1、第四章第四章 药物的含量测定方法与验证药物的含量测定方法与验证Quantitative analysisQuantitative analysis andandValidation of analytical methodValidation of analytical method第一节第一节 定量分析方法定量分析方法容量分析法容量分析法光谱分析法光谱分析法色谱分析法色谱分析法一一 容量分析法容量分析法 化学计量点（等当点）与滴定终点的概念及化学计量点（等当点）与滴定终点的概念及关系关系,滴定误差：滴定误差：本法简便、快速，准确度高，设备简单易得。本法简便、快速，准确度高，设备简单易得。滴定
2、度：滴定度：1ml1ml滴定液相当于被滴定物质的质量滴定液相当于被滴定物质的质量（mgmg）aA+bBaA+bB 产物产物 T=MT=MA A(a/b)(a/b)C CB B C CB B:滴定液的物质的量浓度滴定液的物质的量浓度 M MA A:被测物的摩尔质量被测物的摩尔质量例例1.碘量法测定碘量法测定VitC含量含量T=0.05176.12 1/1=8.806mg例例2:溴酸钾法测定异烟肼含量溴酸钾法测定异烟肼含量 T=0.01667137.14 3/2=3.429mg OCOHHCH2OHOOHOHHI2OC OHHCH2OHOOOHI2CONHNH2N3+2KBrO3COOHN3+3N
3、2+3H2O+2KBr 含量计算含量计算 1.直接滴定：直接滴定：原料：含量原料：含量=F100%F:C/C0(浓度系数）浓度系数）T.V(mg)T.V(mg)W W TVFTVFW W片剂的标示量片剂的标示量%=%=100%100%W W标示量标示量 2.2.间接滴定间接滴定 (1)(1)置换滴定置换滴定 待测物与化合物待测物与化合物A反应反应,生成生成B,再用标准滴定液再用标准滴定液滴定滴定B,.如如Sb5+2I-Sb3+I2 I2+2S2O32-2I-+S4O62-.T=0.1T=0.1121.76 121.76 1/2=6.0881/2=6.088mgmg (2)剩余滴定：先加入定量过
4、量的滴定液剩余滴定：先加入定量过量的滴定液A使其与使其与待测物反应，然后用滴定液待测物反应，然后用滴定液B回滴剩余的回滴剩余的A.含量含量%=(V0-V)TF100%W例如例如:司可巴比妥钠含量测定司可巴比妥钠含量测定+Br2（定量过量）CO NHCNCOCHCH2CH2CH3(CH2)2CHCH3ONaCO NHCNCOCHCH2CH2CH3(CH2)2CHCH3ONaBrBrBr22KI2KBrI2I22Na2S2O32NaINa2S4O6 1ml溴滴定液（溴滴定液（0.05mo1/L）或）或Na2S2O3滴定液滴定液（0.1mo1/L）相当于）相当于13.01mgC12H17N2NaO3
5、。二二 光谱分析光谱分析吸收光谱：吸收光谱：UV-VIS,AAS,IR,NMR发射光谱：发射光谱：Flu,ICP，AES (一一)UV-VIS.UV-VIS.1.Lambert-Beer Law1.Lambert-Beer Law 数学表达式：数学表达式：A=ELCA=ELCE:E:C C为为1mol.L1mol.L-1-1，L=1cmL=1cm时的时的A A C C为为1%(W/V).L=1cm1%(W/V).L=1cm时的时的A A 和和 的关系：的关系：=E E M M 1010 11cm11cm1cm12.2.特点特点 物质对物质对200-760nm200-760nm范围内电磁波吸收特
