1、恶性肿瘤基因治疗恶性肿瘤基因治疗1.手术治疗2.放射治疗（简称放疗）3.化学药物治疗（简称化疗）基因治疗（基因治疗（gene gene tharapytharapy)4.生物治疗 靶向治疗 免疫治疗等基因治疗基因治疗恶性肿瘤治疗手段恶性肿瘤治疗手段 遗传物质遗传物质置换置换补充补充缺陷基因9Ex vivo Gene TherapyIn vivo Gene Therapy13(1)生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)：是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞、早期胚胎中）使其发育成正常个体。目前仅限于动物体内。(2)体细胞基因治疗(somatic cell g
2、ene therapy)：是指将正常基因转移到体细胞，或整合到染色体上，或独立于染色体外，使之表达基因产物，以达到治疗目的。（理想措施：靶细胞染色体特定座位基因转移，减少随机插入引起新的基因突变的可能性。）14n可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。n选择的原则：(1)便于从体内取出和回输；(2)便于在体外培养与增殖；(3)便于基因的高效转移；(4)能够持续表达目的基因。（腺苷脱氨酶缺乏症）（腺苷脱氨酶缺乏症）基因治疗的流程基因治疗的流程受体细胞（靶细胞）的培养受体细胞（靶细胞）的培养目的基因的选择与制备目的基因的选择与制备载体的选择载体的选择将目的基因导入靶细胞（导入方法的选
3、择）将目的基因导入靶细胞（导入方法的选择）转导细胞的筛选和鉴定转导细胞的筛选和鉴定基因治疗的安全性检测和和疗效评价基因治疗的安全性检测和和疗效评价2 非病毒（化学和物理方法）非病毒（化学和物理方法）3磷酸钙磷酸钙3脂质体脂质体3裸裸DNA（基因枪，水压法）（基因枪，水压法）配体配体/阳离子多聚物阳离子多聚物/DNA 复合物复合物优缺点优缺点低免疫原性低免疫原性.DNA大小无限制大小无限制低转染效率低转染效率.表达短暂表达短暂.2病毒病毒(复制缺陷病毒复制缺陷病毒)3逆转录病毒逆转录病毒3单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒3腺相关病毒腺相关病毒3腺病毒腺病毒转染效率高转染效率高可短暂或持久表达可短暂或持久
4、表达免疫原性较强免疫原性较强转基因大小有限转基因大小有限3慢病毒慢病毒3痘苗病毒痘苗病毒基因治疗的核心技术基因治疗的核心技术2324目前临床试验常见病毒载体的优缺点及应用目前临床试验常见病毒载体的优缺点及应用载体载体嗜性嗜性包装包装能力能力能否能否整合整合主要优点主要优点主要缺点主要缺点其他特征其他特征逆转录病毒逆转录病毒(REV)分裂分裂期细期细胞胞8 kb能能转基因可持久表转基因可持久表达达不能感染非分裂期细胞不能感染非分裂期细胞转基因表达会被沉默转基因表达会被沉默潜在插入突变及致瘤潜在插入突变及致瘤腺病毒（腺病毒（AV)广泛广泛8kb30kb否否基因转染能力高基因转染能力高包装能力增强包
5、装能力增强免疫原性减弱免疫原性减弱炎症反应强炎症反应强免疫反应强免疫反应强少量辅助病毒污染少量辅助病毒污染滴度高滴度高表达短暂表达短暂腺腺相关病毒相关病毒(AAV)广泛广泛4.5kb能能无炎症反应无炎症反应尚未报道有致病尚未报道有致病性性位点特异性整合位点特异性整合包装能力小包装能力小重组后不再维重组后不再维持位点特异性整持位点特异性整合合辅助病毒污染辅助病毒污染单纯疱疹单纯疱疹病毒病毒(HSV-1)广泛广泛30 kb150kb否否包装容量大包装容量大神经嗜性神经嗜性最大的包装容量最大的包装容量炎症反应强炎症反应强神经毒性神经毒性非复制型辅助病毒污染非复制型辅助病毒污染，必须去除，必须去除可在
6、非神经原可在非神经原细胞短暂表达细胞短暂表达慢病毒慢病毒(LV)广泛广泛8 kb能能转基因可持久表转基因可持久表达达可与其他逆转录病毒序可与其他逆转录病毒序列发生内源性重组回复产列发生内源性重组回复产生可复制型病毒。生可复制型病毒。潜在插入突变及致瘤潜在插入突变及致瘤炎症反应少炎症反应少痘苗痘苗病毒病毒(VV)广泛广泛25 kb否否包装容量大包装容量大尚未报道有致病尚未报道有致病性，预防接种经验性，预防接种经验多多限于肿瘤免疫治疗限于肿瘤免疫治疗生活周期快生活周期快生活周期全在生活周期全在胞浆完成胞浆完成高免疫原性高免疫原性Verma,Weitzman,Annu.Rev.Biochem.200
