1、第十章第十章 吸光光度法吸光光度法SpectrophotometrySpectrophotometry分析化学分析化学 基本内容及重点要求基本内容及重点要求v 了解光的特点和性质；了解光的特点和性质；v 熟练掌握光吸收的基本定律；熟练掌握光吸收的基本定律；v 理解引起误差的原因。理解引起误差的原因。v 了解比色和分光光度法及其仪器；了解比色和分光光度法及其仪器；v 掌握显色反应及其影响因素。掌握显色反应及其影响因素。v 熟练掌握光度测量和测量条件的选择。熟练掌握光度测量和测量条件的选择。v 掌握吸光光度法测定弱酸的离解常数、络合物络合比的测掌握吸光光度法测定弱酸的离解常数、络合物络合比的测定、
2、示差分光光度法和双波长分光光度法等应用。定、示差分光光度法和双波长分光光度法等应用。10-1 物物质对光的选择性吸收质对光的选择性吸收10-2 光光吸收的基本定律吸收的基本定律10-3 吸吸光光度法的仪器光光度法的仪器10-4 吸光光度法分析条件的选择吸光光度法分析条件的选择本章提纲本章提纲概述概述v 方法原理：方法原理：吸吸光光度光光度法是法是一种基于物质对光的选择性吸收而建一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。立起来的一种分析方法。v 分类：分类：包括比色法、可包括比色法、可见吸光光度法、紫外见吸光光度法、紫外-可见吸光光可见吸光光度法和红外光谱法度法和红外光谱法等。等。比
3、色分析法：比色分析法：通过目视比较颜色的深浅来测定物质的通过目视比较颜色的深浅来测定物质的浓度。浓度。吸光光度法：吸光光度法：使用光度计测定的方法。使用光度计测定的方法。吸光光度法特点吸光光度法特点(一一)灵敏度高灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下限吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度最低浓度)一般可一般可达达110110-3-3%的微量组分。对固体试样一般可测到的微量组分。对固体试样一般可测到1010-4-4%。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-21-2个数量级。个数量级。(二二)操作简便，测定速度快操作简便，测定速度快(三三)准
4、确度较高准确度较高 一般吸光光度法的相对误差为一般吸光光度法的相对误差为25%25%，其准确度虽不，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，但对微量成分来说，还是比较满如滴定分析法及重量法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。确了，甚至无法进行测定。(四四)应用广泛应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。地用吸光光度法进行测定。吸光光度法特吸光光度法特点点一、光的基本性质一、光的基本性质二、物质对光的选择
5、性吸收二、物质对光的选择性吸收（一）（一）物质的颜色与吸收光的关系物质的颜色与吸收光的关系（二）（二）物质对光产生选择性吸收和原因物质对光产生选择性吸收和原因（三）三）吸收曲线吸收曲线 一、光的基本性质一、光的基本性质-110scm 103 -Hz-nm-光光速速，真真空空中中频频率率，为为单单位位以以波波长长，在在紫紫外外可可见见区区cc sJ106.625-Plank-J-34-常常数数，光光子子的的能能量量，hEchhE 电磁波谱图电磁波谱图波长波长/nm10-1 1 10 102 400 760 103 104 105 106 107 108光谱名光谱名称称X射线射线紫外光紫外光可见光
6、可见光红外光红外光微波微波跃迁类跃迁类型型内层电子内层电子中层、外中层、外层电子层电子外层电子外层电子分子振动或转分子振动或转动动分子转动分子转动分析方分析方法法X射线光射线光谱法谱法紫外光度紫外光度法法比色及可见光比色及可见光度法度法红外光谱法红外光谱法微波光谱微波光谱法法UltravioletVisible Spectrophotometry单色光与复合光单色光与复合光v单色光：具有同一波长的光单色光：具有同一波长的光v复合光：不同波长组成的光复合光：不同波长组成的光v可见光可见光:波长大约在波长大约在400400760nm760nm之间，由红、橙、黄、绿、之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、
7、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。定的波长范围。互补色光互补色光v如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光。组成白光，这两种色光称为互补色光。光的互补光的互补v对固体物质对固体物质 当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完
