1、第四章第四章 微生物的合成代谢微生物的合成代谢l微生物利用能量代谢所产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子，合成复杂的细胞物质的过程称合成代谢合成代谢。自养型微生物以CO2为碳源，以无机物为电子供体；异养型微生物则以有机物为碳源和电子供体。转氢酶转氢酶一、单糖的合成l对自养微生物而言，单糖的合成从CO2的吸收开始，某些异氧微生物有时也有吸收CO2的过程，但需要通过一些特别途径完成。在糖的能量代谢的基础上，或者细胞内三碳、四碳中间产物含量较丰富的情况下，单糖的合成不是一个特别过程。l1.两个三碳糖可通过EMP途径的逆反应合成六碳糖：l2.在HMP途径中，有多种五碳糖转变成六碳糖的方式。5-磷
2、酸磷酸-木酮糖木酮糖+4-磷酸磷酸-赤藓糖赤藓糖3-磷酸磷酸-甘油醛甘油醛+6-磷酸磷酸-果糖果糖转酮酶转酮酶l 3.各类微生物，包括自养和异氧微生物合成单糖的主要途径一般都是通过EMP途径的逆向反应合成6-磷酸葡萄糖。l 4.甲养菌通过核酮糖磷酸途径（I型甲养菌）和丝氨酸途径（II型甲养菌）进行碳同化。二、糖核苷酸的合成和相互转化l 单糖必须先活化，才能进行互变：磷酸化生成磷酸糖再与核苷二磷酸连接，生成UDP-糖、GDP-糖等。1-磷酸葡萄糖+UTPl 各种糖核苷酸在微生物中可以通过异构化相互转化。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UDP-葡萄糖+PPilUDP-单糖（或其它糖核苷酸）在微生物细胞中具
3、有两种功能：一是为某些单糖的合成提供一种转换合成的底物，二是为多糖的合成提供糖基。三、同型多糖的合成l微生物细胞内同型多糖的合成有一基本相同的途径：合成起始时都需要一个寡聚糖作引物，然后单糖逐一添加在引物上使链延长。但作为供体的单糖(或单糖的衍生物)先必须转变成活化型的磷酸糖或糖核苷酸，然后才能靠糖-磷酸键释放的能量推动合成反应的进行。l（一）淀粉和糖原的合成（一）淀粉和糖原的合成l1.淀粉合成：引物是一个至少有四个葡萄糖淀粉合成：引物是一个至少有四个葡萄糖残基的寡聚糖，单糖的活化形式，在植物中残基的寡聚糖，单糖的活化形式，在植物中为为UDP-葡萄糖，在细菌中是葡萄糖，在细菌中是ADP-葡萄糖
4、，葡萄糖，糖糖-磷酸键水解释放的能量用于淀粉合成：磷酸键水解释放的能量用于淀粉合成：l在淀粉合成中，引物可以由麦芽糖在转葡萄在淀粉合成中，引物可以由麦芽糖在转葡萄糖苷酶的作用下产生。糖苷酶的作用下产生。l在某些菌中，合成的途径有所不同。在某些菌中，合成的途径有所不同。l支链淀粉是在直链的基础上形成的。直链淀粉在分支酶的催化下，将链末端的一小段切下，并在链的中间与一个葡萄糖以-1,6-键连结：l双糖的形成，在酿酒酵母和结核分枝杆菌里，是UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖之间经糖苷化作用合成；在链霉菌里是由GDP-葡萄糖和磷酸糖通过糖苷化作用合成；而某些微生物，能直接将两个单糖通过糖苷化作用合成双糖。
5、（二）葡萄糖胶和果糖胶的合成l细菌糖被中的葡萄糖胶是由葡萄糖经-1,6-键联结而成的聚合体，又称葡聚糖；真菌、酵母中的葡聚糖是由-1,6糖苷键和-1,3糖苷键连接而成;有些醋杆菌(Acetobacter)所产生的葡萄糖胶还有-1,4-键的分枝。葡萄糖胶以稠厚的粘液或荚膜的形式累积在细菌细胞周围。l牛链球菌(S.bovis)产生的葡萄糖胶是仅由-1,6-键构成的直链，可作为血浆的代用品。它的合成是由蔗糖在葡萄糖胶蔗糖酶的催化下进行的：l果糖胶是由果糖经-2,6键连结而成的聚合体，又称果聚糖。有时有-1,2键连结的分支。l果糖胶也是由蔗糖产生，许多微生物，如枯草杆菌、马铃薯芽孢杆菌(B.mesen
6、tericus)等，在果糖胶蔗糖酶的催化下，将蔗糖聚合成果糖胶：l在利用蔗糖合成葡聚糖或果聚糖时，只要通过转糖在利用蔗糖合成葡聚糖或果聚糖时，只要通过转糖基作用就能延长多糖的链，此过程中利用的能量只是基作用就能延长多糖的链，此过程中利用的能量只是蔗糖分子中糖苷键的能量的转化，不需要消耗蔗糖分子中糖苷键的能量的转化，不需要消耗ATP。（三）纤维素的合成l纤维素是真菌和植物的细胞壁的组分。l有些细菌如胶醋杆菌(A.xylinum)的细胞外粘液层中也含有纤维素，这说明胶醋杆菌也能合成纤维素。胶醋杆菌合成纤维素的方式与合成淀粉的方式相似，只不过引物是小分子纤维素，单糖的活化形式是UDP-葡萄糖。(四)
