1、生物制品生产技术23第一节第一节 细胞细胞大规模培养大规模培养 大规模培养技术是建立在实验室培养方法大规模培养技术是建立在实验室培养方法（贴壁培养法和悬浮培养法）的基础上，再利（贴壁培养法和悬浮培养法）的基础上，再利用固定化细胞、人工灌注、生物反应器技术等用固定化细胞、人工灌注、生物反应器技术等技术发展起来的。技术发展起来的。 一、细胞培养的操作方式一、细胞培养的操作方式 二、大规模细胞培养系统二、大规模细胞培养系统4一、细胞培养的操作方式培养方式分为：培养方式分为： 分批式分批式 流加式培养流加式培养 半连续式半连续式 连续灌注式连续灌注式51、分批式培养指先将细胞和培养液一次性装入反应指先
2、将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。形成，经一段时间后，终止培养。6分分批批式式培养特点培养特点系统密闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换。系统密闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换。培养基体积固定，当主要营养物质耗尽时，细胞即停止生培养基体积固定，当主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，又称为分批培养或间歇培养，多在长，又称为分批培养或间歇培养，多在3-5d/批。批。细胞数目、总重量、细胞数目、总重量、DNA含量呈含量呈“S”形形(五个时期五个时期)变化。变化。为保证细胞不断增殖，须在达到最大
3、重量时取出为保证细胞不断增殖，须在达到最大重量时取出1/51/3的培养液，转移继代培养。的培养液，转移继代培养。是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模可达可达 12000L。782、半连续式（流加式）培养 指在分批式培养的基础上，将分批培指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。不变。93、流加式培养在分批式操作的基础上，在培养过程中根据细在分批式操作的基础上，在培养过程中根据细胞对营养
4、物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平。目标产品达到较高的水平。由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态，是当前细胞生长和产物生成容易维持在优化状态，是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺。动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺。104 4、连续、连续灌注灌注式培养式培养是把细胞接种后进行培养，新鲜的培是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液不断从反应器一头加入，
5、从另一头不断养液不断从反应器一头加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断供应状态。使反应使细胞处于一种营养不断供应状态。使反应条件处于一种恒定状态。条件处于一种恒定状态。11连续灌注式培养特点连续灌注式培养特点1）不断加入新培养基，保证了营养物质的充分供应。）不断加入新培养基，保证了营养物质的充分供应。2）培养期细胞增殖速度快，细胞生长速率长久地保持）培养期细胞增殖速度快，细胞生长速率长久地保持在对数生长期，形成一个稳定的培养状态。在对数生长期，形成一个稳定的培养状态。3）适用于细胞大规模工业化培养。）适用于细胞大规模
6、工业化培养。4） 由于连续培养需要的设备比较复杂，投入较大，由于连续培养需要的设备比较复杂，投入较大，且要维持细胞无菌状态，技术条件要求苛刻，因且要维持细胞无菌状态，技术条件要求苛刻，因此此未得到广泛应用未得到广泛应用。1213开放式连续培养开放式连续培养-细胞随排出培养液一起流出细胞随排出培养液一起流出且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率等于培养系统中新细胞的增长速率。等于培养系统中新细胞的增长速率。封闭式连续培养封闭式连续培养-新鲜培养液和老培养液以等新鲜培养液和老培养液以等量方式进出量方式进出，而收集的细胞重新放入原培养而收集的细胞重新放入原培养系
7、统中继续培养，故培养系统中细胞数量是系统中继续培养，故培养系统中细胞数量是在不断增加的。在不断增加的。 1415二、大规模细胞培养方法二、大规模细胞培养方法按供养方式分为三种：按供养方式分为三种： 搅拌式、气升式、旋转式搅拌式、气升式、旋转式按按细胞固定分为细胞固定分为四种四种： 悬浮培养、悬浮培养、 微载体培养、微载体培养、 微囊化培养微囊化培养、 微导管培养（中空纤维微导管培养（中空纤维培养培养）。）。16机械搅拌式机械搅拌式(Spinner)机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传感器，监测培
8、养物的温度、感器，监测培养物的温度、pH值、溶氧值、溶氧度度(DO)、葡萄糖消耗、葡萄糖消耗、NH3、NH4+等参数。等参数。这种反应器培养规模可达这种反应器培养规模可达2 000 L。17 该系统优点：该系统优点：（1）设计简单，操作方便，易于放大生产；）设计简单，操作方便，易于放大生产；（2）细胞密度高，达到）细胞密度高，达到107/mL以上；以上；（3）便于无菌操作，不易污染；）便于无菌操作，不易污染；（4）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所需的要求。需的要求。 缺点：缺点： 对细胞损伤较大，产物含量不高。对细胞损伤较大，产物含量不高。18气升搅拌式气