8、如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。光的互补光的互补v对溶液对溶液溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子分子或离子)选选择性的吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的光透过择性的吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度
9、相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长程度相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如：硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；高例如：硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。二、物质对光的选择性吸收二、物质对光的选择性吸收 v如如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处，则什
10、果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处，则什么颜色也看不到。可见物质呈现的颜色与光有着密切的关系，么颜色也看不到。可见物质呈现的颜色与光有着密切的关系，一种物质呈现何种颜色，是与光的组成和物质本身的结构有一种物质呈现何种颜色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。关的。（一）物质的颜色与吸收光的关系（一）物质的颜色与吸收光的关系白光KMnO4紫色物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色物质颜色吸收光吸收光颜色颜色波长范围波长范围/nm黄绿黄绿紫紫400450黄黄蓝蓝450480橙橙绿蓝绿蓝480490红红蓝绿蓝绿490500紫红紫红绿绿500560紫紫黄绿黄绿560580蓝蓝
11、黄黄580600绿蓝绿蓝橙橙600650蓝绿蓝绿红红650750（二）物（二）物质对光产生选择性吸收和质对光产生选择性吸收和原因原因AV43210V43210BJ420双原子分子能级示意图双原子分子能级示意图 任何任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度是不相等一种溶液对不同波长的光的吸收程度是不相等的。的。v 吸收光谱曲线（光吸收曲线）：吸收光谱曲线（光吸收曲线）：如果如果将某种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶将某种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，
12、叫做吸收光谱曲线或以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光谱曲线或光吸收曲光吸收曲线。线。它它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。情况。（三）吸收曲线（三）吸收曲线图图10-2 KMnO10-2 KMnO4 4溶液的吸收曲线溶液的吸收曲线(c(cKMnO4KMnO4:abcd):abcd)从图从图102可以看出，可以看出，在可见光范围内，在可见光范围内，KMnO4溶液对波长溶液对波长525nm附近的绿色光附近的绿色光有最大吸收，而对紫有最大吸收，而对紫色和红色光则吸收很色和红色光则吸收很少。少。v 最大吸收波长：最大吸收波长：光光吸收程度最大处的波
13、长，称为最大吸收波长，常用吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长，常用最大最大或或max表示表示.任何任何可见光区内、溶液的颜色主要是由这个数值决定的。可见光区内、溶液的颜色主要是由这个数值决定的。在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波长在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波长也是固定不变的，说明光的吸收与溶液中物质的结构有关。也是固定不变的，说明光的吸收与溶液中物质的结构有关。（三）吸收曲线（三）吸收曲线一一、朗伯、朗伯-比耳定律比耳定律（一）朗伯一）朗伯-比耳定律的推导比耳定律的推导 朗朗伯伯(Lambert)和比耳和比耳(beer)分别于分别于1760年和年和1852