6、性建立范围内电磁波吸收特性建立的分析方法。的分析方法。200-400nm200-400nm为紫外为紫外,400-760nm,400-760nm为可见为可见光光;比色分析。比色分析。灵敏度高，达灵敏度高，达1010-7-7g/mLg/mL（与物质的（与物质的有关）有关）.准确度好，准确度好，RSD:2%5%RSD:2%5%仪器价格低，操作简单，易于普及。仪器价格低，操作简单，易于普及。应用广泛：应用广泛：定性：药物鉴别，结构鉴定定性：药物鉴别，结构鉴定 定量：比较法，吸光系数法，导数法，双入法定量：比较法，吸光系数法，导数法，双入法UV-VIS.3.仪器校正和检定仪器校正和检定 准确度准确度显示
7、显示值与实际值与实际值间误差，一般值间误差，一般0.5nm0.5nm，常用，常用HgHg灯或氘灯的锐线光谱线校正。灯或氘灯的锐线光谱线校正。A A准确度：用准确度：用K K2 2CrCr2 2O O7 7的的H H2 2SOSO4 4液（液（0.005mol/L)0.005mol/L)检查，由一定检查，由一定处的处的E E值与值与ChPChP附录的附录的E E值比较，值比较，RSDRSD值在值在1%1%以内。以内。杂散光：常以信号较弱的杂散光：常以信号较弱的处（处（200nm,220nm,200nm,220nm,310nnm,340nm)310nnm,340nm)规定物质所含杂散光的强度百分比
8、规定物质所含杂散光的强度百分比为指标。为指标。重现性：狭缝（固定或可调）或谱带宽度，重现性：狭缝（固定或可调）或谱带宽度，分辨率（分辨率（）UV-VIS.4.溶剂溶剂 先检查所用溶剂在测定先检查所用溶剂在测定附近是否符合要求，附近是否符合要求，空气为空白。空气为空白。1cm1cm吸收池吸收池(nm)(nm)：220-240 241-250 251-300 300220-240 241-250 251-300 300 A A应应 0.40 0.20 0.10 0.05 0.40 0.20 0.10 0.05 具体选择时还要注意溶剂的具体选择时还要注意溶剂的截止波长截止波长 配制一定浓度的供试液，
9、以所用溶剂为空白，配制一定浓度的供试液，以所用溶剂为空白，扫描其扫描其maxmax应在该品种规定应在该品种规定1nm1nm内，如维生素内，如维生素B B1 1为为246nm246nm，若超出太多可能原因：，若超出太多可能原因：试样真伪或试样真伪或纯度；纯度；仪器不准。仪器不准。以以A A最大的最大的作测定作测定，测定时，测定时A A读数读数0.3-0.70.3-0.7误差较小误差较小.UV-VIS.5.UV-VIS.5.测定测定 1.1.对照比较法对照比较法:含量含量%=Cr%=Cr 100%(100%(原料）原料）2.E2.E法法:含量含量%=%=100%(100%(原料）原料）3.3.计算
10、分光光度法计算分光光度法 a.a.解线性方程组法，解线性方程组法，b.b.双入测定法双入测定法 c.c.系数倍率法，系数倍率法，d.d.导数法导数法 AxAxArArD DW W AxAxD DE E100100W W片剂和注射剂片剂和注射剂标示量标示量%=A AD D E 100E 100V VS S标示量标示量100%100%A AD DW W标示量标示量%=%=100%100%E E 100100W W样样标示量标示量 Ax AxCrCrD DW W标示量标示量%=%=100%100%Ar ArW W样样标示量标示量1%1%1cm1cm1%1%1cm1cm(二二)Flu)Flu法法.1.
