血琼脂或血琼脂2448h2448h特征菌落特征菌落金黄色葡萄球菌检查流程图金黄色葡萄球菌检查流程图镜检镜检耐盐分耐盐分Baird ParkersBaird Parkers平板平板灰灰/黑色黑色血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验血浆凝块血浆凝块液态血浆液态血浆
14、甘露醇高盐琼脂结果报告凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。霉菌和酵母菌 霉菌和酵母菌数测定（Determination of molds and yeast count）化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。 本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置282培养5d，计算所生长的霉菌和酵母菌数。（5-50）革兰氏染色检验结果正确的保证 设备方面： 恒温培养设备 高压灭菌
15、器（验证） 超净工作台（生物安全柜） 均质器(旋涡混合器) 天平（0.1g） 显微镜（可要可不要无硬性要求）压力灭菌器的检定（强检）出厂合格证：只是表示该仪器设备符合出厂标准。安全需要强检（安全阀和压力表）。至于温度性能紧急时可以用厂家校准证书替代。问题1：量值得传递过程？结论？量值溯源过程？常规洁净工作台？ 试剂要求： 无菌容器（？）及溶液； 试剂充足； 空间充分（10平方米2人操作）； 培养基的制备（有效期的确认）与质量控制（促生长与回收率的验证）推荐项；目前大部分微生物实验室 人员操作方面： 无菌操作，避免污染； 一定专业技术或工作经验（招聘与外部审核时） 相互协作； 测试结果的证明。
16、日常维护： 设备的计量与保证； 超净台及时清洁与杀菌（操作前后半小时）； 检验后材料的及时处理； 环境卫生（沉降菌的检测每周）。油性样品如何处理稀释液生理盐水-极性溶剂、液体石蜡-非极性溶剂、吐温80-非离子型表面活性剂，分子一端是亲水基团，一端是亲油基团，常用作增溶剂和油/水乳化剂。决定了加入的顺序。问题2微生物许可检验项目问题3检验项目非特殊用途化妆品特殊用途化妆品育发 类染发类烫发类脱毛类美乳类健美类除臭类祛斑类防晒类菌落总数 耐热大肠菌群 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 霉菌和酵母菌 注： 指甲油卸除液不需要测微生物项目。 乙醇含量75%（w/w）者不需要测微生物项目。 配方中没有微生物抑制作用成分的产品（如物理脱毛类产品、纯植物染发类产品等）需测微生物项目。 一个样品包装内有两个以上独立小包装或分隔（如粉饼、眼影、腮红等），且只有一个产品名称，原料成分不同的样品，应当分别检验相应项目；非独立小包装或无分隔部分，且各部分除着色剂以外的其他原料成分相同的样品，应当按说明书使用方法确定是否分别进行检验。重点讨论 谢 谢 大 家！