7、几丁质的合成l几丁质又称甲壳质，是甲壳类动物外壳的组分，也是许多真菌细胞壁的构成部分。l几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺(或称N-乙酰氨基葡萄糖)通过-1,4键连结而成的聚合物：l合成方式同淀粉，供体为UDP-N-乙酰葡萄糖胺（NAG或GNAc）。胺胺胺胺以下是几种糖类合成的活化形式和所需引物以下是几种糖类合成的活化形式和所需引物：糖类糖类 活化形式（供体）活化形式（供体）引物引物 单糖单糖磷酸糖磷酸糖同型同型多糖多糖 淀粉和淀粉和糖原糖原ADP-葡萄糖、葡萄糖、UDP-单糖单糖4个葡萄糖残基组个葡萄糖残基组成的寡聚糖成的寡聚糖纤维素纤维素UDP-葡萄糖葡萄糖小分子纤维素小分子纤维素三、异型多糖的合
8、成l包括：透明质酸、肽聚糖、脂多糖等。(一)透明质酸的合成粘多糖的一种。透明质酸是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸构成的聚合物，其基本结构单位为：透明质酸的合成也需要小分子引物，供体则为UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸，两者交替向引物上转移糖苷，从而合成大分子的透明质酸。葡萄糖醛酸由葡萄糖氧化而成，氧化前葡萄糖必须变成UDP-葡萄糖的形式。（二）肽聚糖的合成1.双糖肽单位合成（细胞质中）:N-乙酰葡萄糖胺(NAG)、N-乙酰胞壁酸(NAMA)的生成和N-乙酰胞壁酸短肽的合成，以及由NAG、NAMA和短肽构成的双糖短肽单位的生成等。N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的生成胺胺N-乙酰胞壁酸则是
9、在N-乙酰葡萄糖胺的基础上进一步演变而成。其过程如下：课本图6-14N-乙酰胞壁酸短肽的合成在细胞质中NAMA-短肽的合成过程中，起始于1-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺，包括而后的NAMA-短肽与N-乙酰葡萄糖胺的结合。前三个氨基酸逐步加到NAMA上，后两个氨基酸先形成二肽，然后再添加上去。每种氨基酸的加入以及二肽的加入都需要专一性的连接酶催化(这些酶需Mg2+或Mn2+为辅因子)，并且都要消耗ATP。双糖肽单位的形成，在细胞质中完成双糖肽单位的形成，在细胞质中完成双糖肽单位的形成，在细胞质中完成（三）脂多糖（LPS）的合成l脂多糖的合成分以下三个阶段：类脂A、核心区的合成；O-特异侧链（O-抗原）
10、的合成；类脂A、核心区和O-抗原的聚合。1.（1）类脂A的合成1-磷酸葡萄糖胺的形成1-磷酸-二脂酰葡萄糖胺（DGNP）的形成DGN二聚体的形成双己糖胺衍生物（一端的羟基被核心多糖取代，另一端被长链脂肪酸取代）合成类脂A。（2）核心区的合成l 在类脂A的KDO（2-氧代-3-脱氧辛酮糖酸）上，可逐步加入各种单糖、某些非糖成分如磷酸、磷酸乙醇胺等，使核心寡糖链逐步延长直到合成完成。l 单糖都必须变成UDP-糖以后才能加入到核心寡糖上。l 此外，核心寡糖中某些糖上的磷酸基团则由ATP提供。2O抗原的合成(鼠伤寒沙门氏菌)l O抗原的合成需要与膜结合的O抗原多糖合成酶的催化(该酶以Mg2+为辅助因子
11、)，还需要寡糖聚合酶的作用。重复寡糖的基本单位由半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）甘露糖（Man）和阿比可糖(Abe)组成。l 单糖参与合成前必须先与核苷二磷酸结合，且不同的单糖所结合的核苷二磷酸各不相同，结合后分别是：UDP-Gal，TDP-Rha、GDP-Man和CDP-Abe。重复寡糖的合成过程有点像蛋白质的合成：O抗原多糖合成后，再分别接上一些乙酰基或葡萄糖基，然后在脂多糖合成酶的作用下，以-1，3键连接到R-核心的半乳糖第3位碳上。其中，乙酰基来自乙酰CoA，葡萄糖来自UDP-葡萄糖，修饰过程需要相应的酶催化，O抗原多糖与R-核心的连接则在脂多糖合成酶的作用下进行。l脂多糖合成后转移
