1、第一讲：蛋白质组学基本原理第一讲：蛋白质组学基本原理第一章第一章 绪论绪论15 February 2001一、蛋白质组研究的开端及蛋白质组含义一、蛋白质组研究的开端及蛋白质组含义 -2001年，人类基因组序列草图的完成，宣告了年，人类基因组序列草图的完成，宣告了 “后基因组时代后基因组时代”的到来，其主体是功能基因组学的到来，其主体是功能基因组学（functional genomics),而蛋白质是基因功能的执行体；而蛋白质是基因功能的执行体；2.人类基因组计划的完成并不表明人类基因组的所有基因人类基因组计划的完成并不表明人类基因组的所有基因 及间隔序列已完全确定；及间隔序列已完全确定；3.基
2、因组计划即使已确定某生物基因组内的全部基因，基因组计划即使已确定某生物基因组内的全部基因，也不能确定哪些基因在何时、何地、以何种程度表达；也不能确定哪些基因在何时、何地、以何种程度表达；4.生物的基因组只表达部分基因生物的基因组只表达部分基因(3080%)，表达的基因，表达的基因 类型及其表达程度随生物生存环境及内在状态的变化类型及其表达程度随生物生存环境及内在状态的变化 而表现极大的差别；而表现极大的差别；5.基因虽是遗传信息的源头基因虽是遗传信息的源头,而蛋白质是基因功能的执行体；而蛋白质是基因功能的执行体；6.以往的蛋白质研究只是针对生命活动中某一种或某几种以往的蛋白质研究只是针对生命活
3、动中某一种或某几种 蛋白质，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制；蛋白质，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制；因此，因此，无论是从基因组计划的局限、还是蛋白质研究的无论是从基因组计划的局限、还是蛋白质研究的 自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质研究均是自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质研究均是 势在必行。势在必行。Proteome:Protein+Genome（蛋白质组）（蛋白质组）Genome:一个细胞或一个生物体包含的所有遗传信息一个细胞或一个生物体包含的所有遗传信息；Proteome：一种细胞：一种细胞/组织组织/生物体生物体某个时间段某个时间段所包含的所包含的 所有蛋白质的所有蛋白
4、质的存在形式存在形式及其及其活动方式活动方式。蛋白质组及蛋白质组学的含义蛋白质组及蛋白质组学的含义 Proteomics（蛋白质组学）：（蛋白质组学）：研究蛋白质组的科学，研究蛋白质组的科学，阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞 内定位、相互作用研究等内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能最终揭示蛋白质功能 网络。网络。基因微阵列（基因微阵列（microarray)提供了细胞中大量或提供了细胞中大量或全部基因表达的快速检测手段，然而从全部基因表达的快速检测手段，
5、然而从mRNA水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平。水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平。因为：因为：1.各种各种mRNA不同的不同的稳定性稳定性和不同的和不同的翻译效率翻译效率 能够影响新蛋白质的产生；能够影响新蛋白质的产生；二、研究二、研究mRNA作为基因产物作为基因产物2.蛋白质形成后在稳定性和转换速度上有很大不同，蛋白质形成后在稳定性和转换速度上有很大不同，许多参与信号转导、转录因子调节和细胞周期控制许多参与信号转导、转录因子调节和细胞周期控制的蛋白质迅速转换，这是其活性调节的一种方式；的蛋白质迅速转换，这是其活性调节的一种方式；3.mRNA水平没有告诉我们相应蛋白质的调节状态，水
6、平没有告诉我们相应蛋白质的调节状态，蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，也会因环境因素而改变。也会因环境因素而改变。三、蛋白质组学研究的内容三、蛋白质组学研究的内容 结构蛋白质组学：结构蛋白质组学：主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、种类分析、数量确定等；种类分析、数量确定等；蛋白质结构测定主要是蛋白质结构测定主要是 应用应用X-光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是 应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法；应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法；功能蛋
7、白质组学：功能蛋白质组学：研究蛋白质的功能，研究蛋白质的功能，确定确定蛋白质在亚细胞结构中的定位蛋白质在亚细胞结构中的定位，蛋白质蛋白质-蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用等。等。蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在不同种类、不同时间和条件下的动态本质。不同种类、不同时间和条件下的动态本质。四、蛋白质组学对分析的挑战四、蛋白质组学对分析的挑战 用用DNA微阵列和相关方法分析基因表达依赖于两个微阵列和相关方法分析基因表达依赖于两个重要工具：重要工具：PCR和寡核苷酸与互补序列的杂交。但和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是没有类似的工具用于蛋白质分析。是没有类
8、似的工具用于蛋白质分析。1）没有）没有PCR等价物。目前不可能有多肽分子以类等价物。目前不可能有多肽分子以类似于核苷酸通过似于核苷酸通过PCR复制的方式复制。复制的方式复制。第二，蛋白质不能专一地与互补氨基酸序列杂交。第二，蛋白质不能专一地与互补氨基酸序列杂交。第三，细胞中每一个蛋白质产物并不一定只有一种第三，细胞中每一个蛋白质产物并不一定只有一种分子实体。分子实体。因此，因此，蛋白质组的分析需要一套不同于基因表达分析蛋白质组的分析需要一套不同于基因表达分析的工具，能够对修饰和非修饰的蛋白质进行检测和的工具，能够对修饰和非修饰的蛋白质进行检测和定量分析。定量分析。五、蛋白质组学的工具五、蛋白质