14、年研究年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶液浓度的定量关系，了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。奠定了分光光度分析法的理论基础。当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被介质吸体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被介质吸收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。如果收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。如果入射光的强度为入射光的强度为I0，吸收光的强度为，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为，透过光的强度为It,反射光的强度为反射光的强度
15、为Ir则它们之间的关系为则它们之间的关系为 I0Ir+Ia+It I0IrIaIt（一）朗伯（一）朗伯-比耳定律的推导比耳定律的推导I0Ir+Ia+It 在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相同材质的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上同材质的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不变的是不变的(一般约为入射光强度的一般约为入射光强度的4)其影响可以其影响可以互相抵消，于是可以简化为互相抵消，于是可以简化为 I0It+IaI0IrIaIt 纯水对于可见光的吸收极微，故纯水对于可见光的吸收极微，故有色液对光的吸收完有色液对光的吸收完全是由溶液中的有色质点
16、造成的。全是由溶液中的有色质点造成的。当入射光的强度当入射光的强度I0一定时，如果一定时，如果Ia越大，越大，It就越小，即就越小，即透过光的强度越小，表明有色溶液对光的吸收程度就越透过光的强度越小，表明有色溶液对光的吸收程度就越大。大。v 实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液的浓实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。如果保度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的浓度和液持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的浓度和液层的厚度有关。层的厚度有关。I0It+Ia 1.朗伯定律朗伯定律 -dIt
17、=k1 I0 db log I0/It=K1b 2.比耳定律比耳定律 -dIt=k2 I0 dc log I0/It=K2c3.朗伯朗伯-比耳定律比耳定律如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯收，则上述两个定律可合并为朗伯-比耳定律，即得到：比耳定律，即得到：log I0/It=Kbc 令：令：A=log I0/It 则：则：A=KbC 此式为此式为光吸收定律的数学表达式光吸收定律的数学表达式。式中式中A称为吸光度，称为吸光度，K是比例常数，与入射光的波长、物质的性质和是比例常数，与
18、入射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因素有关。溶液的温度等因素有关。It/I0称为称为透光率透光率，用，用T表示。它与表示。它与A的关系为：的关系为：A=1/T=-Tv 透光率透光率T与吸光度与吸光度A的关系的关系AttTTTIIAIIT 10lg1lglg00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T%1.0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 0 A透光率或透光率或透射比透射比吸光度吸光度1.吸收系数吸收系数 (1)吸光系数吸光系数a 当当c的单位为的单位为g/L，b的单位为的单位为cm时时,K用用a表示，称为表示，称为吸吸光系数
19、光系数，其单位为，其单位为L/gcm，这时朗伯，这时朗伯-比耳定律变为：比耳定律变为：Aabc （二）吸收系数和桑德尔灵敏度（二）吸收系数和桑德尔灵敏度(2)摩尔吸收系数摩尔吸收系数v 当式中浓度当式中浓度c的单位为的单位为mol/L，液层厚度的单位为，液层厚度的单位为cm时，时，则用另一符号则用另一符号表示，称为摩尔吸收系数，它表示，称为摩尔吸收系数，它表示物质的表示物质的浓度为浓度为1mol/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度时，溶液的吸光度。其单。其单位为位为L/molcm。这时朗伯。这时朗伯-比耳定律就变为比耳定律就变为:Abc v 在分光光度分析实践中在分光光度分析实践
