1、西北大学硕士学位论文答辩答辩人：姚敏杰答辩人：姚敏杰专专 业：分子微生物学业：分子微生物学导导 师：陈师：陈 超超 教授教授 崔亚丽崔亚丽 教授教授西北大学硕士学位论文答辩2 西北大学硕士学位论文答辩3特异性、敏感性、样品制备和标记繁琐、仪器的研制和机械化程度不高大规模、高通量快速、自动化程度高DNA芯片技术敏感性较低特异性好bDNA技术工作量大，实际应用受到限制假阳性率较低差异杂交灵敏度低，操作繁琐复杂特异性强印迹杂交不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。操作简单，事先无需对核酸样品进行特殊处理，一张膜可同时检测多个样品斑点杂交/狭线杂交组织原位杂交操作繁琐，费
2、时耗力特异性高，可精确定位菌落原位杂交原位杂交缺点优点方法种类西北大学硕士学位论文答辩4 磁性微粒的研究始于上世纪70年代，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行修饰，共价偶联蛋白、核酸等有机/生物分子， 并且具有顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离而广泛应用于免疫学检测、靶向载药、细胞分选、酶的固定化以及分子生物学（DNA和RNA的测序与纯化）等领域中。 技术优势技术优势灵敏度高、特异性强灵敏度高、特异性强实用性、操作性强实用性、操作性强仪器设备简单、省时省力仪器设备简单、省时省力西北大学硕士学位论文答辩5 液态悬浮芯片技术是指一项将核苷酸、抗原、抗体、受体、肽链及酶底
3、物等生物大分子结合在荧光微球表面，根据生物测定的原理，与待测样品中的相应物质发生特异性反应，然后借助流式细胞仪对检测结果进行实时定量化分析的技术。技术优势技术优势高通量、快速分析高通量、快速分析高特异性、高精确性、高灵敏度高特异性、高精确性、高灵敏度省时、省力、经济省时、省力、经济西北大学硕士学位论文答辩6RNADNA后续检测后续检测标记检测探针固相基质固相基质标记物753+53分别代表不同的碱基标记物图解引物西北大学硕士学位论文答辩8西北大学硕士学位论文答辩9实验原理实验原理探针与磁性微粒的偶联探针与磁性微粒的偶联靶片段的扩增靶片段的扩增单碱基链延伸单碱基链延伸荧光信号的引入以及结果的读取荧
4、光信号的引入以及结果的读取实验小结实验小结10A：jingwen Chen 等检测SNP原理示意图1B：本研究设计原理示意图1 jing wen Chen, Marie A. lannone et al. A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension J . G e n o m e R e s e a r c h . 2 0 0 0 , 1 0 : 5 4 9 - 5 5 711苯异二硫氰酸酯 丙基三甲氧基硅烷
5、A：羧基末端磁性微粒 B：氨基末端磁性微粒 C：环氧乙烷磁性微粒西北大学硕士学位论文答辩12磁性微粒的种类羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、环氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒优选内容探针在磁性微粒表面最大偶联量探针在磁性微粒表面的偶联效率经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量探针在磁性微粒表面偶联所用时间选用材料的价格96 5 min 5 min+5个循环 5 min+10个循环 5 min+20个循环 5 min+30个循环 13磁性微粒优选结果1.最大偶联量和偶联效率1.5 mg磁性微粒加入量(mg)97.600.0197.200.0184.600.0266.000.010.6500.