9、组学的工具 四种重要工具的发展和结合使用给我们提供了灵敏四种重要工具的发展和结合使用给我们提供了灵敏性和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。性和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。1）数据库：）数据库：蛋白质蛋白质、EST（expressed sequence tags)、和、和基因组序列数据库基因组序列数据库共同提供了共同提供了生物表达全部蛋白质的完整数据库目录。生物表达全部蛋白质的完整数据库目录。2）质谱（）质谱（MS）：目前认为）：目前认为MS是肽序列分析中的是肽序列分析中的最新技术。最新技术。MS数据为蛋白质鉴定提供了最有力和数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最精确的方法。最精确的方法。3
10、）对数据库中特定蛋白质序列与）对数据库中特定蛋白质序列与MS数据进行比对数据进行比对的各种软件。的各种软件。4）蛋白质的分析分离技术，）蛋白质的分析分离技术，2D-SDS-PAGE是最广是最广泛用于蛋白质组学的技术，蛋白质分辨率达到成千泛用于蛋白质组学的技术，蛋白质分辨率达到成千上万种，完全可以用于组织与细胞中的大规模蛋白上万种，完全可以用于组织与细胞中的大规模蛋白质分离。质分离。EST(Expressed Sequence Tag)表达序列标签表达序列标签EST(expressedsequencetags)是是cDNA克隆的末端序列克隆的末端序列,平平均长度为均长度为300500bp,称为表
11、达序列标签称为表达序列标签,通常是从已有的通常是从已有的cDNA文库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生文库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生,一般一般使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物。一个使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物。一个EST代表代表生物体某种组织在某一时期的一个表达基因生物体某种组织在某一时期的一个表达基因。采用生物信息采用生物信息学方法延伸表达序列标签（学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至）序列，获得基因部分乃至全长全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广
12、阔的空间。并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。The identification of ESTs has proceeded rapidly,with approximately 52 million ESTs now available in public databases(e.g.GenBank 5/2008,all species)六、蛋白质组学的应用范围六、蛋白质组学的应用范围u 根据目前的实践，蛋白质组学包括三项主要应用：根据目前的实践，蛋白质组学包括三项主要应用：1）蛋白质表达谱蛋白质表达谱：蛋白质表达谱是鉴定生物或细胞蛋白质表达谱是鉴定生物或细胞特定状态下蛋白质的表达
13、或药物、化学或物理刺激特定状态下蛋白质的表达或药物、化学或物理刺激下蛋白质的表达，获得蛋白质组图、蛋白质组成成下蛋白质的表达，获得蛋白质组图、蛋白质组成成分鉴定、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示。分鉴定、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示。2）蛋白质修饰谱蛋白质修饰谱：蛋白质修饰谱是鉴定蛋白质在何：蛋白质修饰谱是鉴定蛋白质在何处、怎样被修饰的。许多蛋白质翻译后的修饰控制处、怎样被修饰的。许多蛋白质翻译后的修饰控制着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，许多着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，许多环境化学因素、药物、和内源化学因素可产生修饰环境化学因素、药物、和内源化学因素可产生修饰蛋白质的活性亲
14、电体。蛋白质的活性亲电体。3）蛋白质网络谱蛋白质网络谱：蛋白质网络谱是在生物系统中测蛋白质网络谱是在生物系统中测定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。这些相定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。这些相互作用决定蛋白质功能网络。互作用决定蛋白质功能网络。获获 得：得：阐释重要生命活动的分子机制阐释重要生命活动的分子机制，包括细胞周期、细胞，包括细胞周期、细胞分化与发育、细胞凋亡、肿瘤发生与发展、环境反应与分化与发育、细胞凋亡、肿瘤发生与发展、环境反应与调节，物种进化等。调节，物种进化等。医药靶分子寻找与分析医药靶分子寻找与分析，包括新型药物靶分子、，包括新型药物靶分子、肿瘤恶性标志、人体病理介导
15、分子、病原菌毒性成分肿瘤恶性标志、人体病理介导分子、病原菌毒性成分等。每种疾病与等。每种疾病与10个基因相关；每个基因又与个基因相关；每个基因又与 310个蛋白质相关；人类主要的个蛋白质相关；人类主要的100150种疾病，则种疾病，则应该有应该有300015000种蛋白质具有成为药靶的可能性。种蛋白质具有成为药靶的可能性。因此，因此，可能有几千或上万种新的药物靶标将被发现，将是可能有几千或上万种新的药物靶标将被发现，将是功能基因组学有可能功能基因组学有可能带来一笔巨大的科学和经济财富带来一笔巨大的科学和经济财富。Outline一、概述一、概述二、蛋白质的提取与样品制备二、蛋白质的提取与样品制备