12、到外膜层，靠类脂A上的6个脂肪酸嵌入外膜的疏水层。（四）磷壁质（酸）的合成l磷壁质是甘油磷酸聚合物与核糖醇磷酸聚合物的共聚体。1甘油磷酸聚合物的形成 甘油磷酸聚合物是通过磷酸二酯键将甘油串接而成，其合成方式如下：2核糖醇磷酸的形成 核糖醇磷酸由磷酸核酮糖转变而来，经活化成CDP-核糖醇后，再聚合成核糖醇磷酸聚合物：3磷壁质与肽聚糖之间的连接l磷壁质的甘油与核糖醇中游离的羟基可以和葡萄糖、葡萄糖胺、D-丙氨酸等连接。其中，糖是以UDP-糖的形式，丙氨酸是以D-丙氨酸-AMP-酶的复合物形式转移到磷壁质上的。l生物体内所有的物质，包括糖类、脂类、蛋白质、核酸等都是在37碳的有机碳化合物的基础上合成
13、的，所以，37碳有机碳化合物的原始起点理所当然地受到了重视，成了划分微生物营养类型的标准之一。一、二氧化碳的同化（固定）l微生物有两类同化CO2的方式，一类是自养式，另一类为异养式。在自养式中，CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养式中，CO2被固定在某种有机酸上，结果加长了碳链却消耗了该有机酸，要使CO2的固定能继续进行，则必须补充有机酸。因此，异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机的碳化合物而生存。(一)自养式CO2的同化l自养式CO2同化所需要的能量来自光能(光能自养微生物)或无机物氧化的化学能(化能自养微生物)。l在微生物中，至今已了解的
14、同化CO2的途径主要有4条，即卡尔文循环（Calvin cycle）、厌氧乙酰CoA途径、逆向TCA循环途径和3-羟基丙酸循环。1卡尔文循环l 卡尔文循环又称核酮糖二磷酸途径或还原性戊糖磷酸循环。这一循环是光能自养微生物和化能自养微生物固定CO2的主要途径。l 利用Calvin循环进行CO2固定的生物，除了绿色植物、蓝细菌和多数光合细菌外，还包括硫细菌、铁细菌和硝化细菌等化能自养菌，因此十分重要。l卡尔文循环固定CO2的途径可以分为三个阶段：羧化反应（CO2的固定）；还原反应；CO2受体的再生；其中羧化反应是Calvin循环的关键，也是自养微生物和高等植物所特有的反应，其它反应在异养微生物的E
15、MP和HMP中也存在。（1）羧化反应 CO2的受体是1，5-二磷酸核酮糖，它是在5-磷酸核酮糖激酶的催化下，由5-磷酸核酮糖产生的。然后，在l，5-二磷酸核酮糖羧化酶的作用下，l，5二磷酸核酮糖吸收一个CO2，生成2分子3-磷酸甘油酸。（2）还原反应 被固定的CO2的还原，这一过程是紧接在羧化反应后，立即发生3-磷酸甘油酸上羧基还原为醛基的反应（经EMP途径的逆反应进行），生成3-磷酸甘油醛。将酸还原成醛需要还原态的NADPH，还需要3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶。（3）CO2受体的再生 一部分3-磷酸甘油醛转变成5-磷酸核酮糖，5-磷酸核酮糖在5-磷酸核酮糖激酶的催化下转变成1，5
16、-磷酸核酮糖。从而再生受体1，5-二磷酸核酮糖。转转酮酮酶酶醛醛缩缩酶酶磷脂酶磷脂酶转酮酶转酮酶5-磷磷酸酸核核酮酮糖糖激激酶酶羧化酶羧化酶ll，5-二磷酸核酮糖羧化酶、1，7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酯酶和5-磷酸核酮糖激酶是Calvin循环的特征酶，它们都是不可逆的，保证Calvin 循环沿着合成的方向运转。lCalvin循环的意义:在Calvin循环中，3个受体分子循环一次，固定3个CO2，生成1mol 3-磷酸甘油醛，或6个受体分子循环一次，固定6个CO2，生成1mol葡萄糖。l Calvin循环是自养微生物单糖的主要来源，也是其它糖类合成的起点。不仅如此，Calvin循环还是其他它有机物