20、中,我们不能直接取我们不能直接取1mol/L这样高这样高浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数值，而是在适宜的浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数值，而是在适宜的低浓度时测定吸光度，然后低浓度时测定吸光度，然后通过计算求得通过计算求得值值。摩尔吸收系数摩尔吸收系数(或或)（1）是是吸光物质在特定波长和溶剂情况下的一个特征常数，吸光物质在特定波长和溶剂情况下的一个特征常数，数值上等于数值上等于1 molL-1吸光物质在吸光物质在1 cm光程中的光程中的A。（2）影响影响值值的因素：的因素：内因内因 吸吸光物质分子结构；光物质分子结构；外因外因入射光波长；入射光波长；（3）是是吸光物质吸光能力吸光物质吸光能
21、力的量度的量度.值值愈大，方法灵敏度愈高。愈大，方法灵敏度愈高。物理意义KbcA abcA cg L-1bcma=A/(b c)，Lg-1cm-1bcA c mol L1bcm =A/(b c)，Lmol-1cm-1v吸光系数吸光系数a a：v摩尔吸光系数摩尔吸光系数 ：v二者关系：二者关系：M aM a吸光系数与摩尔吸收系数吸光系数与摩尔吸收系数v灵敏度的判断灵敏度的判断 通常，在通常，在max处：处：105 超高灵敏的方法超高灵敏的方法 （610）104 高灵敏的方法高灵敏的方法 （26）104 中灵敏的方法中灵敏的方法 2 104 不灵敏的方法不灵敏的方法 例例:二乙基胺二硫代甲酸钠二乙
22、基胺二硫代甲酸钠(铜试剂，铜试剂，DDTC)光度法测铜光度法测铜，436=12800 Lmol-1cm-1；双双硫腙光度法测铜，硫腙光度法测铜，495158000 Lmol-1cm-1，灵敏度谁较高？灵敏度谁较高？例例1：铁（：铁（）浓度为）浓度为5.010-4 gL-1的溶液的溶液,与与1,10-邻二氮邻二氮杂菲反应杂菲反应,生成橙红色络合物生成橙红色络合物.该络合物在波长该络合物在波长508 nm,比比色皿厚度为色皿厚度为2cm时时,测得测得A=0.190。计算。计算1,10-邻二氮杂菲邻二氮杂菲亚铁的亚铁的a及及。(已知铁的相对原子质量为已知铁的相对原子质量为55.85)解：根据比耳定律
23、解：根据比耳定律 A=a b c 得：得：a=A/b c=0.190/(25.010-4)=190 Lg-1cm-1 =M a=55.85190=1.1104 Lmol-1cm-1 吸吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数表示外，还常表示外，还常用桑德尔灵敏度用桑德尔灵敏度S表示。表示。v 定定义：义：当光度仪器的检测极限为当光度仪器的检测极限为A=0.001时，单位截面积时，单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量（光程内所能检出的吸光物质的最低质量（gcm-2）。）。v 由由桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度S的定义可得到：的定义可得到：A=0.001=bc=cmmm
24、oLcm-3=mmoLcm-2 2.桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度v摩尔吸光系数摩尔吸光系数k 与桑德尔灵敏度与桑德尔灵敏度S的关系的关系MMbcMbcMS33610001.0101010001 即：即：S=M/可见，某物质的摩尔吸光系数可见，某物质的摩尔吸光系数k越大，其桑德尔灵敏越大，其桑德尔灵敏度度S越小，即该测定方法的灵敏度越高。越小，即该测定方法的灵敏度越高。=0.001/(mmoLcm-2)=0.001M/(mgcm-2 )=M/S 3.标准曲线的绘制标准曲线的绘制及应用及应用 v标准曲线：标准曲线：配配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定条制一系列已知浓度的标准溶液，在一定条件下进行测定
25、。然后以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标件下进行测定。然后以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得到一条标准曲线，也称做工作作图，得到一条标准曲线，也称做工作曲线。曲线。曲曲线的斜率为线的斜率为b，由此可得到摩尔吸收系数，由此可得到摩尔吸收系数；也也可根据未知液的可根据未知液的Ax,在在标准曲线上查出未知液的浓度标准曲线上查出未知液的浓度cx。二、引起偏离朗伯二、引起偏离朗伯-比耳定律的原因比耳定律的原因v 据据bc=Kc AC，作图，作图，应应得到一得到一过原点过原点的的直线，直线，v 在实际中，常发现标准在实际中，常发现标准曲线曲线不成直线，这种不成直线，这种情情况称况称偏离朗伯偏离朗伯-比