16、三、蛋白质的分离与二维电泳技术三、蛋白质的分离与二维电泳技术四、蛋白质的检测技术四、蛋白质的检测技术五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定六、蛋白质构象解析技术六、蛋白质构象解析技术1 1、蛋白质组学研究远比基因组学研究复杂、蛋白质组学研究远比基因组学研究复杂（1 1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量 如人的基因组有如人的基因组有3-53-5万个基因而蛋白质则有万个基因而蛋白质则有30-10030-100万；万；（2 2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的；）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的；（3 3）细胞内
17、蛋白质的拷贝数（）细胞内蛋白质的拷贝数（10108 8）远比基因拷贝数大）远比基因拷贝数大 （最多（最多10105 5）（4 4）基因可采用）基因可采用PCRPCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩增和自动测序技术增和自动测序技术2 2、蛋白质组学研究技术进展、蛋白质组学研究技术进展（1 1）19751975年，年，2-DE2-DE技术建立技术建立,上世纪上世纪8080年代，固年代，固相化相化pHpH梯度凝胶问世，使梯度凝胶问世，使2-DE2-DE的重复性和加样的重复性和加样量改善；量改善；（2 2）上世纪末期，）上世纪末期，MALDI-TOF-MSMALDI-T
18、OF-MS和和ESI-MSESI-MS可精确可精确测定相对分子量和微量蛋白质的测定；测定相对分子量和微量蛋白质的测定；（3 3）快速）快速多肽序列分析多肽序列分析；（4 4）9090年代年代,多图象分析多图象分析与大规模与大规模数据处理软件数据处理软件问世，复杂蛋白质图谱处理成为现实；问世，复杂蛋白质图谱处理成为现实；MALDI-TOF MS:matrix assisted laser desorption ionization-time of flight Mass Spectrometry;ESI/MS/MS:electrospray ionization3 3、蛋白质组分析的首要要求、蛋
19、白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测、分析千种混合蛋白质进行分离、检测、分析 ；2-DE2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术白质混合物的首选技术 。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的
20、消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得4.蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定二、蛋白质的提取与样品制备
21、二、蛋白质的提取与样品制备二维电泳分析中的样品制备二维电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰因素。完全去除样品中的核酸和某些干扰因素。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白
22、质，从而保尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白质，从而保证待研究蛋白质的可检测性。证待研究蛋白质的可检测性。样品制备原则样品制备原则1 1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质的损失。的损失。（1 1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白质；）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白质；（2 2）不同类型的蛋白质需要不同的方法；）不同类型的蛋白质需要不同的方法；（3 3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法；种方法；2 2、细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，、细胞和组织样品
23、的制备应尽可能减少蛋白质的降解，从特殊亚细胞器提取蛋白还需分级分离。从特殊亚细胞器提取蛋白还需分级分离。3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C，不要反复冻融样品；不要反复冻融样品；4、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小 分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等脂类、酚类等5、加入尿素之后，加温不要超过、加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白，以防蛋白 质氨甲酰化。质氨甲酰化。（一）细胞裂解的方法（一）细胞裂解的方法1、温和裂解的方法：、温和
24、裂解的方法：适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器（1）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等 低渗溶液细胞；低渗溶液细胞；（2）冻融裂解：液氮快速冻融，然后在）冻融裂解：液氮快速冻融，然后在37C融化融化,反复几次反复几次,适合于细菌、组织培养细胞；适合于细菌、组织培养细胞；（3）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主 要针对组织培养细胞；要针对组织培养细胞；（4）酶裂解：在等渗溶液中用酶去细胞壁，常用的）酶裂解：在等渗溶液中用酶去细胞壁，常用的 酶有溶菌酶酶
25、有溶菌酶(细菌细菌)、纤维素酶、纤维素酶+果胶酶果胶酶(植物植物)、溶细胞酶（酵母）。溶细胞酶（酵母）。2、剧烈的细胞裂解方法、剧烈的细胞裂解方法 主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织（1）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞，）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞，但要注意产生热量和气泡；但要注意产生热量和气泡；（2）研磨法）研磨法:加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和 微生物细胞；微生物细胞；（3）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小 片），