9、升搅拌式气体从罐底的喷射管进入反应器的导气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良好。好。适用于悬浮细胞分批培养适用于悬浮细胞分批培养、微载体和连续微载体和连续培养。培养。19 工作原理工作原理 反应器运转时，圆筒以反应器运转时，圆筒以30-6030-60 r/minr/min的速度转动，的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅
10、拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。气体成分均匀地分布到反应器内。20CelltechCelltech公司采用气升式反应器培养公司采用气升式反应器培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。生产周期为，生产单克隆抗体。生产周期为14400h
11、。从。从10L10L逐级放大到逐级放大到10000L10000L。17d17d生生产抗体产抗体100g100g，抗体合成大多数处于稳定期和，抗体合成大多数处于稳定期和衰退期，比传统摇瓶提高约衰退期，比传统摇瓶提高约5 5倍。倍。21通气搅拌式细胞培养反应器通气搅拌式细胞培养反应器222324旋转式细胞培养系统旋转式细胞培养系统 20世纪世纪90年代中期，美国宇航局开发一系年代中期，美国宇航局开发一系列旋转式细胞培养系统列旋转式细胞培养系统(The rotary cell culture system, RCCS)，又叫回转式生物反，又叫回转式生物反应器应器(Rotatingwall vesse
12、l biore-actor, RWVB)。 RCCS是绕水平轴旋转、无气泡、膜是绕水平轴旋转、无气泡、膜扩散式气体交换的培养系统。扩散式气体交换的培养系统。25 该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入RCCS圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气体交换器来
13、吸氧和排出体交换器来吸氧和排出CO2。 由于系统无推进器、气泡或搅拌器由于系统无推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减使破坏性应力减到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，得到类似人体内的培养产物三维生长，得到类似人体内的培养产物. 近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。2627悬浮培养悬浮培养 与微生物的肉汤培养基本相同。与微生物的肉汤培养基本相同。 悬浮培养细胞增殖快、产量高，没有接触抑悬浮培养细胞
14、增殖快、产量高，没有接触抑制特性，是动物大规模培养的理想方法。制特性，是动物大规模培养的理想方法。 但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，适用于确立适用于确立细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液和淋巴细胞瘤细胞、血液和淋巴细胞培养。培养。28微载体培养微载体培养 微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和增殖，增殖，微载体微载体悬浮于培养液中。悬浮于培养液中。 微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的比表面积，供单层细胞贴附
15、和增殖。比表面积，供单层细胞贴附和增殖。 悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高，悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，重复性好，容易放大。容易放大。 20世纪世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。激酶原等。29v理想的微载体所具备的性能：理想的微载体所具备的性能：v质地柔软，微球间摩擦轻；质地柔软，微球间摩擦轻；v耐高温，可高压灭菌；耐高温，可高压灭菌；v透明性，便于观察细胞生长；透明性，便于观察细胞生长；v细胞相容性，利于贴附和生长；细胞相容性，利于贴附和生长；v无毒性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，无毒
16、性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，不吸附培养基；不吸附培养基；v低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；v微粒大小均匀；可回收重复使用。微粒大小均匀；可回收重复使用。30 为了提高贴壁能力，对基质表面进行为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。速贴壁过程。 悬浮培养早期，还可向培养液补充丙悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。将这些微载体悬浮在培养液中将这些微载体悬浮在培养液中，大大增大大增加细胞的贴壁面