26、耳定律。比耳定律。(一一)物理因素物理因素1.单色光不纯所引起的偏离单色光不纯所引起的偏离 严格严格地讲，朗伯地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色光才成立。比耳定律只对一定波长的单色光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得到的入射光并非纯的但在实际工作中，目前用各种方法得到的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围的单色光。那么，在这种单色光，而是具有一定波长范围的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。二、引起偏离朗伯二、引起偏离朗伯-比耳定律的原比耳定律的原因因
27、2.非平行入射光引起的偏离非平行入射光引起的偏离 非非平行入射光将导致光束的平均光平行入射光将导致光束的平均光程程b大大于吸收池于吸收池的厚的厚度度b，实际测得的吸光度将大于理论，实际测得的吸光度将大于理论值。值。3介质不均匀性引起的偏离介质不均匀性引起的偏离 朗朗伯伯-比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律、比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。在这种情况光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。在这种情况下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多
28、，必然要导致对下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，必然要导致对朗伯朗伯-比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。（二）（二）化学因素化学因素1溶液浓度过高引起的偏离溶液浓度过高引起的偏离 朗朗伯伯-比耳定律是建立在吸光质点之间没有相互作用的比耳定律是建立在吸光质点之间没有相互作用的前提下。但当溶液浓度较高时，吸光物质的分子或离子间的前提下。但当溶液浓度较高时，吸光物质的分子或离子间的平均距离减小，从而改变物质对光的吸收能力，即平均距离减小，从而改变物质对光的吸收能力，即改变物质改变物质的摩尔吸收系数的摩尔吸收系数。浓度增加，相互作用增强，导致在高浓度。浓度增加，相互作用增强，导致在高浓度范围内摩尔吸
29、收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线性关范围内摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线性关系被破坏。系被破坏。2.化学变化所引起的偏离化学变化所引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或在溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等，从而光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度破坏了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系之间的正比关系，也就破坏了吸光度，也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线与分析浓度之间的线性关系。产生对朗伯性关系。产生对朗伯-比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。（二）化学因素（二）化学因素一一、基本部件、基本部件v 一一般由光源、
30、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统等五部分组成。和信号显示系统等五部分组成。（一（一）光源）光源 常用常用的光源为的光源为612伏低压钨伏低压钨丝灯丝灯(卤钨灯）卤钨灯）.作用：提供所需波长范围内的连续光源。作用：提供所需波长范围内的连续光源。要求：足够的强度、稳定（要求：足够的强度、稳定（I 0)A=lg(I0/I)种类：种类：W 320800nm的连续光谱的连续光谱（二）单色器（分光（二）单色器（分光系统）系统）作用作用:从光源发出的复合光中分出所需要的从光源发出的复合光中分出所需要的(最容易被样液最容易被样液吸收的吸收的)单色
31、光。单色光。要求：足够的分辨力要求：足够的分辨力 种类：滤光片、棱镜、光栅种类：滤光片、棱镜、光栅 组成：通常由由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦镜和组成：通常由由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦镜和出射缝组成。出射缝组成。（二）单色器（分光系统）（二）单色器（分光系统）滤光片：滤光片：组成组成-由由有色玻璃片制成；有色玻璃片制成；特点特点 只允许和它颜色相同的光通过；只允许和它颜色相同的光通过；选用选用具滤具滤光片最易透过的光应是有色溶液最容易光片最易透过的光应是有色溶液最容易吸收吸收的光（即溶液颜色的互补色）的光（即溶液颜色的互补色）例：测例：测CuSO4(蓝）溶液，选什么滤光片？蓝）溶液
