1、第一章 绪论1. 酶工程地位生物工程（生物技术）基因工程细胞工程酶工程发酵工程2. 酶是什么？ 酶（enzyme)是具有催化反应功能的蛋白质。 19世纪中叶，巴斯德认为活的酵母细胞内有一种可以将糖发酵为乙醇的物质。 1878年，Kunne将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。希腊文的意思是“在酵母中” 1926年，Sumner首次从刀豆提取液中得到尿酶结晶，并证明其为蛋白质。 核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂。 1982年，Cech在四膜虫中发现核酶。酶的发展史4000多年前，酿酒，不自觉利用酶的时代1833年第一次分离到酶，淀粉酶19世纪中叶，Pasteur提出活
2、酵母内存在一种将糖转化为乙醇的物质，1878，Kunne首次将其称为酶（Enzyme，源于希腊文，意思是在酵母中）1913，米氏方程1926年，Sumner首次从刀豆中纯化得到脲酶结晶，并证明其为蛋白质。获得1947年的诺贝尔奖。1950s，Koshland提出诱导契合学说，解释了酶的转移性。1969年，Jacob和Monod提出操纵子学说，阐明酶生物合成的调控机制。1982年，Cech发现四膜虫的核酶Ribozyme。获得1989年诺贝尔奖。1980s，非水相催化3. 酶学理论研究 脲酶结晶的获得与蛋白质本质 锁匙学说与诱导契合学说 中间络合物学说与酶促反应动力学 酶作用机理（酶理化性质及催
3、化性质）的研究 酶蛋白质一级结构测定方法 酶蛋白分子结构与功能的关系 酶学是生物化学的重要分支4. 酶工程应用研究1、酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发；、酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发；2、酶生产中的基因工程技术的应用；、酶生产中的基因工程技术的应用；3、酶分子的改造、酶分子的改造(修饰、模拟与抗体酶等）；修饰、模拟与抗体酶等）；4、酶与细胞的固定化；、酶与细胞的固定化；5、酶制剂的应用性开发；、酶制剂的应用性开发；6、生物催化；、生物催化；7、酶抑制剂、激活剂开发及应用研究；、酶抑制剂、激活剂开发及应用研究；8、酶反应器的研究（包括反应检测、酶传感器）；、酶反应器的研究
4、（包括反应检测、酶传感器）； 酶工程（酶工程（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering）是生物工程的主要内容之）是生物工程的主要内容之一，是随着酶学研究迅速发展、特别是酶的应用推广，使一，是随着酶学研究迅速发展、特别是酶的应用推广，使酶学和工程学相互渗透结合，发展而成的一门新的技术科酶学和工程学相互渗透结合，发展而成的一门新的技术科学。学。5. 酶的重要性 生命离不开酶； 酶是现代生命科学的重要工具； 生物催化改造传统产业工业生物技术 已发现生物体内的酶接近10000种，数百种得到结晶。 X-Ray，Maldi-TOF成为现代重要研究工具6. 酶催化作用的特点
5、酶催化作用的专一性强 酶催化作用的效率高 酶催化作用的条件温和7. 酶的分类和命名 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶8. 米氏方程 Michaelis & Menten根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称为米氏方程：Km + SVmax SV = 米氏方程的推导：米氏方程的推导： 根据中间产物学说：根据中间产物学说：式中式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知：分别为各反应常数，可知： ES形成速度形成速度= K1 E S ES分解速度分解速度=(K2, + K3 ) ES当反应达恒稳态时当反应达恒稳态时,二速度相等二速度相等,即即: K1 E
6、 S =(K2, + K3 ) ESS + E ES E + PK1K3K2整理并令：整理并令： 由于由于E 与与ES之和为总的酶浓度之和为总的酶浓度E0 , 即即: E0= E +ES E = E0ES 将代入将代入: ESK1=E S (K2, + K3 )KmES=(E0ES) SKm 整理得整理得:酶促反应速度由酶促反应速度由ES决定决定,而而v= K3 ES ES=将代入整理得将代入整理得:ES=E0SKm+SvK3=E0SKm+SvK3 此时达到最大反应速度此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 E0 将代入将代入 即为米氏方程即为米氏方程 当当S 升高升高,所有所有E为
7、为S所饱和时所饱和时,即即: E0 =ES=SKm+SvVmax 关于米氏方程的讨论关于米氏方程的讨论1、 Km S 时时： v=VS/ Km 初速度与初速度与S成正比的成正比的一级反应一级反应。2、若若Km 100KmS100Km时：时：v= Vmv= Vm S / (Km +S) S / (Km +S) VmVm，即反，即反应初速度接近于最大速度。而应初速度接近于最大速度。而Vm Vm = = K K3 3 EE0 0 ，即，即酶活性直酶活性直接正比于接正比于EE0 0 ，而与，而与SS无关无关（表明酶活性部位全部被底（表明酶活性部位全部被底物占据）。物占据）。在测定酶活性时，一般选择此条
8、件。在测定酶活性时，一般选择此条件。 vSS或PS0SPS0/2t1/2=S0/2Vmt 测定酶活力的基本要求：测定酶活力的基本要求：1 1、要使反应系统中要使反应系统中除除待测酶浓度待测酶浓度是影响反应速度是影响反应速度的的唯一限制性因素唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；（反应速度定量酶活力）；2 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作：几方面做工作： 底物？底物？ pHpH？ 温度？温度？ 样品？样品？ （二）（二）、测定条件