11、1.原理和特点原理和特点 原理：物质原理：物质UV-VISUV-VIS光照射光照射(E(Eexex)激发激发(s(s1 1)，回复，回复到基态到基态(s(s0 0)释放出辐射能释放出辐射能(E(Eemem)荧光，振动驰豫荧光，振动驰豫等过程会消耗能量，等过程会消耗能量，E E荧光荧光Eexex,在一定浓度内测荧光在一定浓度内测荧光,荧光强度荧光强度C.C.特点：特点：a.a.灵敏度比灵敏度比UV-VISUV-VIS高高100100倍以上，所以干扰因倍以上，所以干扰因素多，一般要做空白试验，分析用样品量少。素多，一般要做空白试验，分析用样品量少。b.b.浓度大时能引起荧光熄灭所以适于低浓度浓度大
12、时能引起荧光熄灭所以适于低浓度分析。分析。c.c.能产生荧光的物质有限所以应用不及能产生荧光的物质有限所以应用不及UVUV广泛广泛FLUFLU法法.2.2.测定测定 荧光强度荧光强度R=KC Cx=Cr (Cr对照液浓度）对照液浓度）同一个空白同一个空白,应在应在0.52.00.52.0间间单色器单色器1吸收池吸收池单色器单色器2光源光源检测器检测器入射狭缝入射狭缝出射狭缝出射狭缝exemR Rx x-R-RoxoxR Rr r-R-RororR Rx x-R-RoxoxR Rr r-R-Roror三三 色谱分析色谱分析 特点：灵敏度高；选择性好；高速高特点：灵敏度高；选择性好；高速高效；应用
13、广泛。效；应用广泛。分类：分类：1.1.根据原理分根据原理分 2.2.根据分离方式分根据分离方式分 3.3.根据流动相分根据流动相分(一一)HPLC.1.仪器仪器 反相反相RP-HPLC,RP-HPLC,常用常用C C18,18,，C C8 8，做固定相，常用做固定相，常用UVUV检测器，柱温为室温或可调，进样几检测器，柱温为室温或可调，进样几L L 几十几十L L，流动相甲醇，流动相甲醇/水为主，其它间或使用缓冲液，水为主，其它间或使用缓冲液，CHCH3 3CNCN，离子对试剂等，恒组成或梯度。，离子对试剂等，恒组成或梯度。ChP规定规定:柱固定相种类，流动相组成，检测柱固定相种类，流动相组
14、成，检测器类型不得任意改变器类型不得任意改变，其它条件可适当改变。，其它条件可适当改变。如柱内径长度，固定相牌号，粒度，流动相速如柱内径长度，固定相牌号，粒度，流动相速度，柱温，进样量等。度，柱温，进样量等。HPLC.2.色谱系统适用性试验色谱系统适用性试验1.n=5.54(t1.n=5.54(tR R/W/Wh/2h/2)2 2=16(t=16(tR R/W)/W)2 22.R=2.R=，除另有规定外除另有规定外R R应应1.51.53.3.重复性：对照品连续进样重复性：对照品连续进样5 5次，除另有规定外，次，除另有规定外，其峰面积的其峰面积的RSDRSD应应2%2%。4.4.拖尾因子拖尾
15、因子T=T=除另有规定外峰高定量应除另有规定外峰高定量应0.951.050.951.052(t2(tR2R2-t-tR1R1)W W1 1+W+W2 2 W W0.05h0.05h 2d 2dHPLC.3.测定（用测定（用A或或h定量）定量）(1).(1).内标加校正因子内标加校正因子 对照品对照品+内标：内标：进样进样 f=f=供试液供试液+内标内标 CxCx=f=f1 1）一般两次进样量相同）一般两次进样量相同2 2）两次所加内标量相同）两次所加内标量相同A As s/C/Cs s(内）内）A Ar r/C/Cr r(外）外）A Ax xA As s/C/Cs sHPLC.测定（用测定（用
16、A或或h定量）定量）(2).外标法：外标法：1)标准曲线法：回归方程，相关系数，求标准曲线法：回归方程，相关系数，求Cx 2)单点比较法：单点比较法：Cx=Cr含量含量%=100%标示量标示量=100%（片剂）（片剂）A Ax xA Ar r C Cx xD D W W C CX XD DW W W WS S标标(二二)GC.1.)GC.1.仪器仪器 除另有规定外，载气为氮气，柱为填充或毛除另有规定外，载气为氮气，柱为填充或毛细管柱，进样口温度高于柱温细管柱，进样口温度高于柱温3050，以使样品，以使样品很快气化，进样量很快气化，进样量0.1几几 L.检测器：检测器：FID.FID.温度柱温，