7、5以逆转录病毒为例：以逆转录病毒为例：27gagpolenv长末端重复序列调节和启动转录编码病毒核心蛋白编码逆转录酶编码病毒外壳和包膜蛋白包装信号病毒的基因组结构病毒的基因组结构去除致病性结构产生的空白区以目的基因取而代之保留插入标记基因指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系。包装细胞的特点：因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。感染其他感染其他细胞细胞逆转录病毒逆转录病毒宿主宿主细胞细胞病毒病毒RNARNAcDNAcDNA前前 病病 毒
8、毒病毒病毒RNARNA包装蛋白包装蛋白包装成完整的病毒包装成完整的病毒颗粒颗粒出芽分泌出芽分泌子代病毒子代病毒整整 合合假病毒颗粒假病毒颗粒被包装细胞产生病毒蛋白包装成病毒颗粒只有一次感染能力假病毒颗粒n1.env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，基因转移效率更高；n2.结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他部分的活性；n3.整合到靶细胞基因组，可长期表达；n4.包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，易于分离制备。Synthetic Vector非病毒载体基因转移的方法非病毒载体基因转移的方法脂质体脂质体 liposomes 脂质体介导的基因转移示意图 DNA(polyan
9、ion)PEI(polycation)+(Poly-L-lysine)(Polyethylenimine)Self assembled polyplexselfassemblyPEI（聚乙酰亚胺）：是一种具有高度分枝的阳离子多聚物。原理：利用阳离子多聚体的氨基基团的正电荷与DNA的磷酸基团的负电荷发生电性中和，使DNA缩合形成稳定的多聚物/DNA复合物，使DNA不易被核酸酶降解。非病毒载体的优化策略非病毒载体的优化策略n优点：优点：n缺点：缺点：目的基因转染效率低：主要是非病毒载体介导基因治疗需要克服3道屏障：细胞膜、内吞小泡-溶酶体系统、核膜。提高细胞对载体-基因复合物的摄取（如连接靶向配体
10、）促进载体基因复合物从内吞小泡-溶酶体释放(如加入流感病毒外壳蛋白血凝素HA20)提高目的基因的跨核膜转运（如加入核定位信号NLS）非病毒载体的优化策略非病毒载体的优化策略Polymer/DNALiposome/DNAAdeno-associated virus20-26 nm50-300nm50-150nmDNA/RNA脂质脂质配体配体脂质体脂质体逆转录病毒逆转录病毒脂双层脂双层靶向非病毒基因治疗载体靶向非病毒基因治疗载体VS靶向非病毒基因治疗载体靶向非病毒基因治疗载体内吞内吞内吞小体内吞小体 内吞释放内吞释放 入核入核内吞释放肽内吞释放肽包装多肽包装多肽核酸核酸配体配体腺病毒腺病毒靶向性多
11、聚物靶向性多聚物一一三、调节和增强机体的免疫功能三、调节和增强机体的免疫功能细胞因子基因导入免疫细胞基因修饰的树突状细胞分泌免疫毒素的T淋巴细胞肿瘤DNA疫苗基因增强或补充：基因增强或补充：TherapeuticGeneDefective CellsNormal Functioning Cellsn向靶细胞中导入靶细胞缺失的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。（如：siRNA,miRNA,ASTarget CellBlock expressionOf target gene基因干预基因干预(gene interference)(gene interference)：指采用特定的方式抑制某个