9、选择：、测定条件选择： 1 1、底物、底物 种类选择：最适底物，如种类选择：最适底物，如- a a）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则选选KmKm最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作底物（胰凝乳蛋白酶对肽键、酯键、酰胺键）；底物（胰凝乳蛋白酶对肽键、酯键、酰胺键）； b b）要求）要求反应前后有可测定的理化性质变化，如：反应前后有可测定的理化性质变化，如： 脱氢酶的脱氢酶的NADNAD+ +、溶菌酶、溶菌酶 c c）稳定）稳定 浓度选择：浓度选择： a a） s=100Kms=100Km； b b） 有时不宜采
10、用高底物浓度（有有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等酶反应等) )则根据具体条件，通则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。过实验选一适当浓度。 2、最适最适pH a a）选择最适）选择最适pHpH并维持在这一范围。并维持在这一范围。 b b）pHpH的稳定通常借助缓冲系统来控制，的稳定通常借助缓冲系统来控制，要要 求稳定、无干扰、价廉。求稳定、无干扰、价廉。 C C）离子种类和强度。）离子种类和强度。 如：柠檬酸、磷酸系统等。可查表选取。如：柠檬酸、磷酸系统等。可查表选取。 3 3、 最适温度最适温度 酶反应温度系数为每变化酶反应温度系数
11、为每变化 1 1 摄氏度，反应速度相差摄氏度，反应速度相差10%10%以上。以上。所以测酶活力时温度保持恒定十分所以测酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在正负重要，一般应控制在正负1 1摄氏度摄氏度以内。以内。 4 4、样品、样品 对某一待测样品测定前对某一待测样品测定前, ,除了上述因素除了上述因素需考虑外，还有一个重要问题是对样品的需考虑外，还有一个重要问题是对样品的了解，要确定样品中有无干扰测定结果的了解，要确定样品中有无干扰测定结果的因素因素（与待测酶作用同一底物或生成同一（与待测酶作用同一底物或生成同一产物的其它酶）。产物的其它酶）。 空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自
12、发空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反应）引起的变化量反应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定先使酶失效而测定 例如：例如： GPT GPT 测定中测定中 先不加底物；先不加底物； 酸性磷酸酯酶中酸性磷酸酯酶中 先不加酶；先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。品酶对照来定量。（三）、测定方法三）、测定方法（测产物增加量）（测产物增加量） 取样测定法取样测定法 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中在酶反应开始后不同时间，从反应系统
13、中取出一定量反应液，并用适当方法停止其反应取出一定量反应液，并用适当方法停止其反应后（酸、碱、热；变性剂等），再根据产物与后（酸、碱、热；变性剂等），再根据产物与底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量的方法；时间的酶促反应变化量的方法； 连续测定法连续测定法 根据底物产物的理化性质不同，在反应过根据底物产物的理化性质不同，在反应过程中对系统进行直接、连续观察的方法。程中对系统进行直接、连续观察的方法。 化学法化学法: : 是取样法的一种是取样法的一种, ,比较古老比较古老, ,但目前仍普遍但目前仍普遍使用。一是因为此法不需要特殊仪器
14、，而且几使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。性质找出具体的有特异性的测定方法。 例：腈水合酶丙烯酰胺测定例：腈水合酶丙烯酰胺测定 （工作量大、含误差大、不够准确）（工作量大、含误差大、不够准确） 光学法光学法（灵敏度高、快速、简便）（灵敏度高、快速、简便） 它是一种连续测定法，是根据底物它是一种连续测定法，是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。吸收差别而建立起来的方法。 光学法又可分为三种：光学法又可分为三种：
15、光吸收法；光吸收法； 荧光法；荧光法； 旋光测定法。旋光测定法。 光吸收法：光吸收法： 这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。1 1、脱氢酶的、脱氢酶的辅酶辅酶NADHNADH(NADPH)(NADPH)在在340nm340nm有吸收峰的特征；有吸收峰的特征；2 2、双键的变化双键的变化常伴随光吸收的变化，所以催化双键饱常伴随光吸收的变化，所以催化双键饱和或双键形成的酶反应，也可用光吸收法；和或双键形成的酶反应，也可用光吸收法；3 3、催化、催化环状结构变化环状结构变化的酶反应也常用此法测定。的酶反应也常用此法测定。 许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中
16、有脱氢许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。 荧光法：荧光法： 其原理是酶反应的底物或产物具有其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性，用荧光变化速度即可测出反应荧光性，用荧光变化速度即可测出反应速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高2-2-3 3个数量级，特别适于酶或底物量低的个数量级，特别适于酶或底物量低的分析。但荧光法干扰多，需要校正。分析。但荧光法干扰多，需要校正。 旋光测定法：旋光测定法： 某些酶反应过程中常伴随有底物或产某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。可用物旋光性质变化。