17、并温度柱温，并100100以防水以防水气形成。气形成。柱温：由待检样品定，固定或程序升温。柱温：由待检样品定，固定或程序升温。1.1.检测器种类检测器种类 2.2.固定液品种固定液品种 3.3.特殊指定柱材料不得改变特殊指定柱材料不得改变 其它可适当改变，如柱内径，长度，载体粒度，其它可适当改变，如柱内径，长度，载体粒度，固定液量，氮气的速度，柱温，进样量等。固定液量，氮气的速度，柱温，进样量等。GC.2.GC.2.测定测定 (1)进样方式进样方式:快；快；(2)进样量小，易造成误差进样量小，易造成误差所以尽量采用自动进样。所以尽量采用自动进样。内标法和外标法：同内标法和外标法：同HPLC含量
18、含量%=f 100%标准加入法标准加入法:Cx=(A(Ax xC Cs s)/A)/As sD D W W C Cx x(A(Aisis/A/Ax x)-1)-1第二节第二节.样品分析的前处理方法样品分析的前处理方法 分析含金属或卤素分析含金属或卤素,S,N,P,Se,S,N,P,Se等元素等元素的药物时，需要时对样品进行进一步处的药物时，需要时对样品进行进一步处理，使理，使M M或或X X成游离状态，方可进行下步成游离状态，方可进行下步分析测定，当其连结位置不同时，其牢分析测定，当其连结位置不同时，其牢固程度各异，处理方法也各不相同。固程度各异，处理方法也各不相同。M M直接与直接与C C以
19、共价键连接以共价键连接 有机金属药物，连接牢固有机金属药物，连接牢固M M不直接与不直接与C C以共价键连接以共价键连接 含含M M有机药物，连接不牢固有机药物，连接不牢固X X与芳环连接牢固：如泛影酸、碘番酸与芳环连接牢固：如泛影酸、碘番酸X X与脂肪链连接不牢：如三氯叔丁醇与脂肪链连接不牢：如三氯叔丁醇 一一.不经有机破坏的前处理方法不经有机破坏的前处理方法（一）直接测定（一）直接测定 M M不直接与不直接与C C相连接，结合不牢固，在水液相连接，结合不牢固，在水液中电离，释放出金属离子，可直接测定。中电离，释放出金属离子，可直接测定。如：富马酸亚铁如：富马酸亚铁 FeFe2+,2+,用用
20、Ce(SOCe(SO4 4)2 2滴滴 定，邻二氮菲指示，达终点时，与邻二氮菲结定，邻二氮菲指示，达终点时，与邻二氮菲结合的合的FeFe2+2+氧化成氧化成FeFe3+,3+,邻二氮菲结合显蓝色。邻二氮菲结合显蓝色。葡萄糖酸钙葡萄糖酸钙H H2 2O/OHO/OH-1-1溶解溶解,EDTA,EDTA滴定滴定.HClHCl（二）经水解后测定（二）经水解后测定 一定条件下，加热水解，使有机结合的一定条件下，加热水解，使有机结合的X释释放出来，再用银量法测定含量。放出来，再用银量法测定含量。ClCl3 3C-CMeC-CMe2 2OH1/2HOH1/2H2 2O+4NaOH O+4NaOH MeMe
21、2 2CO+3NaCl+HCOONa+2HCO+3NaCl+HCOONa+2H2 2O O佛尔哈德法：佛尔哈德法：NaCl+AgNONaCl+AgNO3 3(过）过）AgClAgCl+NaNO+NaNO3 3 剩余剩余AgNOAgNO3 3+NH+NH4 4SCN AgSCNSCN AgSCN+NH+NH4 4NONO3 30.1mol/L NH0.1mol/L NH4 4Fe(SOFe(SO4 4)指示，终点指示，终点Fe(SCN)Fe(SCN)2+2+红红T T：1 10.10.1186.5186.51/3=6.22mg1/3=6.22mg （三）经（三）经OHOH后测定后测定 在碱性环境