12、基因：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。目的。自杀基因治疗自杀基因治疗：恶性肿瘤基因治疗的方法之一。自杀基因又称药物酶转化基因或酶前药激活基因。Prodrug geneTreat with pro-drugCells Killed原理：原理：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。常用的自杀基因系统：tk-GCV系统（胸苷激酶基因-甘昔洛韦），CD-5-FC系统（胞嘧啶脱氨酶基
13、因-5-氟-胞嘧啶）自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制旁观者效应（旁观者效应（Bystander effectBystander effect）：用外源性自杀基因转染肿瘤细胞后，未能转染的肿瘤细胞可因邻近的少数肿瘤细胞携带有自杀基因而被前体药物杀伤。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。TK/GCV系统的旁观者效应是比较明显和突出的。肿瘤毒素肿瘤毒素基因基因Toxin geneCells are killed bythe expression of the toxin genen基因基因修饰肿瘤细胞修饰肿瘤细胞“疫苗疫苗”疗法疗法 将某些细胞因子基因如IL-2、
14、IL-4、TNF-、INF-、GM-CSF等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应;另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞的作用Cytokine GeneDefective CellsCytotoxic immunedestruction of cellsForeign Antigen GeneKilling of cells becauseOf enhanced immune respon
15、seBystander effect调节和增强机体的免疫功能调节和增强机体的免疫功能n将某些细胞因子（如IL-2、TNF-a等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，大幅度提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。使用细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用，副作用严重等缺点，疗效有较大幅度提高。n肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和共刺激信号表达不足，将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内;或者表达HLA、B7的病毒载体或质粒DNA与脂质复合物直接注射到瘤体内，以大幅度增强肿瘤
16、细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应而提高宿主的免疫监视功能和对肿瘤细胞的攻击能力，达到治愈率的提高具有积极作用。定义：定义：溶瘤病毒（溶瘤病毒（oncolyticvirus,Ovs）是一类具有肿瘤杀伤效应的条件复制型条件复制型病毒。这类病毒能够在肿瘤细胞中特异性复制，通过病毒扩增，裂解、杀伤肿瘤细胞，产生的子代病毒又能感染周围的肿瘤细胞，产生级联效应，而其在正常细胞中不能复制。（选择性感染肿瘤细胞）溶瘤病毒的研究已有很长的历史：溶瘤病毒的研究已有很长的历史：1904年就有关于白血病患者感染流感病毒后病情意外好转的病历记载。1911年，意大利一位医生为颈部肿瘤患者注射了狂犬活疫苗后
17、，肿瘤缩小。1911年，Martuza等在science发表文章：转基因HSV对治疗恶性胶质瘤有一定效果。目前已有众多病毒被开发为溶瘤病毒：目前已有众多病毒被开发为溶瘤病毒：DNA 病毒:腺病毒,单纯疱疹病毒.RNA 病毒:呼肠孤病毒,可复制逆转录病毒，新城疫病毒，麻疹病毒，水泡性口炎病毒目前溶瘤病毒的研究主要面临的问题：目前溶瘤病毒的研究主要面临的问题：安全性与溶瘤效率。溶瘤效率又主要由病毒对肿瘤细胞的毒力和靶向性两者决定。安全性与溶瘤效率。溶瘤效率又主要由病毒对肿瘤细胞的毒力和靶向性两者决定。中山大学颜光美团队发现中山大学颜光美团队发现M1天然病毒能精确杀灭癌细胞。天然病毒能精确杀灭癌细胞