17、合成的基础，CO2固定后的产物以及Calvin循环的中间产物，可进入别的代谢途径，合成其它有机物。2.还原性三羧酸循环固定CO2（逆向TCA循环途径）绿硫细菌中有催化丙酮酸、-酮戊二酸合成的酶，而且铁氧还蛋白也参与CO2固定的反应。在绿硫细菌中新发现的两个反应为：（需铁氧还蛋白参与的羧化反应）：l从以上反应中，可间接得到糖类物质，因为这些二碳、三碳及四碳物均是一些物质合成途径的中间产物，像乙酰CoA、丙酮酸、草酰乙酸等。l经这一途径固定CO2可得到乙酰CoA、丙酮酸和草酰乙酸等。3.厌氧乙酰CoA途径l这种非循环式的CO2固定机制主要存在于一些产乙酸菌、硫酸盐还原菌和产甲烷菌等化能自养细菌中。
18、总反应为：4H2+2 CO2CH3COOH+2H2O 例如，产甲烷细菌的细胞中，没有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，估计产甲烷细菌不是利用Calvin循环固定CO2。到目前为止，已知产甲烷细菌有多种固定CO2的反应，其中乙酸是产甲烷细菌合成细胞物质的重要前体。l在厌氧乙酰-辅酶A的CO2还原途径中，1分子CO2先被还原力H(通过含F420因子或NADP的酶所转移)还原成甲基水平(甲基-X)。另一分子CO2则被一氧化碳脱氢酶还原成一氢化碳。通过甲基-X的羧化产生乙酰-X，进而形成乙酰辅酶A，在丙酮酸合成酶的催化下，由乙酰辅酶A接受第3个CO2分子而羧化成丙酮酸。然后就可由丙酮酸通过已知代谢途径去合成
19、细胞所需要的各种有机物。（二）异养式CO2的固定l异养式CO2固定一般都是物质代谢过程中某些脱羧反应的逆反应，根据反应的能量来源，可分为以下几种类型：1需要还原型烟酰胺核苷酸作为能源的反应2.需要ATP作为能源的反应3高能磷酸化合物的反应（三）产甲烷细菌的CO2固定l 乙酸是甲烷细菌合成细胞物质的前体，如何由CO2乙酸实际上是乙酸细菌如何固定CO2 乙酸的问题。然后CO2乙酸丙酮酸丙氨酸2CO2乙酸草酰乙酸-酮戊二酸二、还原力（NADH或NADPH）的产生l异养微生物的还原力来自能量代谢中的某些步骤。这里主要针对自养微生物的还原力的产生。（一）化能自养微生物产生还原力的方式1直接偶联 氢细菌的
20、电子传递系统，在氧化H2的同时，生成NADH2。2电子反向传递 呼吸链（好氧呼吸电子传递体系）中，均从氧化还原电位低高，放能反应；而在电子反向传递中，从高低，必定需要能量，最后传给NAD（NAD+）或NADP（NADP+）产生还原力。在亚硝化细菌中的反向电子传递过程中，产生1mol NADH需要消耗3mol ATP；而NO2-氧化成NO3-时失去2个电子经呼吸链仅产生 1mol ATP，所以硝化细菌生长时需要大量底物，生长缓慢，得率低。（二）光能微生物产生还原力的方式 在非环式光合磷酸化反应中，绿色植物，蓝细菌光合系统、光合细菌（绿硫菌、着色细菌只具一个系统）在此过程中，均有NADH或NADP
21、H产生。大多数光合细菌进行环式光合磷酸化反应 由ATP驱动反向电子传递，从还原NAD+中获得 NADH。l简单脂类：甘油3分子脂肪酸l复合脂类：除甘油、脂肪酸外 还含磷酸、含氮碱、单糖等。一、脂肪的合成：脂肪酸甘油脂肪l脂肪酸的合成：微生物脂类中脂肪酸含有的碳原子一般在12-18个之间。饱和脂肪酸不饱和脂肪酸（一）饱和脂肪酸的合成引物的生成乙酰 CoA（原料）ACP乙酰-ACPCoA（乙酰 CoA是脂肪酸所需碳源的最初来源）乙酰转移酶乙酰转移酶供体的生成：丙二酸单酰-ACPa.由乙酰CoA生成三碳单位（分成两个阶段：生物素羧化酶和羧基转移酶）；b.三碳单位再与引物结合，生成供体丙二酸单酰-AC
22、P脂肪酸碳链的延长l脂肪酸碳链的延长分4步进行，包括合成、还原、脱水、还原（循环）：供体与引物结合时，同时发生脱羧过程，引物上增加一个二碳单位，产生乙酰乙酰-ACP 酮基被还原为羟基 -羟丁酰-ACP脱水生成-烯丁酰-ACP -烯丁酰-ACP 的双键饱和生成丁酰-ACP丁酰-ACP与丙二酸单酰-ACP反应,重复以上4步过程成为己酰-ACP,将碳链延长，直至合成棕榈酰-ACP（十六（烷）酰-ACP）。（二）不饱和脂肪酸的合成l不饱和脂肪酸的合成大致有以下两种方式：1.减饱和作用（好养）饱和脂肪酸脱氢不饱和脂肪酸CH3(CH2)7-C-C-(CH2)7-CO-SCOACH3(CH2)7-C-C=(
