1、微生物快速检测方法简介微生物快速检测方法简介常见微生物检测项目常见微生物检测项目n常规微生物项目常规微生物项目 细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、霉菌及酵母菌n致病微生物项目致病微生物项目 沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等n传统计数改良法传统计数改良法1、培养膜法2、螺旋平板计数法：螺旋接种仪菌落计数3、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测n快速检测的新方法快速检测的新方法1、ATP生物荧光法2、电阻抗法3、颜色变化4、流式细胞技术及激光扫描技术5、其它：热量法，放射测量法常规微生物检测方法常规微生物检测方法培养膜法培养
2、膜法_快速检测纸片技术n原理 二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。n操作方法：检样稀释取1ml滴于下膜正中央盖上膜扩展器压成20cm2圆圈 37培养24h 计数(显色的斑点)培养膜法培养膜法_快速检测纸片技术n优点：可节约玻璃仪器、培养基。可节省培养基等试剂的配置灭菌和玻璃仪器灭菌和清洗的时间、人力和费用。因为有显色剂和小方格，计数方便。节约稀释的繁琐动作。可快速测试致病菌，节省大量的实验步骤。n缺点成本比传统方法要稍高些。测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养时间。培养膜法培养膜法_快速检测纸片技术n应用细菌总数测试片中含有一种红色指示染剂，使所有菌落易认别计数。大肠菌群 测
3、试片中含有指示剂，使菌落为红色，且有气泡产生。大肠杆菌指示剂可使所有菌落为红色，并可留住大肠杆菌产生的气泡。24小时可确定大肠杆菌数。霉菌和酵母菌计数测试片中加入的抗生素，可以抑制细菌生长；指示剂使酵母菌易认别计数；霉菌可产生特有的色泽。金黄色葡萄球菌使用了具有热稳定的核酸酶反应片，核酸酶反应产生的粉红色环带色围着一个红色或兰色菌落即为金黄色葡萄球菌，26小时可确认结果。培养膜法培养膜法_快速检测纸片技术螺旋平板法螺旋平板法DWS螺旋平板接种仪自动菌落计数仪n原理原理 样品制备的菌悬液在琼脂表面形成阿基米德螺旋型轨迹。 当用于分液的空心针从平板中心移向边缘时，菌液体积减 少，注入的体积和琼脂半
4、径间存在指数关系。培养时菌落 沿注液线生长。用一计数的方格来校准与琼脂表面不同区域有关的样品量，计数每个区域的已知菌落数，在计算细菌浓度。 螺旋平板法螺旋平板法平皿旋转接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍阿基米德螺旋型轨迹 螺旋平板法螺旋平板法n优点优点与传统方法相比，无需稀释梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。n缺点缺点检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。螺旋平板法螺旋平板法滤膜法滤膜法n滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。n优点优点灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。n缺点缺点 需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一
5、次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。ATPATP生物荧光法生物荧光法n原理原理 ATP萤光素+萤光素酶+O2AMP+Ppi+CO2+氧化萤光素+光n应用应用用于食品生产线和管道进行快速清洁程度检测。用于水质检测。改良后用于食品的商业无菌检测或终产品检验。1010秒获得结果秒获得结果涂抹采样涂抹采样混合混合: :震荡震荡5s5s检测检测表面清洁度表面清洁度/水质检测水质检测ATPATP生物荧光法生物荧光法nATPATP法检测成品的优缺点法检测成品的优缺点优点：大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。缺点：ATP方
6、法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，有存在假阴性的可能。ATPATP生物荧光法生物荧光法电阻抗法测定细菌总数电阻抗法测定细菌总数n原理原理供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值。M=(RM=(R0 0-R-RT T)/R)/R0 0100%100% 其中R0表示开始时
7、培养基的阻抗值RT表示任意时刻培养基的阻抗值M表示培养基电阻减少的百分数。电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位的对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。电阻抗法测定细菌总数电阻抗法测定细菌总数n优缺点优缺点：电阻抗法较省力，样品细菌数在418小时内出结果。但对于菌数太低的不好，样品中还不能用防腐剂，否则结果是乱七八糟的。电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。电阻抗法测定细菌总数电阻抗法测定细菌总数通过颜色变化检测n微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化