32、，选什么滤光片？答：因答：因CuSO4(蓝）最易吸收黄光，故，选黄色滤光片。蓝）最易吸收黄光，故，选黄色滤光片。（三）吸收池（比色（三）吸收池（比色皿）皿）比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的。大多数比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的。大多数比色皿为长方形，也有圆柱形的。一般厚度为比色皿为长方形，也有圆柱形的。一般厚度为0.5、1、2和和3厘米。厘米。（四）检测系统（四）检测系统(又叫光电转化又叫光电转化器器)在光度计中，常用的是硒光电池。晒光电池和眼睛相在光度计中，常用的是硒光电池。晒光电池和眼睛相似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于
33、波长为波长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则不能应用。不能应用。光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。（五）信号（五）信号显示系统显示系统 早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等。自动记录仪等。现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及数据处理台示波器及数据处理台等。等。悬镜式检
34、流计悬镜式检流计:测量测量光电流的检流计常用悬镜式检流计光电流的检流计常用悬镜式检流计(也称作直流复射式检流计也称作直流复射式检流计)，其灵敏度可达，其灵敏度可达10-9安培格。安培格。为了保护检流计，使用中要防止震动或大电流通过。检为了保护检流计，使用中要防止震动或大电流通过。检流计标尺上有两种刻度，等刻度的是表示百分透光率流计标尺上有两种刻度，等刻度的是表示百分透光率(T)，对数刻度表示吸光度，对数刻度表示吸光度(A)。百分透光率百分透光率:根据根据透光率透光率T，如果把入射光强度，如果把入射光强度IO当作当作IO光强单位，透过光强度当作光强单位，透过光强度当作100光强单位中的一部分，这
35、光强单位中的一部分，这一数值为百分透光度，亦称为百分透光率。一数值为百分透光度，亦称为百分透光率。目视目视比比色法色法 定义：用眼睛去比较溶液颜色深定义：用眼睛去比较溶液颜色深浅浅以测以测物质含量的方法。物质含量的方法。测量原理测量原理:用用相同材料、大小的相同材料、大小的比色管盛装标液和待测液，在相比色管盛装标液和待测液，在相同条件下测定，颜色相同，则浓同条件下测定，颜色相同，则浓度就相同。度就相同。为什么？为什么？A=b c cx=Ax/xbx cs=As/sbs又又仅与显色物本质和波长有关仅与显色物本质和波长有关 x=s 相同条件下测定，有相同条件下测定，有bx=bs又又 颜色相同，即透
36、射光的波长、强度相同颜色相同，即透射光的波长、强度相同 Ax=lg(I0/It)As=lg(I0/It)Ax=As 故故 cx=cs 优点：优点：仪器简单，操作简便，适宜于大批量试样仪器简单，操作简便，适宜于大批量试样分析。分析。缺点：缺点：准确度准确度较低，相对误差约为较低，相对误差约为5-20%。目视目视比比色法色法v 测量原理测量原理 分分光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A A。测定时，只。测定时，只要将待测物质推入光路，即可直接读出吸光度要将待测物质推入光
37、路，即可直接读出吸光度值。值。v 测测定步骤：定步骤：1 1调节检测器零点，即仪器的机械零点。调节检测器零点，即仪器的机械零点。2 2应用不含待测组分的应用不含待测组分的参比溶液参比溶液调节吸光零点。调节吸光零点。3.3.待待测组分吸光度的测组分吸光度的测定。测定。二、吸光度的测量原理二、吸光度的测量原理v参比溶液（即试剂空白）：参比溶液（即试剂空白）：不含待测吸光物质，其余组分与浓度均与试液完全相同不含待测吸光物质，其余组分与浓度均与试液完全相同的溶液。的溶液。v意义意义:扣除背景或杂质吸收。扣除背景或杂质吸收。v方法：方法：先将参比溶液的吸光度调节为零读数后，在相同条件下，先将参比溶液的吸
38、光度调节为零读数后，在相同条件下，读取待测液的吸光度。读取待测液的吸光度。v注意：注意：当波长或参比组成改变时，必须重新调节仪器吸光度零当波长或参比组成改变时，必须重新调节仪器吸光度零点点。（参比溶液的吸光度随波长和溶液组成而改变）。（参比溶液的吸光度随波长和溶液组成而改变）根据入射光波长范围不同，可根据入射光波长范围不同，可分为：分为：可见分光光度计可见分光光度计 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 红外分光光度计红外分光光度计 三、分光光度计的类型三、分光光度计的类型v 光源光源白炽钨灯白炽钨灯1发出光（发出光（360-800nm），经聚光镜），经聚光镜2后射向反射镜后射向反射镜3，偏