23、CH2)7-CO-SCOAH HHH-4HH H2.不饱和脂肪酸合成支路 缺氧条件下，一般不饱和脂肪酸的合成都在饱和脂肪酸（合成）的前期不饱和脂肪酸。在厌氧条件下合成一个双键（不饱和）脂肪酸时，其双键是在合成10个碳原子的脂酰-ACP之前产生的。超过10C只能合成饱和脂肪酸。（三）脂肪酸中环丙烷结构的形成l某些细菌如大肠杆菌、克氏梭菌等还含有带一个丙烷结构的脂肪酸，这是甲硫氨酸将甲基转给不饱和脂肪酸的双键碳原子后形成的。（四）脂肪的合成 2mol酯酰-ACP+1mola-磷酸甘油 -磷酸甘油二酯+1mol酯酰-ACP 甘油三酯二、磷脂的合成 磷脂是由磷酸、甘油、脂肪酸和含氮碱组成，一般结构如下
24、：R1、R2代表不同的脂肪酸（非极性）X代表不同的含氮碱基（极性）l 合成磷脂的前体是磷脂酸，主要底物是3-磷酸甘油，EMP途径中的磷酸二羟丙酮脱氢获得，也可由甘油在甘油激酶作用下获得。磷酸二羟丙酮+NADH+H+3-磷酸甘油脱氢酶 3-磷酸甘油+NAD+甘油+ATP 甘油激酶 3-磷酸甘油+ADPl 脂酰CoA与3-磷酸甘油合成磷脂酸，再与CTP反应生成CDP-甘油二脂（前体）。即：磷脂酸CTPCDP-甘油二脂+磷酸甘油，形成各种磷脂。或丝氨酸三、甾醇类的合成l 即固醇类，以环戊烷多氢菲为基本结构，以麦角甾醇为例，其合成分4个阶段合成：（一）甲羟戊酸的合成 又分2个阶段 乙酰-CoA乙酰乙酰
25、-CoA（合成酶）-羟基-甲基戊二酰-CoA（还原酶）甲羟戊酸（合成赤霉素的原料）。此过程中，COOH被还原为醇基，放出CoA。（二）二甲基丙烯焦磷酸的合成 包括2步磷酸化和一次脱羧反应（三）法呢酯焦磷酸的合成 1mol二甲基丙烯焦磷酸2mol异戊烯焦磷酸（缩合反应）牻牛儿焦磷酸（橙花叔醇焦磷酸）（异构化）法呢酯焦磷酸（合成胡萝卜素的前体）（四）甾醇的合成 1mol法呢酯焦磷酸1mol橙花叔醇焦磷酸（缩合）鲨烯（甲基转移）麦角甾醇l在氨基酸、核苷酸等含氮有机物的合成中，氮元素进入有机物的起点是氨。l自然界必须在有氨存在的前提下维持生物的生存。氨的来源：一些自然过程（如雷电）；生物固氮（由微生物
26、将自然界中的分子氮还原为氨的过程）。一、固氮微生物和固氮体系l 目前的研究结果表明，能够进行固氮的生物基本上都是一些原核生物，主要包括细菌、放线菌和蓝细菌近50个属，100多种。在这些固氮微生物中，有的是单细胞的自生固氮菌，它们能够独立地进行自生固氮；有的则是与其它生物共生固氮，或者只有在共生条件下才表现旺盛的固氮作用（根瘤菌和豆科植物的共生、弗兰氏放线菌和非豆科植物的共生；蓝细菌同真菌、水生蕨类植物及裸子植物的共生）；还有联合固氮作用介于上述两者中间。l 固氮过程（酶的催化反应）是一个厌氧过程，但固氮菌却既有厌氧菌、兼性厌氧菌，又有好氧菌。二、固氮酶及其特征l固氮酶由两部分构成：即固氮铁钼氧
27、还蛋白（又称固氮酶或酶I）和固氮铁氧还蛋白（又称固氮酶还原酶或酶）。两种蛋白质单独存在时都不能表现固氮酶活性，只有两种组合构成复合体时才具有催化氮还原的功能；不同来源固氮酶的铁蛋白和钼铁蛋白可以交叉组合，但有明显的物种特异性；由钼铁蛋白和铁蛋白组成的固氮酶并不是固氮微生物中起固氮作用的唯一系统，例如从棕色固氮菌中发现了由钒铁蛋白和铁蛋白组成的固氮系统，近年又发现了不含钼钒的三套系统。1.含钼辅因子多种酶中含有（如硝酸盐还原酶、黄嘌呤氧化酶、亚硫酸氧化酶，乙醛氧化酶和固氮酶的固氮铁钼氧还蛋白等）一种含钼辅因子，对它们的活性有很重要的作用，因为失去含钼辅因子后都会导致失活。2.固氮酶的专一性（还原
28、三键化合物）固氮酶不仅催化氮还原成氨，而且还能催化叠氮化物、菁化物、丙二烯、环丙烯、乙炔等还原成相应的产物。在固氮酶作用于底物时，上述反应彼此还可产生干扰作用。测定固氮酶活性的常用方法：乙炔还原法特点：3.固氮酶对O2的敏感性固氮酶的酶和酶对氧都非常敏感，以致固氮酶被氧处理后可导致酶活性不可逆地丧失。固氮酶的提取与分析研究工作必须在严格厌氧的条件下进行。4.固氮酶的冷不稳定性固氮酶在摄氏零度左右比在室温下更容易失活，这种冷不稳定性是铁蛋白的特征。加入乙醇可对固氮酶起保护作用。三、微生物固氮机理l固氮酶在进行固氮反应时需要N2、还原型铁氧还蛋白(注意与固氮铁氧还蛋白区别)或还原型黄素蛋白，以及A