8、，记录达到突变点的时间。n与阻抗法类似，可以实现快速检测。n缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。梅里埃的梅里埃的BacTBacT/Alert/Alert微生物检测仪微生物检测仪基于微生物生成产生CO2的原理。CO2积累越多，底部的CO2传感器变黄，由LED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度。光强度与微生物数量有一定关系。流式细胞技术 n原理原理液体样品流过仪器中的激光照射的流动池，当微生物流过显微镜聚焦的流动池时就能被自动地检测到。n特点特点检测方法与使用的仪器有高度的特异性，所以应遵循生产厂商提供的方法。nFOSSFOSS公司公司BactoScanBactoScan
9、 FC FC牛奶中总菌数快速检测仪牛奶中总菌数快速检测仪采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数。优点：速度快(50-150样品/小时)缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养。灵敏度不够高。适合牛奶企业检测原奶中细菌总数。流式细胞技术 n美国美国ChemunexChemunex公司微生物快速检测系统公司微生物快速检测系统将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相结合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快，处理量大。检测步骤：1、过滤；2、标记，直
10、接对活细胞和酵母进行标记；3、激光扫描。流式细胞技术流式细胞技术 三种型号的差异三种型号的差异产 品 型 号主 要 参 数总 活 菌 数酵 母 和 霉 菌 数大 肠 杆 菌 和 大 肠 菌 群贾 第 鞭 毛 虫 和 隐 孢 子 虫处 理 速 度灵 敏 度适 用 范 围BactiflowChemScan RDIReal-time analyser D-count10-14/个 样 品小 时100-100,000/g个 细 胞适 用 于 含 菌 量 较 高 的食 品 、 化 妆 品 及 水 等样 品 。 每 天 检 测 量 不大 于 个 样 品 。40适 用 于 含 菌 量 较 低 的不 可 过
11、滤 的 食 品 、 化妆 品 等 样 品 。 每 天 检测 量 大 于 个 样 品 。4090分 钟 内 出 定 量 结 果1-5000个 细 胞特 别 适 用 于 医 药 工 业 、 饮 用 水尤 其 是 直 饮 水 中 对 可 过 滤 的 样品 进 行 有 害 肠 道 菌 及 原 生 动 物进 行 快 速 检 测50/个 样 品小 时1-1000cfu/g(mL) 利用细菌生长时产生热量的原理设计而成。微生物在生长和代谢的过程中，能产生大量的代谢热。由于各种微生物的代谢产物热效应不同，因此可显示出特异性的热效应曲线图。热效应曲线图的形成，是由于培养基含有多种成分，微生物则产生多种不同的代谢
12、产物，以此表现出的热效应为多个曲线峰，如为单一营养成分，则只有一个峰出现。在细菌生长的过程中，用微量量热计测量产热量等热数据，经计算机处理，绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图，以此推断细菌存在数量。微量量热法微量量热法发射测量法发射测量法利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量的放射性标记引入葡萄糖或其他糖类分子中。细菌生长时，糖被利用并放出标记的CO2，将生成的放射性标记CO2从培养装置中导出或用化学法吸收后，利用专用的放射测量仪来测定放射性CO2 。放射量与菌数成正比。致病菌快速检测方法致病菌快速检测方法n显色培养基法：技术成熟，产品很多。n免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性
13、都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，荧光酶免、免疫磁分离等方法。n分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。n基因芯片显色培养基法显色培养基法n原理在选择性培养基的基础上经过改良。利用细菌特有的生理生化反应，使培养基中的指示剂产生颜色变化，以将目标菌与其他菌区别开来酶联免疫技术酶联免疫技术mini-Vidas全自动免疫分析仪n利用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本。n优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏
14、菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。分子生物学方法分子生物学方法n基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。n有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。n基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。nPCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。n优缺点优缺点分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势。目前不少产品已经通过AOAC的认证。分子生物学方法分子生物学方法