26、同时要加入预冷的匀浆溶液；片），同时要加入预冷的匀浆溶液；（4）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于 破碎细胞，提取内含蛋白质。破碎细胞，提取内含蛋白质。3、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解 防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度：苯甲磺酰氟，工作浓度1mM，能不
27、可，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度：可在水溶液中使用，工作浓度4mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。能改变蛋白质的等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为酸的工作浓度为1mM，作用对象为金属蛋白酶。，作用对象为金属蛋白酶。4 4、蛋白质沉淀步骤、蛋白质沉淀步骤（1 1）硫酸铵盐析）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而
28、与核酸分离；原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离；步骤：蛋白质浓度步骤：蛋白质浓度1mg/ml1mg/ml，缓冲溶液浓度，缓冲溶液浓度50mM(50mM(含含EDTA),EDTA),缓慢加入缓慢加入(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4,搅拌搅拌10-30min10-30min，离，离心分离。心分离。注意点：只用作预分离和富集，且注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4会干扰会干扰IEFIEF（2 2）TCATCA沉淀沉淀 三氯乙酸（终浓度三氯乙酸（终浓度10-20%10-20%）加到提取液中混均，置）加到提取液中混均，置冰上冰上30min30min，最后
29、用丙酮或乙醇清洗沉淀除，最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCATCA。该法。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。不易造成蛋白质变性和化学修饰。（3 3）丙酮沉淀）丙酮沉淀 提取物加入提取物加入3 3倍体积的冰丙酮，倍体积的冰丙酮，-20-20沉淀沉淀2 2小时，小时，离心空气干燥去丙酮。离心空气干燥去丙酮。（4 4）丙酮）丙酮/TCA/TCA沉淀沉淀 用丙酮在用丙酮在10%10%的的TCATCA中重悬样品溶液（含有中重悬样品溶液（含有0.010.01的的 -巯基乙醇或巯基乙醇或20mmol/L),-2020mmol/L),-20沉淀沉淀45min,45min,离心离心 分离分离,丙酮清洗沉淀丙酮清洗沉
30、淀,空气干燥。空气干燥。（5 5）苯酚提取）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NHNH4 4CACA沉淀，沉淀，然后先用然后先用NHNH4 4CACA洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的植物样品。本法适合于高杂质的植物样品。5 5、清除影响二维电泳图谱的杂质、清除影响二维电泳图谱的杂质（1 1）盐、残留的缓冲液和电性小分子）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀常用透析、凝胶过滤、沉淀/重
31、悬的方法脱盐，但易重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。使样品丢失。（2 2）内源性小分子）内源性小分子这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮丙酮/TCA/TCA沉淀去除。沉淀去除。（3 3）离子去污剂）离子去污剂SDSSDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEFIEF，-20-200 0C C的丙酮溶液可除去。的丙酮溶液可除去。（4 4）核酸）核酸核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加白质结合，阻碍聚焦；
32、银染时出现高背景。加0.1V0.1V的的核酸酶溶液核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMgClRNAase+50mmolMgCl2 2)冰上孵育冰上孵育,但要注意核酸酶本身但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。会出现在图谱中。（5 5）多糖）多糖 多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用用(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4或苯酚或苯酚-NH4CA-NH4CA沉淀后离心，或用超速离沉淀后离心，或用超速离心去多糖。心去多糖。（6 6）脂类）脂类
33、脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。（7 7）酚类）酚类 通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样 品的完全溶解和变性品的完全溶解和变性组成：尿素组成：尿素+去污剂去污剂+（有时）还原剂（有时）还原剂 原理：原理：（1 1）尿素能溶解和解折叠蛋白，