22、下，与在碱性环境下，与OO或或HH一起回流，使结一起回流，使结合较牢的合较牢的X X成游离离子状态，再测定成游离离子状态，再测定如碘他拉酸测定如碘他拉酸测定:和和NaOH/Zn作用作用,生成生成NaI,用用AgNO3滴定滴定,曙红钠指示终点曙红钠指示终点.T:0.1 614 1/3=20.46二二.经有机破坏后分析经有机破坏后分析.(一一)湿法破坏湿法破坏一般采用强酸加热消化处理：一般采用强酸加热消化处理：HNO3-HClO4适于生物样品适于生物样品,金属为高价金属为高价,不适于不适于含含N杂环。杂环。HNO3-H2SO4适于多数有机样品适于多数有机样品,金属为高价金属为高价,不不适于含碱土金
23、属的药物。适于含碱土金属的药物。H2SO4-K2SO4常于含常于含As或或Sb药物，金属为低价。药物，金属为低价。1.相同条件下做空白试验校正。相同条件下做空白试验校正。2.在通风橱中进行，注意加热温度及速度。在通风橱中进行，注意加热温度及速度。3.取样量依据待测物含量和测定方法灵敏度取样量依据待测物含量和测定方法灵敏度含氮药物测定含氮药物测定:凯氏定氮凯氏定氮1.样品消解样品消解(有机破坏有机破坏)含氮有机药物含氮有机药物 NH4HSO4.2.蒸馏蒸馏,吸收吸收 NH4HSO4+NaOHNH3+Na2SO4+H2O.吸收吸收:NH3+H3BO3 NH4BO2+H2O.3.滴定滴定:NH4BO
24、2+H2SO4+H2O (NH4)2SO4+H3BO3 4.T:对含一个氮的样品对含一个氮的样品,1mL H2SO4(0.05mol/L)相当相当于于1.4mg的的N.H H2 2SOSO4 4催化剂催化剂/例例:扑米酮的含量测定扑米酮的含量测定（ChP2010)ChP2010)C12H14N2O2,M:218.26 样品样品0.2g 凯氏定氮凯氏定氮,H2SO4(0.05mol/L)滴定滴定.T:对扑米酮对扑米酮:0.05 218.26 1/1=10.91mg 对氮对氮:0.05 14 1/1=0.7mg(二二)干法破坏干法破坏1.高温灰化高温灰化控制下灰化控制下灰化T及及t灰化完全后用稀酸
25、溶解应无色并无不溶性黑渣。灰化完全后用稀酸溶解应无色并无不溶性黑渣。该法操作简便，样品处理量大，但不适于含挥发该法操作简便，样品处理量大，但不适于含挥发性金属（性金属（As、Hg）的样品处理。）的样品处理。2.氧瓶燃烧氧瓶燃烧 .(1)装置装置燃烧瓶：硬质、磨口。燃烧瓶：硬质、磨口。铂丝：固定样品包。铂丝：固定样品包。无灰滤纸：包样品。无灰滤纸：包样品。吸收液：吸收燃烧产生的烟雾，如测吸收液：吸收燃烧产生的烟雾，如测用用NaOH/HNaOH/H2 2O,BrO,Br用用H H2 2O/NaOH/HO/NaOH/H2 2O O2 2,S,S用用H H2 2O O2 2/H/H2 2O,O,SeS
26、e用用AgNOAgNO3 3氧瓶燃烧氧瓶燃烧 .(2)(2)操作操作 称样于无灰滤纸中包好，并固定在铂丝下端，称样于无灰滤纸中包好，并固定在铂丝下端，露出尾巴。露出尾巴。在燃烧瓶中加入规定吸收液，快速通氧使之充在燃烧瓶中加入规定吸收液，快速通氧使之充满瓶子。满瓶子。点燃滤纸包尾部，迅速放入燃烧瓶，按紧瓶塞，点燃滤纸包尾部，迅速放入燃烧瓶，按紧瓶塞，少量水封住瓶口。少量水封住瓶口。燃烧完后，振摇，使烟雾全部吸收于吸收液中。燃烧完后，振摇，使烟雾全部吸收于吸收液中。用适当方法测定，同时做空白。用适当方法测定，同时做空白。第三节第三节 分析方法验证分析方法验证 用于验证测定方法的可靠性是否符合用于验
27、证测定方法的可靠性是否符合检测要求，起草质量标准或因生产工艺改变，检测要求，起草质量标准或因生产工艺改变，制剂组分改变而对分析方法修订时，都需要制剂组分改变而对分析方法修订时，都需要对分析方法进行验证，涉及药物鉴别，杂质对分析方法进行验证，涉及药物鉴别，杂质检查，有效成分含量测定等。检查，有效成分含量测定等。分析方法验证分析方法验证.一一.准确度准确度 含义：测定结果与真实值或参考值接近的含义：测定结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率来表示。程度，一般用回收率来表示。药物分析：样品药物分析：样品 测其药物含量为测其药物含量为P 加入已知量为加入已知量为A的药物对照品的药物对照品 测定混
