1、第1页，共67页。教程目录 第一章 病理常规操作 第二章 样本前处理（申请单填写、标本类型、标本评估及登记等）第三章 样本预处理（DNA、RNA提取及质量评估）第四章 基因操作（测序、片段分析及Q-PCR）第五章 结果解读及诊断报告出具 第六章 资料汇总，资料库建立第2页，共67页。第一章 病理常规操作 1.病理样本的接收 2.组织固定 3.取材 4.包埋 5.组织石蜡切片 6.HE染色第3页，共67页。1.病理样本的接收1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜
2、所取的小标本，4中性甲醛(10中性福尔马林)固定组织的量应在610倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。第4页，共67页。2.组织固定 临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。添加的量应610倍于标本体积.第5页，共67页。3.取材及其后期处理 病理科病理医生取材 核对标本及其标
3、志与申请单是否一致。按照病理取材规范选取病变及正常组织。对送检标本进行大体描述。取材后的标本保存至少两周。放入自动脱水机进行水洗脱水透明浸蜡前处理。第6页，共67页。4.包埋 先将熔化的石蜡倾入模具，再用加热的镊子夹取已经浸蜡的组织块，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蜡。注意标本的编号和标本要对准，防止污染。为下一步切片准备，提供介质。第7页，共67页。5.切片 刀片锋利，组织块预冷。切5-10um的连续组织切片，置于玻片上。捞片，烘干。第8页，共67页。6.HE染色 苏木素伊红染色。苏木素染细胞核（核酸），伊红染细胞质（蛋白），使组织细胞对比清晰，便于显微镜下观察。主要流程：二甲苯脱蜡梯
4、度酒精脱二甲苯苏木素染色分化、返蓝伊红梯度酒精、二甲苯封片。临床技术操作规范病理学分册 2004年第1版第9页，共67页。第二章 标本前处理 一、申请单填写1、登记患者基本情况，包括姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、病理诊断、标本病理号等2、患者签署知情同意书，留下联系方式3、患者病史及临床情况第10页，共67页。患者病史及临床情况登记事项 有无手术（穿刺标本）手术时间 术前术后有无化疗，化疗方案及化疗效果及毒副作用（相关血项指标、胃肠反应、皮肤反应、神经反应等），治疗的单位。癌症有无转移，复发或者不能切除 相关病史及家族史第11页，共67页。第12页，共6
5、7页。第13页，共67页。送检标本种类：外周全血；胸腹水；痰；尿 新鲜(冰冻)标本；内镜活检标本；手术标本蜡块或切片 新鲜标本用10%中性福尔马林固定或用RNAlater浸泡20分钟以上（常温可保存10天）外借病理蜡块，常规病理大小即可 常规石蜡切片（10张白片），5-10um，常温送检送检标本要求：第14页，共67页。样本评估 血：保存温度、时间，是否凝固 胸腹水、尿及痰：涂片HE染色观察结果是否有癌细胞 蜡块或白片：组织保存时间、福尔马林固定时间、组织大小、有无癌细胞第15页，共67页。将申请单登记入册 登记基因检测申请号、姓名、送检单位、病理号、检测项目第16页，共67页。肿瘤个体化治疗
6、基因检测项目检测项目检测项目涉及肿瘤涉及肿瘤预测内容预测内容样本类型样本类型EGFR突变突变外显子18,19,21,(CA)n非小细胞肺癌、食道癌、头颈肿瘤等预测吉非替尼（易瑞沙）、厄罗替尼（特罗凯）石蜡白片或胸水300mL外显子20(T790M)K-ras突突变变密码子12,13,61肠癌、肺癌、胃癌、甲状腺癌预测西妥昔单抗（爱比妥）、帕尼单抗（维克替比）疗效，甲状腺癌辅助诊断石蜡白片BRAF突变突变V600EC-kit突变突变外显子9,11,17胃肠间质瘤、肉瘤预测伊马替尼（格列卫）疗效石蜡白片PDGF突突变变外显子14、18第17页，共67页。肿瘤个体化治疗基因检测项目检测项目检测项目涉
7、及肿瘤涉及肿瘤预测内容预测内容样本类型样本类型JAK-2 突变突变外显子 12，14真性红细胞增多症，原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症辅助临床诊断2mL抗凝血或骨髓活检预测化疗和干扰素疗效ABL突变突变酪氨酸激酶区点突变髓细胞白血病预测伊马替尼（格列卫）疗效2mL抗凝血或骨髓活检Her-2/CEP17FISH乳腺癌、胃癌乳头状癌诊断石蜡白片预测曲妥珠单抗（赫赛汀）疗效VEGF/-actinVEGFR/-actinmRNA表达量肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肾癌预测贝伐单抗（阿瓦斯丁）疗效石蜡白片+2mL抗凝血第18页，共67页。肿瘤个体化治疗基因检测项目检测项目检测项目涉及肿瘤涉及肿瘤预测内容
