1、 第第17章章 高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、 液相色谱概述液相色谱概述二、二、 HPLCHPLC仪器构成仪器构成三、液相色谱的固定相和流动相三、液相色谱的固定相和流动相四、液相色谱法的分离类型及机理四、液相色谱法的分离类型及机理五、色谱分离方法的选择五、色谱分离方法的选择主要内容主要内容一、一、 概概 述述 高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以是一种以液体为流液体为流动相动相的的快速分离分析色谱技术快速分离分析色谱技术。具有。具有高压、高速、高压、高速、高效、高灵敏度高效、高灵敏度的特点，对于那些的特点，对于那些沸点高沸点高，热稳热稳定性差定性差，相对分子质量大相对分子质量大的
2、的有机化合物有机化合物如烷烃、如烷烃、烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。可进行分离分析。 1 、高效液相色谱、高效液相色谱1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进
3、行分离和分析。高效液相色谱的优点高效液相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点高效液相色谱的优点液相色谱仪（液相色谱仪（1）LCQ Deca XP MAX液相色谱质谱联用仪液相色谱质谱联用仪1 、流程流程 (1)
4、贮液器贮液器 用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析工作。工作。材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） 容积：容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 注意：密封、过滤注意：密封、过滤流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，泵腔的体积要小，以便快速更换以便快速更换溶剂溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作, ,耐
5、压耐压40-40-50MPa. cm50MPa. cm2 2压力平稳，无压力平稳，无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定，输出流量稳定，重复性高重复性高, ,输出输出流量范围宽流量范围宽恒压泵恒流泵气动放大泵注射泵单柱塞泵双柱塞泵隔膜泵并并联联泵泵串串联联泵泵色色谱谱泵泵(内梯度)(外梯度)等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形, , 减少拖尾减少拖尾; ;可能引起可能引起基线漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离1) 对样品有
6、一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。流动相溶剂选流动相溶剂选择的一般要求择的一般要求(2)(2) 进样系统进样系统进样针进样针六通阀六通阀 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置六通阀进样六通阀进样 装置的使用及保养装置的使用及保养1、进样样品要
7、求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品 溶液均要用045微米的滤膜过滤。 2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引 入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。 3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提 高精密度及重现性。4、进样时，手柄处于Load和Inject之间时，应尽快转阀，不 能停留在中途。5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针 头的外侧。两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器：二极管阵列检测器紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性
8、范围较好 ，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙腈乙腈 甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波长止波长/nm380245212210190205187液相色谱的流动相又称为：液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；分离原理分离原理msccK K不仅与固定相的不仅与固定相的种类有关，也与流种类有关，也与流动相的种类有关动相的种类有关固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱组分极性越大，组分极性越大，保留
9、时间越长保留时间越长反相分配色谱反相分配色谱组分极性越小，组分极性越小，保留时间越长保留时间越长流动相极性流动相极性固定相极性固定相极性3、化学键合相色谱化学键合相色谱采用化学键合相采用化学键合相的液相色谱的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。此它适用于种类繁多样品的分离。特点特点1. 键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围： 2-8键
10、合固定相类键合固定相类型型疏水基团疏水基团烷烃（烷烃（C8和和C18）、苯基等）、苯基等极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等离子交换基团离子交换基团胺基、季铵盐胺基、季铵盐磺酸、羧酸磺酸、羧酸2. 键合相色谱法分类键合相色谱法分类反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C18分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性离子性键合相色谱离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质将各种离子交换基团化
11、学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。定相。其分离原理与离子交换色谱类同。 例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基键合相键合相二醇基二醇基键合相键合相保留时间：保留时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇- -水为流动相分离水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸没食子酸3,4-二羟
12、基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相: 非极性非极性; 流动相流动相: 极性极性组分极性组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸没食子酸没食子酸阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换+RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3+X-Cl-rrABABABK/一般形式： R一AB RBA排阻色谱分离示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于10的化合物的化合物才可以分离才可以分离类类 型型 主要分离机理主要分离机理 主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域 吸附色谱吸附色谱 吸附能，氢键吸附能，氢键 异构体分离、族分
13、离，制备异构体分离、族分离，制备分配色谱分配色谱 疏水分配作用疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱凝胶色谱 溶质分子大小溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱 库仑力库仑力 无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析离子排斥色谱离子排斥色谱 Donnan膜平衡膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱离子对色谱 疏水分配作用疏水分配作用 离子性物质分析离子性物质分析 疏水作用色谱疏水作用色谱 疏水分配作用疏水分配作用 蛋白质分离与纯化蛋白质分离与纯化 手性色谱手性色谱 立体效应立体效应 手性异构体分离，药物纯化手性异构体分离，药物纯化亲和色谱亲和色谱 生化特异亲和力生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析高效液相色谱法的类型及分离机理高效液相色谱法的类型及分离机理五、五、 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择