39、转偏转90。后在狭缝。后在狭缝4附近形成灯丝附近形成灯丝像。经狭像。经狭缝直接射向准直镜缝直接射向准直镜5，后，后，以以一束平行一束平行光射向棱镜光射向棱镜6，在，在其中色散其中色散。当入射角在最小偏向角时。当入射角在最小偏向角时，某，某一波长的单色光在棱镜背面反射后便依原路返回，仍通过准直镜会聚一波长的单色光在棱镜背面反射后便依原路返回，仍通过准直镜会聚在狭缝上，再通过小聚光镜在狭缝上，再通过小聚光镜7、比色皿、比色皿8光门光门9打开时，便最终进入光电打开时，便最终进入光电管管10，产生光电流。，产生光电流。仪器就是通过光电流的测定来间接测量透射光的仪器就是通过光电流的测定来间接测量透射光的
40、变化，从而测定溶液的浓度变化，从而测定溶液的浓度。单单光束分光光度计光束分光光度计 常常见的有见的有 721、722、751、755等型号。等型号。751型分光光度计是一种波长范围较宽型分光光度计是一种波长范围较宽(200-1000nm)、精、精密度较高的分光密度较高的分光光度计。光度计。由光源由光源(钨丝灯或氢灯钨丝灯或氢灯)发出的光线由反射镜反射，使光发出的光线由反射镜反射，使光线经狭缝的下半部，经准光镜进入单色器棱镜色散底，线经狭缝的下半部，经准光镜进入单色器棱镜色散底，由准光镜将光聚焦于狭缝上半部而射出，经液槽照射于由准光镜将光聚焦于狭缝上半部而射出，经液槽照射于光电管上。由此可见，仪
41、器用同一狭缝作入光和出光狭光电管上。由此可见，仪器用同一狭缝作入光和出光狭缝，它们始终具有相同的宽度。缝，它们始终具有相同的宽度。棱镜和透镜均由石英材料作成，反光镜和准光镜表面镀棱镜和透镜均由石英材料作成，反光镜和准光镜表面镀铝。所以全部系统保证紫外光谱通过。铝。所以全部系统保证紫外光谱通过。波长波长200-320nm范围用氢灯作光源，波长范围用氢灯作光源，波长320-1000nm范范围用钨丝灯作光源。围用钨丝灯作光源。波长波长200-625nm用蓝敏光电管用蓝敏光电管(GD-5)测量进射光强度，波测量进射光强度，波长长625-1000nm用红放光电管用红放光电管(GD-6)测量透射光强度。测
42、量透射光强度。吸光度和透光度刻在读数电位差计转盘上，而电流计起吸光度和透光度刻在读数电位差计转盘上，而电流计起示零作用。示零作用。单单光束分光光度计光束分光光度计一、显色反应及其条件的选择一、显色反应及其条件的选择（一）显色反应和显色剂（一）显色反应和显色剂 1.1.显色反应显色反应 在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。与被测组分化合成有色物质的试剂称物的反应叫显色反应。与被测组分化合成有色物质的试剂称为显色剂。为显色剂。显色反应可分两大类，即络合反应和氧化还原反应，而显色反应可分两大类，即络合反应和氧化还原反应，
43、而络合反应是最主要的显色反应。络合反应是最主要的显色反应。选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准:(1)(1)选择性要好。选择性要好。一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，这样干扰就少。或者干扰离子容易被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。(2)(2)灵敏度要高。灵敏度要高。由于吸光光度法一般是测定微量组分的，灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测定。灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判断，值大灵敏度高，否则灵敏度低。但应注意，灵敏度高的显色反应，并不一定选择性就好，对于高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应。(3)(3)对比度要大。对比度要大
44、。即如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上。(4)(4)有色化合物的组成要恒定有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定化学性质要稳定。有色化合物的组成若不确定，测定的再现性就较差。有色化合物若易受空气的氧化、日光的照射而分解，就会引入测量误差。(5)(5)显色反应的条件要易于控制。显色反应的条件要易于控制。如果条件要求过于严格，难以控制，测定结果的再现性就差。选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准:2.2.显色剂显色剂(1)无机显色剂无机显色剂 许多无机试剂能与金属离子起显色反应，如Cu2+与氨水形成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，SCN