8、预测内容样本类型样本类型ERCC1/-actinmRNA表达量肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、胆囊癌预测铂类疗效石蜡白片+2mL抗凝血预测铂类疗效BRCA1/-actinmRNA表达量紫杉醇类和长春碱类药物疗效RRM1/-actinmRNA表达量肺癌、胰腺癌、胆管癌预测吉西他滨疗效石蜡白片+2mL抗凝血TS/-actinmRNA表达量胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、预测氟尿嘧啶类药物疗效石蜡白片+2mL抗凝血肺癌预测培美曲塞疗效第19页，共67页。肿瘤个体化治疗基因检测项目检测项目检测项目涉及肿瘤涉及肿瘤预测内容预测内容样本类型样本类型TOP-A/CEP17FISH/mRNA表达量
9、乳腺癌预测蒽环类药物疗效石蜡白片+2mL抗凝血预测蒽环类药物毒性UGT1A1启动子区多态性肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌预测伊立替康毒性第20页，共67页。第21页，共67页。石蜡白片前处理1.烤片（90-95，0.5小时）2.脱蜡（过夜，最后一缸换新二甲苯）3.HE染色4.镜下区分选择肿瘤组织4.刮片5.消化肿瘤组织（200lTL+20lOB酶，552-3h消化时间视具体情况定）第三章 基因检测前处理第22页，共67页。HE染色结果第23页，共67页。第24页，共67页。DNA的提取 1.血DNA的提取 2.石蜡组织DNA的提取第25页，共67页。血液DNA提取 250l抗凝血加入250l Buf
10、fer BL和25l OB酶，70孵育15分钟。加入260l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l 70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。Omega Blood DNA kit protocol第26页，共67页。石蜡DNA提取 在
11、消化充分的组织中加入220l BUffer BL，震荡混合，于70孵育。加入220l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。Omega Tissuse DNA kit protocol第27页，共
12、67页。电泳图第28页，共67页。RNA的提取 1.石蜡组织RNA的提取 2.血RNA的提取 （化疗后需1200微升血白细胞太少）第29页，共67页。1.石蜡组织RNA的提取RNAlater样本处理另注加入250lbufferPKD和10l的蛋白酶K,涡旋混匀后，55C孵育2-3h，80C15min。然后加入500l的bufferRBC，充分混匀。将溶液转入gDNA Eliminator spin柱内，10000g离心30s，吸取收集管内液体至新的离心管，重复操作直至溶液都过滤收集柱。在溶液内加入1200l无水乙醇，混匀，将溶液转入RNeasy MinElute spin柱内，10000g离心
13、15s，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE，10000g离心15min，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE,10000g离心2min。小心将柱取出，放入一新的收集管内，最大速度离心5min（将柱盖打开）将柱放入1.5ml收集管内，加入40-60l无Rnase酶水，盖上盖子，室温放置2min，最大速度离心1min洗脱RNA.Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol第30页，共67页。2.血RNA的提取300l全血+1500l 1 buffer ERL（150l 10 ERL+1350l H2O）混匀。同时做3管。冰上孵育10min，至
14、半透明。450g 4，10min，弃上清。600l 1 buffer ERL混匀，洗涤细胞。洗涤后合并3管液体。450g 4，10min，弃上清。600l TRK裂解液+12l-巯基乙醇吹打混匀（可以暂时-70冻存）。加等体积70%乙醇，吹打混匀。将液体转入HiBind RNA提取柱内（2.1:核酸降解 1.6:蛋白质污染第32页，共67页。第四章 基因操作DNA提取测序反应上机测序及结果分析PCR扩增电泳检验电泳检验，PCR产物纯化测序产物纯化第33页，共67页。PCR扩增（以K-ras为例）反应体系为：10buffer dNTP(2mM)Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F（
15、10M）Primer-R（10M）H2O 2l 2l0.75l0.25l1l0.4l0.4l13.2lTotal 20l第34页，共67页。PCR反应条件：置PCR扩增仪中95预变性15min，用TouchdownPCR，94变性50秒，63-58退火1分钟，72延伸1分钟，共循环10次，94变性50秒，57退火1分钟，72延伸1分钟，共循环30次，最后于72延伸10分钟。第35页，共67页。电泳图 用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。第36页，共67页。PCR产物纯化 1.加100lPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。