17、积，加细胞的贴壁面积，可使可使每毫升培养基达到每毫升培养基达到10001000万个万个（10108 8）细胞的密度细胞的密度。31常用微载体常用微载体玻璃珠：玻璃珠：直径约直径约23 m，密度，密度1.5 g/cm3。在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此密度。密度。葡聚糖微载体：葡聚糖微载体：带正电，干粉在带正电，干粉在pH7.2的磷的磷酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。Cytodex 2：电荷性大大下降，吸附能力很电荷性大大下降，吸附能力很低，适合于蛋白质药物的生产。低，适合于蛋白质药物的生产。纤维素微载体纤维素微载体
18、DE52和和DE53：适合多种细适合多种细胞培养。胞培养。聚丙烯酰胺载体：聚丙烯酰胺载体：贴壁较快，亲水性。贴壁较快，亲水性。32多孔微载体：多孔微载体： 直径直径0.25 mm，孔径，孔径20300 m，达占总，达占总体积的体积的85%，极大地增加了比表面积，极大地增加了比表面积，可实现细可实现细胞的固定化，达到高密度培养。胞的固定化，达到高密度培养。 广泛使用的有广泛使用的有：Cellsnow、Cytocell（纤维（纤维素基质）、素基质）、Verax、Cultisphere（胶原）、（胶原）、Cytoline 1和和2（聚苯乙烯）、（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡（硅橡胶）及胶）及
19、Siran（玻璃）等。（玻璃）等。 主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。3334微囊化培养微囊化培养 利用固定化细胞技术，将一定量细胞与利用固定化细胞技术，将一定量细胞与约约4 4的褐藻酸钠混合后，滴到的褐藻酸钠混合后，滴到CaClCaCl2 2溶液中，溶液中，构成构成半透性微胶囊。半透性微胶囊。又称固定化细胞、大载又称固定化细胞、大载体培养法。体培养法。35 1） 细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养，细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养，又可排出自身代谢物又可排出自身代谢物。2）细胞所受的剪切力损伤小，）细胞所受的剪切力损伤小， 细胞生长良好，细胞生长良好，
20、纯度提高。纯度提高。便于连续培养，提高培养细胞的便于连续培养，提高培养细胞的利用率；利用率；3）细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代）细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代谢产物的积累，提高产量。谢产物的积累，提高产量。364）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、收获步骤，提高工作效率。如次生代谢物不分收获步骤，提高工作效率。如次生代谢物不分泌，泌， 培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体。体。5）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步
21、研究解决。遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。 这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大规模生产常用此法进行。规模生产常用此法进行。373839中空纤维（微导管）培养中空纤维（微导管）培养 是模拟体内细胞三维生长环境而发明的是模拟体内细胞三维生长环境而发明的。 将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过1mm1mm（1mm1mm）的微导管平铺成层，相当于体内的毛）的微导管平铺成层，相当于体内的毛细血管细血管。微导管表面贴壁生长细胞，。微导管表面
22、贴壁生长细胞，管内通无菌空管内通无菌空气，管外浸泡在培养液中，气体、气，管外浸泡在培养液中，气体、水分及其它营养水分及其它营养物质可以通过微导管与细胞进行交换。物质可以通过微导管与细胞进行交换。 微导管表面的细胞密度可达微导管表面的细胞密度可达100100万万/cm/cm2 2个。细胞密度个。细胞密度可达可达10108 8/m/mL L。40接种孔接种孔 水套层水套层 产物出口产物出口培养基入口培养基入口产物出口产物出口培养基入口内膜内膜外膜外膜腔室腔室细胞细胞培养基分散后培养基分散后, ,灌入床层。纤灌入床层。纤维管壁薄，维管壁薄，半半透膜，截留不透膜，截留不同分子量。同分子量。纤维管的纤维
23、管的空腔空腔组成的组成的内室内室：灌流含氧气的灌流含氧气的培养基培养基纤维管之间的纤维管之间的空间组成的空间组成的外外室室：细胞生长。：细胞生长。41 细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。 细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。 在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂
24、，但细胞的存活、健康和核形来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。42第二节第二节 动物细胞生物制药动物细胞生物制药用用动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，特别是人源细胞的培养白质，特别是人源细胞的培养，在药物生产中在药物生产中的位置越来越重要。的位置越来越重要。一、表达蛋白的宿主系统二、生产用动物细胞的要求三、常用动物细胞的特性四、基因工程细胞构建和筛选五、细胞库的建立43 常见常见的动物细胞培养产物的动物细胞培养产物 疫苗疫苗小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、小儿麻痹症
25、疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗、风疹疫苗疱疹疫苗、风疹疫苗单克隆抗体单克隆抗体 IgG、IgM、IgA等等免疫调节剂免疫调节剂 细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺胸腺肽肽酶酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶激素激素生长激素、促红细胞生成素生长激素、促红细胞生成素44基因工程药物生产示意图基因工程药物生产示意图45一、表达目的蛋白的宿主系统一、表达目的蛋白的宿主系统 总体分为：原核表达系统和真核表达系统。总体分为：原核表达系统和真核表达系统。 常见的宿主系统常见的宿主系统 细菌、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细细菌
26、、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细胞、哺乳动物细胞胞、哺乳动物细胞等。等。46原核表达系统原核表达系统-细菌细菌 特点：繁殖快、易于培养，特点：繁殖快、易于培养，限制：限制： 表达的蛋白质缺乏转录后的修饰；表达的蛋白质缺乏转录后的修饰； 原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞提取产物，给产物的分离纯化要破碎细胞提取产物，给产物的分离纯化带来困难；带来困难； 还易受外源毒素的污染。还易受外源毒素的污染。 47真核表达系统真核表达系统特点特点 表达后的蛋白有修饰作用，与人体自身表达后的蛋白有修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白非常近似；分泌的天然蛋白非常近似；
27、 动物细胞表达的蛋白都是胞外分泌，产动物细胞表达的蛋白都是胞外分泌，产物的分离纯化过程非常简单。物的分离纯化过程非常简单。 但是，动物细胞大规模培养比较复杂，但是，动物细胞大规模培养比较复杂，目前仍处于发展完善阶段。目前仍处于发展完善阶段。48表达系统的选择表达系统的选择 原核表达系统：一般原核表达系统：一般“小分子、结构简单小分子、结构简单”的蛋白的蛋白生产，且生产，且蛋白转录后无需修饰蛋白转录后无需修饰，如胰岛素；，如胰岛素； 真核表达系统：主要真核表达系统：主要“生产大分子、结构复杂的蛋生产大分子、结构复杂的蛋白白”，并且转录后的，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重修饰对蛋白的生物活
28、性具有重要影响要影响，如组织型纤溶酶原激活剂，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA(tPA）、促红细）、促红细胞生成素等（胞生成素等（EPOEPO）等。）等。 对既可用原核、可用真核表达的蛋白如对既可用原核、可用真核表达的蛋白如- -干扰素、干扰素、人生长激素等，应综合考察生产的经济成本和技术人生长激素等，应综合考察生产的经济成本和技术难易程度等选择表达系统。难易程度等选择表达系统。49 口蹄疫疫苗生产示意图口蹄疫疫苗生产示意图50 过去使用动物生产的生物制品，经常发生过去使用动物生产的生物制品，经常发生过敏反应或病原体传染事件过敏反应或病原体传染事件。如脊。如脊髓灰质髓灰质炎疫苗炎疫苗可能被猿猴肾
29、病毒污染；用人血制可能被猿猴肾病毒污染；用人血制备的某些生物制品可能被备的某些生物制品可能被肝炎或艾滋病病肝炎或艾滋病病毒污染毒污染。 采用细胞工程生产的产品能将致病因素降采用细胞工程生产的产品能将致病因素降到最小：到最小：动物细胞培养所用的细胞背景明动物细胞培养所用的细胞背景明确，经过严格的安全检测，消除了污染病确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。原体的危险。51实例实例 EPOEPO的生产：的生产：以前需要从以前需要从2500L2500L再生障碍性再生障碍性贫血病人的尿液中才能提取极微量的贫血病人的尿液中才能提取极微量的EPOEPO用用于实验室分析。现在，通过大规模培养基因于实
30、验室分析。现在，通过大规模培养基因工程细胞生产的工程细胞生产的EPOEPO，已经治疗了成千上万，已经治疗了成千上万的肾性贫血的病人。的肾性贫血的病人。 胰岛素的生产：胰岛素的生产：过去从猪胰腺中提取胰岛过去从猪胰腺中提取胰岛素，但某些患者会引起抗原抗体反应。基因素，但某些患者会引起抗原抗体反应。基因工程可以用人胰岛素基因生产人源化蛋白，工程可以用人胰岛素基因生产人源化蛋白，克服免疫反应的缺点。克服免疫反应的缺点。52动物细胞表达系统的不足动物细胞表达系统的不足 细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。表达系统。如如骨髓细胞骨髓细胞M