45、-与Fe3+形成红色的络合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高多数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高，其中性能较好，目前还有实用价值的有硫氰酸盐、钼酸铵、氨水和过氧化氢等。(2)有机显色剂有机显色剂 许多有机试剂，在一定条件下，能与金属离子生成有色的金属螯合物(具有环状结构的络合物)。将金属螯合物应用于光度分析中的优点将金属螯合物应用于光度分析中的优点1)测定的灵敏度很高测定的灵敏度很高。大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色，摩尔吸光系数大于104；2)金属螯合物都很稳定金属螯合物都很稳定。一般离解常数都很小，而且能抗辐射；3)专用性强专用性强。绝大
46、多数有机整合剂，在一定条件下，只与少数或其一种金属离子络合，而且同一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时，生成具有特征颜色的螯合物。4)4)发展了萃取光度法。发展了萃取光度法。虽然大部分金属螯合物难溶于水，但可被萃取到有机溶剂中。因此,有机显色剂是光度分析中应用最多最广的显色剂有机显色剂是光度分析中应用最多最广的显色剂，寻找高选择性、高灵敏度的有机显色剂，是光度分析发展和研究的重要内容。助色团和生色团助色团和生色团v生色团生色团:在有机化合物分子中，凡是包含有共轭双键的基团如NN、NO、NO2、对醌基、CO(羰基)、CS(硫羰基)等，一般都具有颜色，原因是这些基团中的电子被光激发时，只需要较小的
47、能量，能吸收波长大于200nm的光，因此，称这些基团为生色团；v助色团助色团:某些含有未共用电子对的基团 如胺基NH2，RHN，R2N(具有一对未共用电子对)，羟基-OH(具有两对末共用电子对)，以及卤代基F，Cl，Br，I等，它们与生色基团上的不饱和键互相作用，引起永久性的电荷移动，从而减 小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收“红移”(向长波方向移动)，使试剂颜色加深，这些基团称为助色团。v含有生色基团的有机化合物常常能与许多全属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合物，且灵敏度和选择性都很高，这就为用光度法测定这些离子提供了很好的条件。有机显色剂的种类有机显色剂的种类 有机显色剂的种类
48、很多，下面仅将应用较广泛的几种介绍如下：1.邻二氮菲2.双硫腙3.二甲酚橙4.偶氮胂III 5铬天青S（二）显色反应条件的选择（二）显色反应条件的选择 显色反应能否完全满足光度法的要求，除了与显色剂的性质有主要关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的，如果显色条件不合适，将会影响分析结果的准确度。1.1.显色剂的用量显色剂的用量 2.2.溶液的酸度溶液的酸度 3.3.时间和温度时间和温度 4.4.有机溶剂和表面活性剂有机溶剂和表面活性剂 5.5.共存离子的干扰及消除共存离子的干扰及消除1.1.显色剂的用量显色剂的用量 显色就是将被测组分转变成有色化合物，表示：M +R =MR(被测组分)(显
49、色剂)(有色化合物)反应在一定程度上是可逆的。为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要的，但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定反而不利。2.2.溶液的酸度溶液的酸度 溶液酸度对显色反应的影响很大，这是由于溶液的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及有色络合物的组成和稳定性。因此，控制溶液适宜的酸度，是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一。(1)(1)酸度对被测物质存在状态的影响酸度对被测物质存在状态的影响 (2)(2)酸度对显色剂浓度和颜色的影响酸度对显色剂浓度和颜色的影响(3)(3)对络合物组成和颜色的影响对络合物组成和颜色的影响(1)(1)酸度对被测物质存
50、在状态的影响酸度对被测物质存在状态的影响v大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度降低时，会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子。高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样，是分级进行的。v随着水解的进行，同时还发生各种类型的聚合反应。聚合度随着时间增大，而最终将导致沉淀的生成。显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度不能太低。(2)(2)酸度对显色剂浓度和颜色的影响酸度对显色剂浓度和颜色的影响 光度分析中所用的大部分显色剂都是有机弱酸。显色反应进行时，首先是有机弱酸发生离解，其次才是络阴离子与金属离子络合。M +HRMR +H+从反应式可以看出，溶液的酸度影响着显色剂的离