29、TP作为底物。二胺亚胺 肼(一)固氮过程 lATP一定要与镁(Mg)结合，形成Mg-ATP复合物后才能起作用；l固氮反应需要ATP和还原力。所以，凡能抑制能量代谢的物质，如叠氮化合物、氰化物、异氰酸甲酯和CO等，都能抑制固氮酶的固氮作用。（二）还原力的来源l固氮微生物中，固氮酶所需的还原力是由还原型铁氧还蛋白或还原型黄素蛋白提供的。（三）在有氧环境中固氮菌的保护机制l固氮酶对氧敏感，它催化的固氮反应是一个厌氧过程，而固氮菌的生活环境是有氧存在的，这就出现了一对矛盾。l对好氧菌来说，为了使固氮反应能在有氧环境中顺序进行，必须有一些特别的保护机制。1呼吸保护作用：通过加强呼吸来提高氧的消耗率，使氧
30、在到达固氮酶反应部位之前被消耗，这样就在固氮酶反应部位周围造成一个局部厌氧或氧分压低的小环境。2构象保护作用：褐球固氮菌(Azotobacter chrococcum)固氮酶利用构象改变，使氧敏感部位隐藏起来，以及利用与保护性蛋白（FeSII蛋白）结合进行保护。3.结构保护：异形细胞：大多数呈丝状的蓝细菌由一个结构特殊的细胞异形细胞(又称分节细胞)进行固氮反应。异形细胞的表面积与体积之比较小，且细胞壁较厚，这样环境中的氧就较难进入细胞。另外，异形细胞内缺乏光合系统，所以它本身也不产生氧。以上两个特点能保证异形细胞处于厌氧或氧分压较低的小环境，使固氮反应能顺利进行。(四)共生固氮l 根瘤菌侵入豆
31、科植物 类菌体(bacteroid)。l 类菌体将N2还原为氨为植物提供了丰富的氮源，植物则不仅为类菌体提供了必需的营养物质，同时还为类菌体提供了厌氧环境（类菌体周膜和瘤的内皮层内侧细胞排列紧密并形成间隙），两种生物在共生中互利、合作。l 其实类菌体也需要进行有氧呼吸，供给它进行有氧呼吸的氧由豆血红蛋白(类似于血红蛋白)输送，根瘤中氧的浓度也由它控制，根瘤中豆血红蛋白结合氧与自由氧的比例一般为10000：1。l 根瘤菌主要与豆科植物的根细胞共生，且对豆科植物的侵染有明显的特异性。四、固氮酶活性的调节(一)氨调节固氮菌在有过量的氨存在的环境中生活时，它的 固氮酶系统会受到抑制。氨是通过间接途径影
32、响固氮酶的活性的。1氨甲酰磷酸的作用在氨基酸的合成代谢中，微生物可以将氨同化生成氨甲酰磷酸。而氨甲酰磷酸可以抑制巴氏芽孢梭菌细胞内固氮酶的活性，将其活力降低50；同时还能抑制固氮酶的合成。因此，氨甲酰磷酸的存在将会大大削弱固氮反应。当环境中氨浓度高时，固氮菌细胞生成氨甲酰磷酸的量就增加，从而间接影响了固氮酶的活性和固氮酶的合成。2.谷氨酰胺合成酶的作用在缺少谷氨酰胺合成酶的情况下，固氮酶也不能合成。固氮酶基因受谷氨酰胺合成酶的控制。在氨基酸的代谢中，谷氨酰胺合成酶可催化谷氨酸同化氨的反应。但该反应的产物谷氨酰胺却能抑制谷氨酰胺合成酶的生成，当氨浓度增加时，谷氨酰胺的量也增加，谷氨酰胺合成酶的生
33、成受到抑制，从而间接地影响了固氮酶的合成。l 上述两种作用对固氮菌的自我调节具有很重要的意义。（二）其它因子的调节1ATPADP比率调节 由于催化1分子氮还原成氨要消耗1216个ATP，可见固氮反应对ATP的依赖很突出。实验也证明：ATPADP比率降低，固氮酶的活性就受到抑制；ATPADP比率提高，固氮酶活性也相应增加。2钼调节 固氮酶的酶I及其铁钼辅因子都必需钼元素。有些固氮菌在缺钼的情况下根本就不合成固氮酶，或者合成的酶无活性（蓝细菌鲍氏织线藻，Plectonema boryanum）3氧调节 氧不仅能使固氮酶失活，同时还有实验表明，氧也能阻遏固氮酶的合成。l氨基酸的合成：氨和碳骨架 氨的
34、产生：生物固氮合成、外界吸收、体内含氮化合物分解和硝酸还原作用；微生物利用三种反应途径把氨转化为有机化合物，这些有机物用于氨基酸的合成。氨可以在氨甲酰磷酸合成酶的作用下形成氨甲酰磷酸而同化。氨甲酰磷酸是精氨酸和嘧啶合成的前体，是一种氨基的供体。在谷氨酸脱氢酶的作用下，-酮戊二酸NH3+NAD（P）HH谷氨酸NAD+（P）+H2O在谷氨酰胺合成酶作用下，谷氨酸NH3 ATP谷氨酰胺ADPPi 碳骨架来自于糖的各种代谢途径(三羧酸循环、糖酵解及戊糖磷酸途径)。根据氨基酸合成起始物-代谢中间体的不同，可将氨基酸的生物合成途径归纳为六族，它们的氨基基团多来自谷氨酸的转氨基反应。一、谷氨酸族氨基酸的合成