16、2.弃收集管内液体，加700lwashing buffer，12000rpm离心2min。3.弃收集管内液体，加400lwashing buffer，12000rpm离心2min。4.弃收集管内液体，12000rpm离心2min。5.柱内加30l70C预热洗脱液，12000rpm离心2min。第37页，共67页。测序反应（以K-ras为例）反应体系为：BigDye（2.5X）0.8l BigDyeSeqBuffer（5X）1.6 l Primer 0.3lPCR纯化产物 1lddH2O 6.3lTotal 10l第38页，共67页。测序产物纯化 1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaA
17、c（3M）到管里。2.每管加100l100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。3.10C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。4.每管加100l70%酒精，5C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。5.37C;30min挥发净酒精，加10l Hi-Di溶解DNA。6.95C；变性5min，4C；4min，加样上机。第39页，共67页。片段分析操作PCR扩增加LIZ、HIDI混合变性上机测序及结果分析避光第40页，共67页。步骤 1多重荧光PCR：15lPCRmix五种（胃肠）或七种（尿）引物0.8l（其中D17S283加1.2l
18、）1lDNA.条件：95 C15min，94 C1min，56 C1min，72 C1min，30个cycle.lPCR产物0.4lLIZ size standard+8l HiDi,95 C 5min,4C冰冷5min。上机，分析数据。第41页，共67页。Q-PCR操作RNA提取Q-PCR仪扩增结果分析RT分光光度计评估质量第42页，共67页。详细步骤 1.RT反应:gDNA1l+RNA 6l；上机42C，2min；离心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，Primer 0.5l；上机A64程序。2.Q-PCR仪扩增 （反应体系）2SYBR 2.5l Primer 1(5uM)0.5l
19、Primer 2(5uM)0.5lRT产物 1 lNuclease-free water 1l Total 5l第43页，共67页。7900PCR仪反应程序 95C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。RQ Manager 1.2软件分析实验数据。第44页，共67页。第五章 结果解读及诊断报告出具 基因测序结果分析 RNA表达量结果分析第45页，共67页。测序结果图及分析 ABI3100测序仪测序，SeqScape v2.0分析结果为。以K-ras和EGFR为例第46页，共67页。K-RAS 基因测序突变类型基因测序突变类型 K-ras:K2第12（GGT),13密码
20、子（GGC）K3第61（CAA）密码子共9种突变类型：GGT-GAT G12DGGT-GTT G12VGGC-GAC G13DGGT-TGT G12CGGT-GCT G12AGGT-AGT G12SGGT-CGT G12RGGC-TGC G13CGGC-GCC G13AGGC-GTC G13V7种种 98%3种种 2%第47页，共67页。第48页，共67页。第49页，共67页。第50页，共67页。EGFR基因测序突变类型：EGFR 第18,19,20,21外显子和第一内含子（CA）EGFR 19:容易发生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n16，EGFR非突变NSCL
21、C患者服用TKI类药物具有短期疗效 EGFR 20:T790M 突变会使患者对EGFR-TKI 类药物产生耐药第51页，共67页。EGFR18测序图第52页，共67页。EGFR19测序图第53页，共67页。EGFR20测序图第54页，共67页。EGFR21测序图第55页，共67页。EGFR intron 1测序图第56页，共67页。第57页，共67页。RNA表达量结果图及分析 使用仪器为：ABI7900荧光定量PCR仪，分析软件为：RQ Manager 1.2第58页，共67页。ERCC1ERCC1血液石蜡组织第59页，共67页。BRCA1BRCA1血液石蜡组织第60页，共67页。RRm1RRm1血液石蜡组织第61页，共67页。VEGFVEGF血液石蜡组织第62页，共67页。血液石蜡组织TSTS第63页，共67页。第64页，共67页。第65页，共67页。第六章 资料汇总，资料库建立 将申请单，诊断报告按基因申请号装订成册 按申请项目汇总电子版诊断报告，详细记录病人资料，做患者后续随访纪录治疗效果。统计总数，计算突变率，统计突变类型。可做纵向质控。方便后续资料检索查阅第66页，共67页。第67页，共67页。