34、最低作用浓度为）尿素能溶解和解折叠蛋白，最低作用浓度为8M8M，硫脲可增加膜蛋白质的溶解，硫脲可增加膜蛋白质的溶解（2 2）去污剂防止疏水相互作用蛋白质聚合，常用）去污剂防止疏水相互作用蛋白质聚合，常用的去污剂有的去污剂有NP-40NP-40、Triton-X100Triton-X100，同时加，同时加4%CHAPS4%CHAPS或或0.25%SDS0.25%SDS效果更好。效果更好。6 6、裂解液的组成、裂解液的组成（3 3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT （二硫苏糖醇）、（二硫苏糖醇）、TDF（二硫赤藓糖）和（二硫赤藓糖）和 TBP（三丁基膦）（三丁基膦
35、）使用注意点：使用注意点：样品离心前在室温下至少保持样品离心前在室温下至少保持1小时，小时，使完全变性和溶解；使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，以防蛋白质修饰；样品含尿素不可加热，以防蛋白质修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同。样品类型不同，选择裂解液的组成也不同。三、蛋白质的分离与二维电泳技术三、蛋白质的分离与二维电泳技术(一一)二维电泳的基本原理二维电泳的基本原理 根据蛋白质的两个一级属性根据蛋白质的两个一级属性等电点等电点和和相对分子量相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（进行等电聚焦分离（IEF
36、IEF），在第二方向按照分子量大），在第二方向按照分子量大小进行小进行SDS-PAGESDS-PAGE分离（十二烷基硫酸钠分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳）。胶电泳）。1D-SDS-PAGE一一 原理原理 在在1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE中，蛋白质样品溶解在通常含有巯基中，蛋白质样品溶解在通常含有巯基还原剂（巯基乙醇或还原剂（巯基乙醇或DDT)DDT)和和SDSSDS的上样缓冲液中。的上样缓冲液中。SDSSDS与蛋白质结合，与蛋白质结合，以与分子质量约恒定的比例将以与分子质量约恒定的比例将负电荷（来自负电荷（来自SDSSDS硫酸基团）传递给蛋白质硫酸基团）传
37、递给蛋白质。高电。高电压下，蛋白质压下，蛋白质-SDS-SDS复合物在交联的聚丙烯酰胺凝复合物在交联的聚丙烯酰胺凝胶上迁移，其速度取决于它们胶上迁移，其速度取决于它们穿越凝胶孔基质的能穿越凝胶孔基质的能力。蛋白质按照分子质量次序分离形成条带。力。蛋白质按照分子质量次序分离形成条带。二二 1D-SDS-PAGE的局限性的局限性 用用1D-SDS-PAGE得到的分离度是相当有限的，显示得到的分离度是相当有限的，显示 含有单一蛋白质的条带实际上可能含有多种蛋白质分子。含有单一蛋白质的条带实际上可能含有多种蛋白质分子。2D-SDS-PAGE一一 两种分离方法的结合两种分离方法的结合 1 1）根据等电点
38、用）根据等电点用IEFIEF分离蛋白质；分离蛋白质；2 2）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的 蛋白质。蛋白质。2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE在第一向电泳根据等电点的不同，在第一向电泳根据等电点的不同，第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质。第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质。二二 新式新式2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE 新系统使用固相新系统使用固相PHPH梯度（梯度（IPG)IPG)胶条和相对简单胶条和相对简单的硬件，能很容易的从的硬件，能很容易的从IPGIPG胶条将蛋白质转移到胶条将蛋白质转移到SDS-PAGESD
39、S-PAGE平板凝胶中。在固相平板凝胶中。在固相PHPH梯度中，聚羧酸梯度中，聚羧酸两性电解质固定在支持物上，产生可重复的两性电解质固定在支持物上，产生可重复的PHPH梯梯度。度。三、三、2D2D凝胶分离蛋白质的染色凝胶分离蛋白质的染色 通过通过2D2D凝胶分离蛋白质的显色使用通常的染色凝胶分离蛋白质的显色使用通常的染色技术，包括银染、考马斯亮蓝和酰胺黑染色。银技术，包括银染、考马斯亮蓝和酰胺黑染色。银染和新的荧光染料是最灵敏的。染和新的荧光染料是最灵敏的。五五 2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE存在的问题存在的问题 1 1）进行可完全重复的）进行可完全重复的2D-SDS-PAGE2
40、D-SDS-PAGE分析是困难的。分析是困难的。2 2）某些蛋白质不适于进行第一维）某些蛋白质不适于进行第一维IEFIEF步骤。许多较步骤。许多较 大的疏水蛋白质在这种类型的分析中结果不理想；大的疏水蛋白质在这种类型的分析中结果不理想；由于蛋白质存在不同等电点的多种形式，蛋白质的由于蛋白质存在不同等电点的多种形式，蛋白质的IEFIEF常把蛋白质分离成许多不连续的条带。常把蛋白质分离成许多不连续的条带。3 3）作为检测技术的蛋白质染色的动态范围相对较小。）作为检测技术的蛋白质染色的动态范围相对较小。点密度最多能反映点密度最多能反映100100倍的蛋白质浓度范围。倍的蛋白质浓度范围。2 2、二维电
41、泳分辨能力、二维电泳分辨能力传统的二维电泳最好条件下传统的二维电泳最好条件下20cm 20cm 20cm 20cm的胶理论上的胶理论上可分辨可分辨10,00010,000个蛋白点（各个方向个蛋白点（各个方向100100点）点）,实际上只实际上只能分辨能分辨30003000个点个点.3 3、二维电泳可提供的数据、二维电泳可提供的数据 二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星满天星
42、”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。量、等电点和相对丰度三方面的数据。4、二维电泳结果说明、二维电泳结果说明二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到的是蛋白质的亚基。最终得到的是蛋白质的亚基。Cell cultureProtein extraction2-DESilver staining Image