6、010.6500.010.7900.010.4400.011 nmol羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒环氧乙烷磁性微粒氨基末端磁性微粒探针与磁性微粒的偶联效率(%)每毫克磁性微粒表面的探针偶联量(nmol)探针加入量(nmol)磁性微粒种类2.经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量2.89%4.26%15.70%64.00%2.10%3.78%19.90%55.80%1.42%3.50%23.30%53.70%1.36%2.77%31.30%47.10%0.59%1.61%28.10%24.90%羧基Dynal环氧乙烷氨基5 min+30个循环5 min+20个循环5 min+10个循环5
7、min+5个循环96 5 min磁性微粒种类热处理反应时间西北大学硕士学位论文答辩14磁性微粒种类价格（￥/mg/ml）偶联所需时间（h）辅助仪器设备羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒氨基末端磁性微粒环氧乙烷磁性微粒9.648.43.610.41.51.53.53.5磁性分离器（磁架）磁性分离器可控温摇床可控温摇床最终选取羧基末端磁性微粒进行后续研究西北大学硕士学位论文答辩15不对称PCR扩增反应体系与扩增条件试剂加入量终浓度上游引物0.625 L待定下游引物0.625 L待定dNTP2 L0.16 nmol/L反应缓冲液（10 Buffer）2.5 L10 mmol/LMgCl22.5 L2
8、.5 mmol/LDNA聚合酶0.5 L2.5 U无核酶水（dd H2O）14.25 L模板量2 L72 10min 955 min9430 s5530 s7230 cycles4 hold30 s16500bp250bpssDNAdsDNAM：Maker DL-2000，Y：上下游引物浓度为1:1时扩增结果，：PCR空白对照50:1：上下游引物浓度为50:1的扩增结果，75:1：上下游引物浓度为75:1的扩增结果，100:1：上下游引物浓度为100:1的扩增结果西北大学硕士学位论文答辩17补至20 L已杂交的产物各1 L10 mol/L ddTTP、ddCTP、ddGTP1 L10 mol/
9、L Biotin-ddATP0.5 LrTaq聚合酶0.8 L25 mmol/L MgCl20.8 L1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）加入量反应试剂磁性微粒表面的单碱基链延伸反应体系补至50 L无核酶水（dd H2O）16 L4.5 mol/L TMAC20 L不对称PCR扩增产物12 L偶联有探针的磁性微粒复合物加入量反应试剂杂交反应体系18洗涤条件的优化分别用1PBST洗涤4次、2次、1次选取最佳结果ATGC重复2次对照对照重复2次洗4次结果洗2次结果ATGC重复2次对照洗1次结果ATGC西北大学硕士学位论文答辩19波长/nm吸光度值500 bp250 bpssDNAdsD
10、NAMDL2000 Y对称扩增结果（阳性对照）50:1不对称扩增结果 空白对照（上样量均为：5 LPCR产物+1 L 10loading buffer）西北大学硕士学位论文答辩2071246对照组591128891实验组CGTA 核酸位点荧光值荧光检测值0.901.171.38阳性值/阴性值7.25阴性平均背景值152.56.58.510阳性检测值CGTA核酸位点荧光检测值结果分析西北大学硕士学位论文答辩211. 基于单碱基链延伸反应原理初步建立了DNA杂交检测的方法。在检测大肠杆菌待测核酸DNA时，获取阳性信号是对照组的21倍。证明该方法用于DNA杂交检测的可行性、特异性和准确性。2. 对4
11、种不同的磁性微粒进行筛选，初选出与探针偶联效率高、偶联量高而稳定、磁性微粒可经过长时间高温处理且表面修饰的功能基团损失较少的磁性微粒。3. 利用不对称PCR扩增产生一定量单链PCR产物，免除了用NaOH处理PCR产物以便双链DNA变为单链的步骤，简化了杂交反应操作和缩短了时间，增大了杂交检测法的实用性。西北大学硕士学位论文答辩22西北大学硕士学位论文答辩23 人乳头瘤病毒是乳多空病毒科乳头瘤病毒属的一个双链环状DNA病毒，其颗粒呈球形，呈二十面体对称，直径约4555 nm，分子长度约为7.88 kb。 HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养。因此，目前对HPV 感染的分型诊断，主要依赖分子生物学
12、手段对病毒DNA检测。现有的检测方法对操作人员技术水平要求高，试剂昂贵；所需临床标本量大，甚至还需对临床标本多次扩增及多次分离分析，整个过程颇为复杂。因此，对HPV进行早期、快速检测和型别鉴定具有重要的临床意义。 主要感染上皮组织，显示高度的宿主特异性，对人体特异部位的上皮细胞具亲和力。通过人体间密切接触传播，可引起寻常疣，尖锐湿疣，宫颈癌等疾病。迄今已发现有120余型HPV。24 HPV的分型主要根据其基因组的同源性不同进行分型，作为新的一型HPV，其基因组可被完全克隆，L1、E6 及E7开放阅读框与其它型基因组比较，具有低于90%的同源性。研究发现，在外阴、宫颈部位，感染HPV最常见的低危