35、l1.谷氨酸和谷氨酰胺的合成在谷氨酸脱氢 酶 的 作 用 下，-酮 戊 二 酸 NH3+NAD（P）HH谷氨酸NAD+（P）+H2O在谷氨酰胺合成酶作用下，谷氨酸NH3 ATP谷氨酰胺ADPPi谷氨酸和谷氨酰胺通过转氨基作用和转酰基作用为其它氨基酸的合成提供氨和酰胺，在氨基酸的和合成中处于中心位置。l2.赖氨酸的生物合成赖氨酸的生物合成在不同的生物中有完全不同的两条途径，在酵母和霉菌中，赖氨酸的合成以a-酮戊二酸为起始物，在一般的细菌中赖氨酸的合成则是通过丙氨酸和天冬氨酸-半醛的缩合途径合成。二、天冬氨酸族氨基酸的合成 l 1.天冬氨酸和天冬酰胺的生物合成三、丙酮酸衍生类型氨基酸的生物合成1.
36、丙氨酸的生物合成四、丝氨酸-甘氨酸族氨基酸的合成l 在合成蛋白质时，DNA首先将信息转录，即在DNA的指导下合成信使RNA(mRNA)，先将信息反映到mRNA上，然后，再按mRNA的指令合成蛋白质（翻译）。中心法则蛋白质合成核苷酸的合成l核苷酸是核酸的基本结构单位，它是由碱基、戊糖和磷酸所组成，包括嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸。l核苷酸是在氨基酸的基础上合成的，氨基酸中的氨基为核苷酸中的碱基提供了氮杂环中的氮。一、嘌呤核苷酸的合成l嘌呤核苷酸由嘌呤、核糖和磷酸组成。l微生物合成嘌呤核苷酸有两种方式直接由前体合成嘌呤核苷酸。由自由碱基或核苷组成。某些微生物突变体在有游离嘌呤存在的情况下，可以将嘌呤与5
37、-磷酸核糖-1-焦磷酸反应，生成嘌呤核苷酸与焦磷酸。嘌呤环中的组成元素分别来自CO2、甘氨酸、甲酸、谷氨酰胺和天冬氨酸。（一）嘌呤核苷酸的合成可以分成两个阶段：合成次黄嘌呤核苷酸(IMP)阶段；次黄嘌呤核苷酸合成鸟嘌呤核苷酸(GMP)和腺嘌呤核苷酸(AMP)阶段。次黄嘌呤核苷酸的合成次黄嘌呤核苷酸的合成腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的合成腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的合成核苷磷酸化酶核苷磷酸化激酶腺嘌呤+5-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖转移酶腺嘌呤核苷酸+PPi鸟嘌呤+5-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖转移酶鸟嘌呤核苷酸+PPi腺苷酸琥珀酸腺苷酸琥珀酸合成酶合成酶次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷酸脱氢酶酸脱氢酶转酰胺酶转酰胺酶二、嘧
38、啶核苷酸的合成l嘧啶核苷酸中嘧啶环中的元素来自氨甲酰磷酸和天冬氨酸。（一）尿嘧啶核苷酸的生物合成l1.尿嘧啶核苷酸合成的第一步是氨甲酰磷酸与天冬氨酸缩合，生成氨甲酰天冬氨酸。然后，经脱水、脱氢生成乳清酸。乳清酸同5-磷酸核糖焦磷酸反应、生成乳清酸核苷酸，再经脱羧生成尿嘧啶核苷酸。（二）胞嘧啶核苷酸是在尿嘧啶核苷酸的基础 上，经两次磷酸化和氨化作用转变而来。UMP+2ATP激酶UTPUTP+NH3+ATP+H2OCTP合成酶CTP+ADP+Pi尿嘧啶+5-磷酸核糖焦磷酸UMP磷酸核糖转移酶尿嘧啶核苷酸+PPi尿嘧啶+1-磷酸核糖尿苷磷酸化酶尿嘧啶核苷+ADP尿嘧啶核苷+ATP尿苷激酶尿嘧啶核苷酸
39、+Pi氨甲酰磷酸合成酶氨甲酰磷酸合成酶天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶CTP合成酶合成酶三、脱氧核苷酸的合成（一）脱氧嘌呤核苷酸的合成l在不同的微生物中，脱氧过程在不同的水平上进行，一种是在嘌呤核苷三磷酸水平上进行（核酸还原酶），另一种是在核苷二磷酸水平上还原。（二）脱氧嘧啶核苷酸的合成脱氧核苷酸是由核苷酸糖基第2位碳上的-OH还原为H而成。dCMP dCMP脱氨酶脱氨酶 dUMP四、烟酰胺核苷酸与核黄素的合成（一）NAD和NADP的合成l 在酿酒酵母、粗糙脉胞菌和桃李黄单胞菌中，NAD和NADP是以色氨酸为前体合成的。大多数细菌则是以甲酸或磷酸二羟丙酮和天冬氨酸为前体，通过缩合反应以及几