43、 analysisScanning四、四、蛋白质的检测技术蛋白质的检测技术 （一）考马氏亮蓝染色（一）考马氏亮蓝染色 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）（红兰色）、R-350（红兰色）、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 mg）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。（二）银染（二）银染1 1、原理：、原理：二维凝胶在固定液中固定
44、后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与Ag+络合，凝胶空白背景中Ag+结合不牢而被冲洗，然后在酸碱环境中络合的Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。2、特点、特点（1）银染分酸性（AgNO3）与碱性（Ag(NH3)2+）两种,酸性染色背景浅、容易控制，碱性灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。（2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。（3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难,增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。(三三)负染负染 1 1、原理（锌、原理（锌-咪唑染料）咪唑染料）咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌咪唑存在时，自由或弱结
45、合的锌离子以锌-咪唑形咪唑形式式 沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固，沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固，留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，就是负染过程。就是负染过程。2、特点、特点（1）负染能提高）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率，胶上蛋白质的回收率，负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶 显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被 检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。（2）显色过程仅需）
46、显色过程仅需5-15min（3）蛋白质易从胶上取出，一般用）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子络合金属离子 就可转移出蛋白质。就可转移出蛋白质。（4）灵敏度）灵敏度15ng。（四）荧光染色（四）荧光染色1 1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3Cy3与甲基与甲基Cy5Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块光标记，并在一块2-DE2-DE胶上进行运行，由于两种染料胶上进行运行，由于两种染料
47、激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。此可用于差异蛋白质组学研究。2、特点、特点（1）灵敏度）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。与银染相近，但线性范围高于银染。（2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。（3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能 基团数不一样，灵敏度变化不一样。基团数不一样，灵敏度变化不一样。二维电泳荧光检测二维电泳荧光检测染
48、色方法染色方法灵敏度灵敏度 线性范围线性范围与质谱兼容性与质谱兼容性费用费用硬件要求硬件要求考染10ng3+银染200pg7+负染15ng3+荧光标记250pg104+（五）总（五）总 结结五、蛋白质序列测定和五、蛋白质序列测定和生物生物 质谱技术质谱技术质谱分析法：质谱分析法：质谱分析法质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成是将化合物形成离子和碎片离子，按其离子和碎片离子，按其质荷比质荷比(/值值)的不同进行的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。蛋白质、多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子蛋白质、多肽质谱是通
49、过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值磁场将具有特定质量与电荷比值(/值值)的蛋白质的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的离子，确定离子的/值，分析鉴定未知蛋白质。值，分析鉴定未知蛋白质。ESIESI：electrosprayelectrospray ionization ionization，电喷雾电离，电喷雾电离MALDIMALDI：matrix-assisted laser desorptionmatrix-assisted lase
50、r desorption ionization ionization，基质辅助激光解吸电离，基质辅助激光解吸电离MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS：matrix-assisted laser desorptionmatrix-assisted laser desorption ionization and Time of Flight,ionization and Time of Flight,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱这两种电离技术可以使核酸或蛋白质、多肽等不易这两种电离技术可以使核酸或蛋白质、多肽等不易挥发的生物大分子产生汽化的带单电荷或