28、合测定混合液中药物含量为液中药物含量为M 回收率回收率=(M-P）/A 分析方法验证分析方法验证.准确度准确度 生物药物分析：生物药物分析：应加入高，中，低三种浓度，各应加入高，中，低三种浓度，各3535次，次，测测定回收率定回收率 制剂分析：在空白辅料中加药物对照品，制剂分析：在空白辅料中加药物对照品，高，中，低浓度各高，中，低浓度各3 3个个P=100%P=100%，RSDRSD一般应在一般应在2%2%以内。以内。测定量测定量-本底量本底量 加入量加入量 分析方法验证分析方法验证.二二.精密度精密度 含义：同一均匀样品，多次取样测含义：同一均匀样品，多次取样测定所得结果之间接近程度。定所得
29、结果之间接近程度。标准偏差标准偏差S(SD)=S(SD)=相对标准偏差相对标准偏差RSD=RSD=100%,也叫变异系数也叫变异系数CV.S S X X(x(xi i-x)-x)2 2 n-1 n-1分析方法验证分析方法验证.精密度精密度1.1.一般报道重复性：同一条件下，一个分析一般报道重复性：同一条件下，一个分析人员测定人员测定样品样品结果的精密度（结果的精密度（a.3a.3个浓度各测个浓度各测3 3次；次；b.b.一个浓度测一个浓度测6 6次）次）2.2.中间精密度：同一实验室，不同分析人员中间精密度：同一实验室，不同分析人员测定结果精密度，制定新药物质量标准时一测定结果精密度，制定新药
30、物质量标准时一定要做。定要做。3.3.对生物样品的分析还可测定日内，日间精对生物样品的分析还可测定日内，日间精密度。密度。4.4.重现性重现性分析方法验证分析方法验证.三三.专属性专属性含义：分析方法抗干扰程度的量度。含义：分析方法抗干扰程度的量度。1.1.样品情况样品情况2.2.分析项目分析项目3.3.分析方法分析方法分析方法验证分析方法验证.四四.检测限检测限LODLOD 含义：样品中被测物能检出的最低浓度或含义：样品中被测物能检出的最低浓度或量，反映检测方法灵敏度和噪音大小（仪器稳量，反映检测方法灵敏度和噪音大小（仪器稳定性）定性）UV:UV:测空白值，求其响应的标准值，以测空白值，求其
31、响应的标准值，以3S3S空空做做LODLOD估计值。估计值。HPLC,GCHPLC,GC常用常用S/N=3S/N=3时相应浓度或进样量表时相应浓度或进样量表示示LOD.LOD.分析方法验证分析方法验证.五五.定量限定量限LOQLOQ 一般以一般以S/N=10S/N=10表示，既要能检出，又要表示，既要能检出，又要保证一定准确度，精密度。保证一定准确度，精密度。分析方法验证分析方法验证.六六.线性线性 在设定范围内，测定值与被测定浓度间呈正在设定范围内，测定值与被测定浓度间呈正比关系的程度，浓度点比关系的程度，浓度点5757个，每个点测个，每个点测3 3次，求次，求平均值，用最小二乘法进行线性回
32、归（回归方程平均值，用最小二乘法进行线性回归（回归方程Y=a+bxY=a+bx),),求相关系数求相关系数r r r r接近接近1 1，表示线性关系越好，（，表示线性关系越好，（+表示正表示正相关；表示负相关）相关；表示负相关）a a越小越好越小越好分析方法验证分析方法验证.七七.范围范围 具一定线性的测定方法适用的高低具一定线性的测定方法适用的高低限浓度区间限浓度区间。分析方法验证分析方法验证.八八.耐用性耐用性 测定条件有小的变动时，测定结果测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度不受影响的承受程度 九九.验证内容的选择验证内容的选择表4-3小结 1.1.分析样品的前处理方法分析样品的前处理方法.特别是有机破特别是有机破坏的方法坏的方法.2.2.样品定量测定的方法样品定量测定的方法.特别是计算方法特别是计算方法.3.3.分析方法的验证分析方法的验证.