17、可用自动旋光仪自动旋光仪来测定来测定这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，不方便，但在没有其它更好的方法时，可不方便，但在没有其它更好的方法时，可考虑采用此法。考虑采用此法。 如在蔗糖酶催化蔗糖转化为葡萄糖或如在蔗糖酶催化蔗糖转化为葡萄糖或果糖的反应中，可采用旋光测定法。果糖的反应中，可采用旋光测定法。 电化学法电化学法: : 也是一类连续测定法，其灵敏度和也是一类连续测定法，其灵敏度和准确度都很高，可和光学法相比；而且准确度都很高，可和光学法相比；而且测定系统被污染也不会影响结果，主要测定系统被污染也不会影响结果，主要用电极进行测定，常用的是离子选择性用
18、电极进行测定，常用的是离子选择性电极和氧电极。电极和氧电极。 量气法量气法: : 主要用于有气体吸收或释放的反应，主要用于有气体吸收或释放的反应，如氧化酶反应如氧化酶反应耗气耗气、脱羧酶、脲酶等催、脱羧酶、脲酶等催化的化的产气产气反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。此法主要缺点是准定体积内压力变化。此法主要缺点是准确度、灵敏度不太高，且操作麻烦。确度、灵敏度不太高，且操作麻烦。 放射化学测定法放射化学测定法: : 测定时用同位素标记底物，在酶反测定时用同位素标记底物，在酶反应进行中，导致放射性标记产物定量形应进行中，导致放射性标记产物定量形成，分离产物与底物，
19、进行产物的放射成，分离产物与底物，进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定，这性测定或未反应底物的放射性测定，这样就可测知反应进行的速度或酶的活性。样就可测知反应进行的速度或酶的活性。 用于标记的同位素通常有：用于标记的同位素通常有： 3 3H H、1414C C、3232P P、3535S S、131131I I 酶偶联分析法酶偶联分析法: : 某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，则可偶联一个酶反应进行测定。所谓酶偶联法则可偶联一个酶反应进行测定。所谓酶偶联法是应用过量、高度专一的是应用过量、高度专一的“偶联工具酶偶联工具酶”使被使被测酶反应能继续
20、进行到某一可直接、连续、简测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。便、准确测定阶段的方法。 A B CE1E2 A B CE1E2 被测反应的产物是某脱氢酶的底物被测反应的产物是某脱氢酶的底物, ,即即B B是脱氢酶是脱氢酶E2E2的底物的底物, ,测定系统中加入足量的测定系统中加入足量的脱氢酶脱氢酶E2E2和和NADHNADH, ,使反应进行到使反应进行到C C, ,然后通过然后通过NADHNADH的特征变化而测知。的特征变化而测知。 G + ATP G-6-P + ADPHK被测反应：被测反应：偶联指偶联指示反应：示反应：G-6-P + NADP NADPH + 6
21、-PGCOOH（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v v是总反是总反应系统中的限速因子，测得的指示反应速度应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和和E1E1浓度间呈线性关系）浓度间呈线性关系）G6PDH （四）、测定：（四）、测定： 1） 测测产物产物生成速度生成速度 酶活力大小可用反应速度表示，反应速度可用单位时间内酶活力大小可用反应速度表示，反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示：底物的减少或产物的增加来表示： V = = dSdtdPdt 2）、）、测反应的初速度测反应的初速度 随着反应的进行，底物浓度下降和
22、产物增加导随着反应的进行，底物浓度下降和产物增加导 致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来；致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来； 酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。 因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观的、因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观的、各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性，各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性，真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段的速度。真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段的速度。 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间tP10. 酶制剂产业概况 产值并不大，但上升空间很大 洗涤剂用酶很重要 不能用产值评价酶的贡献率 世界著名的酶制剂公司Novozymes和Genencor大约垄断了45和23的份额。 中国有上百家公司和酶的生产相关。 基因工程技术是目前酶制剂生产的主流技术 80以上的酶为基因工程酶10. 酶制剂工业生物技术的重要内容 生物技术的三个阶段。医药、农业、工业。 工业生物技术解决资源、能源和环保等重大问题。 工业生物技术为我们提供广阔的四维空间。谢 谢！