31、PG-11生产生产IgG， 每个每个细胞细胞1分分钟为钟为5pg，10L反应器，反应器，细胞细胞密度为密度为107/mL，生产能力不，生产能力不到到1 g/d。 连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。产物的增加。 53v 动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。、渗透压、剪切力等忍受能力差。v 需要添加氨基酸、需要添加氨基酸、维生素、维生素、 血清血清、生长因、生长因子等子等， 培养基要求高，培养基要求高，生产生产费用较高。费用较高。 54 原代细胞原
32、代细胞 二倍体细胞系二倍体细胞系 转化细胞系转化细胞系 二、生产用动物细胞的要求55原代细胞 直接取自动物组织器官直接取自动物组织器官，经过粉碎消化经过粉碎消化而获得的细胞悬液（而获得的细胞悬液（10109 9/g/g）。）。 需要大量动物，费钱费劳力。需要大量动物，费钱费劳力。细胞质量细胞质量不稳定。不稳定。 常用常用鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞胞、淋巴细胞等等。562.二倍体细胞系 原代细胞经过传代原代细胞经过传代、筛选克隆，从多种筛选克隆，从多种细胞成分中，挑选并纯化出具有一定特征的细胞成分中，挑选并纯化出具有一定特征的某种细胞株。某种细胞株。
33、 特点特点正常细胞的染色体正常细胞的染色体2n2n核型；核型；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；可传代培养可传代培养5050代；代；无致瘤性。无致瘤性。57 3.转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。无限增殖能力。 转化过程可以是自发的、转化过程可以是自发的、人工的人工的、或或从肿从肿瘤组织中瘤组织中产生产生。58三、常用动物细胞的特性W1-38 人胚胎肺组织二倍体成纤维细胞系人胚胎肺组织二倍体成纤维细胞系。核型为。核型为2n=462n=46。 贴壁生长
34、，能产生胶原，同工酶为贴壁生长，能产生胶原，同工酶为G6PDG6PD- -B B型。培养型。培养基用基用EBMEBM加加1010% %小牛血清，小牛血清，pH7.2pH7.2。倍增时间为倍增时间为24h24h，有，有限寿命限寿命5050代。代。 对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗，目前，目前广广泛泛应应用。用。59MRC-5 正常男性肺组织中获得的人二倍体成纤维细胞系。核型为2n=46。 培养基需加小牛血清。有限寿命4246代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。60Namalwa 从患有淋巴瘤病的肯尼亚
35、人获取，建成人的类淋巴母细胞系。非整体核型，1214条标记染色体，单条X，无Y。 外源基因表达水平较高，培养基为RPMI1640 +7%胎牛血清。可用无血清培养基高密度培养。悬浮生长，表达IgM。 英国Wellcome公司用Namalwa细胞大规模生产干扰素，反应器达8000L。用该细胞生产rhEPO、rhG-CSF、tPA等。61CHO-K1 从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型2n=2022。 贴壁生长，也可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。培养基为：DEME+ 0.1mmol/L次黄嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清+脯氨酸。 分泌表达外源蛋白，蛋白质翻译后的修
36、饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。使用氨甲酰喋呤可增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。62BHK-21 从1日龄地鼠幼鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，核型为2n=44。 培养基为DMEM+7%胎牛血清。 用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。现已用于工程细胞构建。 63Vero 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的上皮细胞，贴壁生长，核型2n=60。 能适应灌流操作，进行连续培养。培养基：M199+5%胎牛血清。已有突变系能用无血清培养。 常用Vero E6增殖多种病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，
37、已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。64SP2/0-Ag14 通过融合的方法分离获得。 培养基为DMEM+10%胎牛血清。能耐受8氮鸟嘌呤 20g/mL，但在HAT选择培养基中不能存活。 通常用于生产单克隆抗体。65C127：从小鼠乳腺瘤分离的上皮样细胞。贴壁生长。表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养中分离的细胞系。能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。COS：从SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3：用于