40、步还不清楚的反应合成吡啶二羧酸，然后再合成NAD与NADP。（二）黄素核苷酸的合成l在某些微生物中（如酿酒酵母），核黄素合成的前体是鸟嘌呤核苷三磷酸（GTP），ZIIP)。l核黄素在黄素激酶作用下与ATP反应生成黄素单核苷酸(FMN)，FMN在FAD焦磷酸化酶作用下与ATP反应生成黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。五、卟啉化合物的合成l其合成也是由简单的直链小分子前体开始，且合成的卟啉结构也是含氮的多员杂环。（一）原卟啉的合成前体：甘氨酸（8个）、琥珀酰辅酶A（8个）（二）血红素和 叶 绿 素 的合成 从原卟啉开始，合成血红素和叶绿素。核酸的合成l 核酸合成的过程也就是遗传物质的复制(DNA合成)
41、或转录(RNA合成)过程。（一）DNA的合成 DNA大分子自我复制的过程。DNA自我复制后，由一个DNA分子变成两个DNA分子，每个DNA分子中有一条新的脱氧核糖核酸链，同时又保留了原有的一条旧的脱氧核糖核酸链，故DNA合成过程又称半保留复制。DNA的合成有如下几个特点：1合成方向脱氧核糖核酸是通过磷酸二酯键一头与一个核糖的第5位碳上的羟基成酯、另一头与另一个核糖的第3位碳上的羟基成酯，如此串接而成。以DNA的一条链为模板，新链的合成方向是从5向3方向进行。2引物与供体DNA的合成必须有由50100个核苷酸组成的RNA片段作引物，在此引物上添加脱氧核苷酸合成脱氧核糖核酸。合成结束后再通过水解去
42、掉引物RNA，得到完整的DNA。供体必须是各种脱氧核糖核苷三磷酸，即dATP、dCTP、dTTP和dGTP。(dNTP)3.DNA聚合酶DNA合成要在DNA聚合酶的作用下进行。在大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶。（二）RNA的合成lRNA是单链分子，是以DNA为模版复制的。l合成过程在依赖DNA的RNA聚合酶的催化下进行，需要Mg2+或Mn2+。l反向转录酶（逆转录酶）：能催化以RNA为模板合成DNA的酶，亦称依赖RNA的DNA聚合酶。lTemin和Baltimore因发现逆转录酶而获得1975年的诺贝尔奖。有氧环境中固氮菌的保护机制。光合磷酸化的类型及特点。光合磷酸化的类型及特点。4.DNA
43、的体外合成的体外合成PCR技术技术l1985年，美国Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，即以一对特定的寡核苷酸片段为引物，在耐热的Taq DNA聚合酶作用下，体外合成特异的DNA片段。在数小时内可以将目的基因扩增上百万倍。l该技术的产生给整个分子生物学领域带来了一次重大的革命。为此，Mullis在1993年获得诺贝尔奖lPCR技术自问世以来，已经在生物学、医学、考古学、人类学等许多领域内获得了广泛的应用。它可以在体外通过酶促合成反应成百万倍地扩增某一段目的基因。PCR要求反应体系具有下列条件：要有与被分离的目的
44、基因两条链各一端序列相互补的DNA引物（约20个碱基左右）；具有热稳定性的酶如TaqDNA聚合酶；4种脱氧核糖核苷酸dNTP；作为模板的目的DNA序列。一般的PCR技术可以扩增出100-5000bp的目的基因，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR仪每个PCR循环包括以下反应：双链DNA的变性，通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火，当温度突然降低使引物和其互补的模板链在局部形成杂交链，由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，因此模板DNA双链之间互补的机会较少；延伸，在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的53的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板。每个循环可使目标DNA数量加倍。实际操作中，经过2030个循环，可使目标DNA增加106109。