18、。（Identification and characterization of alphavirus M1 as a selective oncolytic virus targeting ZAP-defective human cancers.Proc Natl Acad Sci U S A.2014,111(42):E4504-12.）。作者从中国海南岛分离得到一种M1的天然病毒。研究发现，M1病毒能选择性地感染并杀死包括肝癌、结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤在内的多种癌细胞，而对正常细胞无毒副作用。整体动物模型证明，M1病毒“像长了眼睛一样准确找到肿瘤组织并将其杀灭”，正常器官则不受影响。文
19、章提到M1病毒靶向肿瘤细胞最重要的一点是需要肿瘤细胞锌指抗病毒蛋白ZAP(zinc-finger antiviral protein)缺陷。而文章中也提到只有69%的肝癌组织、52%结肠癌组织、61%的膀胱癌组织表现出ZAP低水平。这就很难保证其在患者体内高度的靶向性，治疗效果也就大大折扣。http:/www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/http:/www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/19991999年年“杰辛格杰辛格”基因疗法基因疗法失败失败.1818岁的泽西岁的泽西杰辛格患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶杰辛格患有鸟氨酸氨甲
20、酰基转移酶(OTC)(OTC)缺失症，接受基因疗法后意外死亡。缺失症，接受基因疗法后意外死亡。A:small molecular inhibitorBedside to Bench百泰生物药业有限公司B:Monoclonal antibodiesBedside to Bench已授权专利：已授权专利：ZL200410017334.6 已经转让给广州朗圣药业已经转让给广州朗圣药业Int J Pharm,2008 基因治疗在罕见疾病临床试验中取得的新进展基因治疗在罕见疾病临床试验中取得的新进展胡务亮博士胡务亮博士Science子刊基因治疗新突破子刊基因治疗新突破 利用佛罗里达大学研究人员首创的基因
21、转移技术，近期台湾的学者成功地恢复了四名罹患一种罕见的、致命性的神经系统疾病致命性的神经系统疾病儿童的一些运动能力。这一首次在人体获得成功的试验成果或有可能帮助到诸如帕金森氏症等更为常见的疾病的患者。Science医学周刊：基因治疗失明再传捷报医学周刊：基因治疗失明再传捷报 来自美国宾夕法尼亚大学医学院费城儿童医院的科学家们在对3名先天性失先天性失明患者明患者的基因治疗试验中获得令人鼓舞的实验结果，他们利用腺相关病毒（AAV）载体将RPE65基因注入患者体内，初期数据表明基因治疗不仅安全，而且显示了良好的治疗效果。新英格兰医学：血友病基因治疗突破性成果新英格兰医学：血友病基因治疗突破性成果 来
22、自英国伦敦大学学院的研究人员在B型血友病型血友病的基因治疗临床试验中取得了突破性的进展，他们利用腺相关病毒（AAV）载体将表达FIX的DNA注入患者体内取了令人鼓舞的临床实验结果。Nature新闻：新闻：基因治疗有望治疗帕金森病基因治疗有望治疗帕金森病 来自柳叶刀神经病学（Lancet Neurology）上的一份报道称一项帕金帕金森病森病（Parkinsons disease）的基因治疗试验改善了少数患者的运动障碍，直到目前还没有出现任何的安全问题。这是科学家们针对帕金森病展开的第一个双盲临床试验，显示了基因治疗在神经系统变性疾病中的应用潜力。Nature新闻：基因治疗有望治愈艾滋病新闻：基因治疗有望治愈艾滋病 来自Nature官方网站的最新消息，科学家们首次利用一种特异性靶向单基因的方法在对艾滋病感染者的临床治疗试验中取得了成功。在美国马萨诸塞州波士顿召开的逆转录病毒和机会感染会议上的一份报告称在这项基于锌指核酸酶技术的治疗测试中几位接受治疗的HIV感染者免疫细胞的数量表现出显著地增多。