13、类型有HPV6，HPV11和HPV53；高危类型有HPV16，HPV33，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58等，这些类型占外生殖器部位感染类型的96%左右。 选择的探针参考M.V.JACOBS 2设计。通过使用美国NCBI数据库做BLAST比对研究，结果每一型探针与其它型HPV间未出现型间交叉相互干扰的现象。 2 Dunbar, S.A. and J.W. Jacobson. Application of the Luminex LabMAP in rapid screening for mutations in the cystic fibrosis tr
14、ansmembrane conductance regulator gene: A pilot study. Clinical ChemistryJ.2000,46:1498-1500.西北大学硕士学位论文答辩26HPV类型微球编码探针序列（5 to 3）3HPV18HPV31HPV35106155166TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCATGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATACGTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA3M. V. JACOBS, A. M. DE RODA HUSMAN, A. J. C. VAN DEN BRU
15、LE, P. J. F, et al. Group-Specific Differentiation between High- and Low-Risk Human Papillomavirus Genotypes by General Primer-Mediated PCR and Two Cocktails of Oligonucleotide ProbesJ. CLIN. MICROBIOL. 1995, 33(4): 901-905 西北大学硕士学位论文答辩275 L模板量29.5 L无核酶水（dd H2O）1.25 U0.5 LDNA聚合酶1.5 mmol/L4 LMgCl210
16、mmol/L5 L反应缓冲液（10 Buffer）0.2 nmol/L2 LdNTP0.4 nmol/L2 L下游引物GP6+0.4 nmol/L2 L上游引物GP5+终浓度加入量试剂72 5 min 955 min9430 s5530 s7240 cycles4 hold45 s西北大学硕士学位论文答辩28100 bp250 bpM：DL2000；1：PCR空白对照；2：HPV 18；3：HPV 31；4：HPV35 （上样量均为：5 LPCR产物+1 L 10loading buffer）2972.925.418.05阳性值/阴性值51.282.0114.5阴性平均背景值3730.0208
17、4.0922.0阳性检测值35型31型18型质粒名称检测单纯一型HPV标准质粒结果分析表3730.077.068.0HPV35型96.068.02084.0HPV31型105.0922.0124.0HPV18型35型18型31型166106155 微球+探针 荧光值质粒检测单纯一型HPV标准质粒的数据 西北大学硕士学位论文答辩301. 以液态悬浮基因芯片为技术平台，初步建立HPV DNA杂交检测分型的方法。本方法选取的3种型特异性探针以共价键分别偶联至3种不同的荧光微球，表面探针密度高，产生信号强，同时荧光检测使信号进一步得到放大，所以敏感性大大提高，实验结果显示杂交值/未杂交值最高可达近百倍
18、，最低也有8倍以上。2. 3种荧光微球探针对应的标准品PCR产物具有特异性的杂交反应，彼此间并不相互干扰，对于产物中单一型HPV存在的情况下，根据所对应荧光信号对待测DNA进行确定，可100的分析出HPV型别。 3. 杂交过程在悬浮的液相中进行，杂交后不用清洗就可以直接读数，检测效率远远高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到30分钟，快速、可靠、操作简便。并且临床检测中使用通用引物，仅需一次PCR扩增即可检测3种最常见的高危型HPV，既提高了检测的通量，也大大降低了临床标本的用量。西北大学硕士学位论文答辩311.本文利用液态悬浮的羧基末端磁性微粒和液态荧光微球为载体，构建了杂交检 测DNA的新方
19、法，具有操作简便、省时省力、经济实用、结果判别准确等特 点。 2.以羧基末端磁性微粒构建的DNA检测方法，每毫克磁性微粒表面最大可偶联针 0.65 nmol，偶联效率可达97.60，根据单碱基链延伸原理的检测点是空白点荧 光强度的21倍，证明该反应体系的正确性与可靠性。在外加磁场的作用下很容易 与未杂交的核酸或探针分离，大大简化了操作步骤，为进一步检测节约时间。3.以荧光微球为技术平台建立的方法，所选取的3种型特异性探针以共价键分别偶 联至3种不同的荧光微球，实验结果显示杂交值/未杂交值最高可达近百倍，最低 也有8倍以上。杂交过程在悬浮的液相中进行，杂交后不用清洗就可以直接读数 ，检测效率远远高于固相杂交，所用时间缩短至30分钟，快速、可靠、操作简 便。
