1、第五章 免疫血清学检验技术第一节 凝集与沉淀反应第二节 放射免疫测定技术第三节 免疫荧光技术第四节 酶免疫测定第五节 固相膜免疫测定凝集反应： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。一、 凝集反应及其特点第一节 凝集与沉淀反应凝集反应过程：抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象凝集反应特点：IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象，称不完全抗体临床意义：进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。多 克
2、 隆 抗 体单 克 隆 抗 体肌红蛋白上清液肉眼可见的凝集现象直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。二、 直接凝集反应（一）玻片凝集试验+ +方法评价:定性试验简便和快速敏感度低临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定（二）试管凝集试验方法评价：半定量试验简便、快速敏感度低可有假阳性临床应用：肥达氏试验：伤寒副伤寒外裴二氏试验：斑疹伤寒Wright test:布鲁菌病交叉配血试验间接凝集反应(indirect agglutination)： 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，
3、在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。载体种类：RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）；金黄色葡萄球菌。三、 间接凝集反应用抗原致敏载体-检测抗体（一）间接凝集反应的类型1、正向间接凝集试验用抗体致敏载体-检测抗原2、反向间接凝集试验用抗原致敏载体-检测抗原3、间接凝集抑制试验coagglutination test：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。SPA-(Fc)IgG(
4、Fab)-AbSPA：staphylococcal protein A4、协同凝集试验（二）正向间接血凝试验血凝试验强度1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/1281/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024Pos.Pos.Neg.Neg.TiterTiter64648 8512512290% -半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*与Ag具有等同的与Ab结合能力，且两者的总量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；
5、随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低，二者变化成函数关系。 以未结合的Ag*为F，Ag*-Ab复合物为B，则B/F或B/T(BF)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线。2、实验方法及测定AgAg* *AgAg平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法AbAb体积温度时间pHAg*-标准；Ag-样品二抗体沉淀法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 结合与游离标记物的分离二、免疫放射分析1、基本原理：以过量125I标记抗体与待测
6、抗原进行非竞争性免疫结合反应, 用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。 2、单位点 IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合游离的标记抗体并将其分离, 测定上清液的放射量 3、双位点 IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。 RIARIAIRMAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1-2数量级特异性差（PcAb）
7、优（McAb）标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇IRMA与RIA比较 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。第三节 荧光免疫技术（一）荧光免疫分析的基本原理均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定非均相荧光免疫测定荧光偏振免疫测定荧光免疫技术荧光免疫技术的类型荧光免疫测定液体样品测定荧光抗体技术固体样品测定直接法间接法双标记法荧光物质ex（nm）em（nm）应用异硫氰酸荧光素 (FITC)490495520530（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹
8、明 (RB200)570575595600（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)550620（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560595（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354430（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340613时间分辨荧光免疫测定荧光免疫测定中常用的荧光物质 时间分辨检测原理示意图（二）时间分辨荧光免疫测定1、基本原理镧系元素铕(Eu3+)（最常用）；钐(Sm3+)；铽(Tb3+)；钕(Nd3+)；镝(Dy3+)荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景
9、110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA10002、标记物常见荧光物质的荧光寿命3、信号增强作用结合-二酮体Eu3+解离pH4荧光增强Eu3+标记的抗原-抗体复合物固相双抗体夹心法原理示意图固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。4、双抗体夹心法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧
10、光强度与待检抗原含量成反比。5、固相抗体竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。6、固相抗原竞争法荧光偏振免疫测定原理示意图 （三）荧光偏振免疫测定荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 酶标记抗体或抗原，与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合。洗去游离的酶标物。加入底物，经酶分解后生成荧光产物。（四）荧光酶免疫测定标记酶底物荧光产物 ex(nm) em(nm) 响应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010- 半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶H
11、PA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。1、双抗体夹心法荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。 2、双抗原夹心法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。3、固相抗原竞争法抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗
12、核抗体(斑点型)（五）荧光酶免疫技术的应用1、自身抗体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌 )2、病原体检测肿瘤（人肝癌细胞）3、免疫病理检测4、细胞表面抗原和受体检测荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 第四节 酶免疫测定一、基本原理（一）常用的酶及其底物1、辣根过氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基联苯胺 TMB。反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性。 2、
13、碱性磷酸酶（AP）对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）。经酶作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 3、 - 半乳糖苷酶（-Gal）多用于均相酶免疫测定。4MUG。经酶作用后生成高强度荧光物，用荧光计测量。（二）固相载体及其处理1、常用的固相载体塑料制品、微颗粒、膜载体。通过固相载体可以方便的将非均相酶免技术中游离的和结合的抗体（或抗原）酶标记物迅速分离。2、固相载体的处理包被（coating）：将抗原或抗体结合于固相载体。封闭（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均
14、相非均相固 相 酶 免疫测定液 相 酶 免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或抗体的定性和定量（三）酶免疫技术分类 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛。常用于传染病的诊断：病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒；结核杆菌、幽门螺杆菌。也用于一些蛋白质的检测：各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原）。（三）酶免疫测定的应用 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或
15、抗体的含量。常用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 。二、均相酶免疫测定1、酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique2、克隆酶供体免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 三、酶联免疫吸附试验Enzyme-linked immunosorbent assay（一）基本过程及试剂1、包被：固相的抗原或抗体 2、反应：加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。酶标记物（酶结合物） 3、洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4、底物显色：定性或定量的分析。酶反应的底物 1、双抗体夹心法 方
16、法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等（二）ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）竞争法测抗原E EE EE EE EE EE EE EE E1、间接法 方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应
17、的抗体。 应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。（三）ELISA检测抗体的方法间接法测抗体E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 应用于病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体的检测。原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记
18、特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 4、捕获法捕获法原理E EE EE EE EE E第五节 固相膜免疫测定一、常用的固相膜及其特点玻璃纤维素(fiberglass)，尼龙(nylon)，聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)，硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)多孔性-毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原- 高度敏感性易于漂洗- 操作简便固相NC膜 利用金溶胶中金颗粒高电子密度的特性，使其与抗体结合。显微镜下，金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而
19、用于定性或半定量的快速免疫检测。二、免疫金标记技术Immunogold labelling techique 阳性阴性固相膜 固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG 固相抗人IgG抗体IFA-双抗体夹心法原理图三、斑点金免疫渗滤试验dot immunogold filtration assay, DIGFA/IFA金洗样IFA-快速检测（渗滤法）示意图ICA-间接法测抗体 ICA-双抗体夹心法测抗原四、免疫层析试验immunochromatography assay, ICA样品垫结合物垫NC膜吸水垫 阳性阴性无效ICA 结果观察LATERAL FLOW TEST STRIP OF VE
20、DALAB30五、斑点酶免疫吸附试验 dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-LISA六、酶联免疫斑点试验enzyme linked immunospot, ELISPOT 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后，底物孵育后， PVDF 孔板出现孔板出现“紫色紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过通过 CTL 公司生产的公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。斑点的分析后得出结果。ELISPOT结果判断Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检七、免疫印迹法-Westernblot放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏八、放射免疫沉淀试验