38、生长激素研究，293：用于基因治疗的研究。66昆虫细胞株系昆虫细胞株系Sf-9 从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到的，是最常用的昆虫表达细胞。 通常用Grace培养基+3.3g/L 水解乳蛋白+3.3g/L酵母浸液+10%胎牛血清。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。 对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。生长快，能高效表达外源基因。用于高效表达外来蛋白制品。67其他其他Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。较大，容易放大，高效表达外源基因。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞中分离得到从粉纹夜蛾卵
39、细胞中分离得到的的。无血清培养，快速倍增。分泌表达重组无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比蛋白的能力比Sf9细胞系高细胞系高20多倍，能适应多倍，能适应悬浮培养。悬浮培养。68四、基因工程细胞构建和筛选在生产中采用更多、更有前景的是融合细胞及各种基因工程细胞。被用于构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。691.真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类： 病毒载体- 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒 质粒载体-70 病毒作为载体的优点：双链DNA，易
40、重组；插入78kb DNA不影响正常病毒粒子的形成多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系。因此，用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；71多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%30%；用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。如家蚕杆状病毒，可在蚕体表达外源基因。72质粒载体质粒载体 与与微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。个复制子和抗性筛选标记基因。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。抗生素抗性标记，原
41、核细胞筛选。动物细胞复制子，在宿主细胞中动物细胞复制子，在宿主细胞中稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。 73 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，含有如下基本成分：允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。含有使基因表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 74基因的导入和高效表达细胞株筛选基因的导入和高效表达细胞株筛选75基因载体导入动物细胞常用的方法 磷酸钙沉淀法 电穿孔法 磷酸钙沉淀法 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触
42、时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。 电穿孔法 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。76 化学转染是最常用的转染方法。化学转染是最常用的转染方法。 渗透性休克和渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒进入细胞。转染试剂盒已有已有商业化供应，特别是商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。脂质体材料的转染试剂。影响因素影响因素 细胞培养物的密度、细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。等。
43、77转染体筛选与分离转染体筛选与分离 转染后转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。质杂交，检测外源基因的瞬时表达。 为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养上培养2448小时，让细胞倍增小时，让细胞倍增12代，使转染代，使转染DNA表表达。再按达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每比例转移到选择性培养基上，每24天天更换培养基，持续更换培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。细胞残骸，最后得到独立的克隆
44、。 在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要使用与之相对应的显性选择标记来分离转因，因此需要使用与之相对应的显性选择标记来分离转染细胞。染细胞。78五、细胞库的建立 必须建立两个细胞库必须建立两个细胞库原始细胞库原始细胞库 生产用细胞库生产用细胞库79原始细胞库 存有该细胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史 该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果80生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成生产细胞库。 需建立档案，进行无菌、无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代次数。81第
45、三节第三节 植物次生代谢产物的生产植物次生代谢产物的生产随着植物细胞悬浮培养技术的发展及各种随着植物细胞悬浮培养技术的发展及各种新型生物反应器的出现，植物细胞能像微生物新型生物反应器的出现，植物细胞能像微生物细胞那样在发酵罐中大量连续培养，产生相当细胞那样在发酵罐中大量连续培养，产生相当于几倍或几十倍该完整植株所产生的于几倍或几十倍该完整植株所产生的次生代谢次生代谢产物产物。植物细胞培养的产物在医药、食品、化。植物细胞培养的产物在医药、食品、化工、农业等领域得到了广泛应用。工、农业等领域得到了广泛应用。如：人参愈伤组织在培养基中培养数周，如：人参愈伤组织在培养基中培养数周，所含粗皂苷的含量所含
46、粗皂苷的含量可达可达19.3%19.3%，而天然人参根而天然人参根中含量中含量仅为仅为4.1%4.1%。82一、一、次生代谢产物次生代谢产物二、二、培养条件下次生产物积累的特性培养条件下次生产物积累的特性三、三、提高细胞次生产物产量的途径提高细胞次生产物产量的途径四、四、培养技术的选择培养技术的选择五五、植物细胞培养的应用植物细胞培养的应用83一、一、次生代谢产物次生代谢产物 次生代谢产物次生代谢产物是代谢的最终产物，是代谢的最终产物，并非一并非一般生命活动所必需的产物。多是一类小分子有般生命活动所必需的产物。多是一类小分子有机化合物，如黄酮、色素、毒素、抗生素、生机化合物，如黄酮、色素、毒素
47、、抗生素、生长素、生物碱等。长素、生物碱等。 次生代谢产物分布具有种、属、器官、组次生代谢产物分布具有种、属、器官、组织以及发育阶段的特异性，也就是说不同植物织以及发育阶段的特异性，也就是说不同植物类型或同一植物不同生长阶段及组织部位产生类型或同一植物不同生长阶段及组织部位产生的次生代谢产物及产量是不同的。的次生代谢产物及产量是不同的。84 主要主要分为三类分为三类 萜类、萜类、 酚类酚类、 含氮次级化合物含氮次级化合物。酚类酚类-黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类黄酮类结构：结构： C6-C3-C6生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A功效：功效：治疗治疗心
48、血管和高血压的药物成分心血管和高血压的药物成分。醌类化合物醌类化合物结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合种类：苯醌、萘醌。种类：苯醌、萘醌。功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。86简单酚类简单酚类结构：结构：苯丙酸类、苯丙酸内酯和苯甲酸衍生物苯丙酸类、苯丙酸内酯和苯甲酸衍生物分布：分布：广泛分布于维管植物。广泛分布于维管植物。功能：功能：许多许多是是植物防御食草昆虫和真菌侵袭植物防御食草昆虫和真菌侵袭的的 保护剂。保护剂。常用的药物有：绿原酸、姜酚、常用的药物有：绿原酸、姜酚、肉桂醛肉桂醛等。等。萜类化合物萜类化合物单
49、萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值。要成分，有的具有重要的药用价值。 萜类化萜类化合物已超过合物已超过2万种。万种。倍倍 半半 萜：抗疟疾药物青蒿素。萜：抗疟疾药物青蒿素。二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。三萜三萜 皂甙：人参皂甙。皂甙：人参皂甙。甾体甾体 皂甙：薯蓣皂甙。皂甙：薯蓣皂甙。含氮化合物含氮化合物包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷合成：合成：从普通的氨基酸合成的。从普通的氨基酸合成的。分布：双子叶植物分布：双子叶植物种类：种类：主要有生物碱、含氰苷、
50、主要有生物碱、含氰苷、芥子油苷和非蛋白、芥子油苷和非蛋白、 氨基酸等，有氨基酸等，有5500种以上种以上。二、二、次生产物积累的特性次生产物积累的特性生长偶联型生长偶联型-产物合成与细胞生长成正比。产物合成与细胞生长成正比。如长春花碱的合成如长春花碱的合成、烟草中烟碱合成。烟草中烟碱合成。中间型中间型-产物仅在细胞生长下降时合成，产物仅在细胞生长下降时合成，细胞细胞在指数生长期或停止期产物都不合成。如在指数生长期或停止期产物都不合成。如蒽醌蒽醌类物质、类物质、莨菪烷类的合成等莨菪烷类的合成等。非生长偶联型非生长偶联型-产物合成在细胞生长停止以产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁。后。如紫草宁。
