1、 流式细胞仪原理流式细胞仪原理 及其应用及其应用 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选;研究对象多为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 CD:是cluster of differentiation 的缩写，指的是分化群或分化簇，即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一
2、个分化群，每一CD分子代表一种或一类分化抗原。Antibody：抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的。抗体分子具有结合部位(结合簇)，能与对应的抗原决定簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 Fluorescein：荧光素，是指在一定波长的电磁波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光的一类染料；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、藻红蛋白（R-Phycoeryth
3、rin,R-PE）、别藻青蛋白（allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein,PerCP）等。流式细胞术的特点流式细胞术的特点v 极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。v 可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。v 定性或定量分析细胞：通过
4、荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 v 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小=细胞粒度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面/胞浆/核的特异性抗原=细胞活性=细胞内细胞因子=酶活性=激素结合位点=细胞受体当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势v从相对细胞计数到绝对细胞计数 v从相对定量到绝对定量分析v从单色到多色荧光分析 v从细胞膜成分到细胞内成分分析v从
5、细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析 光学系统 鞘流系统 电子系统 计算机系统 数据转换处理系统流式细胞仪的组成光学系统：光学系统：激发光源：弧光灯和激光两大类激发光源：弧光灯和激光两大类 激光优点：稳定性好、能量高、发散角小；激光分类：气体激光器、染料激光器、半导体激光器 气体激光器：氩离子激光（488nm）氪离子激光（647nm）氦-氖激光（633nm）FACSCaliburTM 采用了氩离子激光（488nm）和波长为635nm的半导体激光器。光信号检测光信号检测 散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward L
6、ight Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALS Sensor光信号检测光信号检测荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含
7、量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量光信号检测光信号检测常见荧光染料的发射波长光信号收集 分光镜 滤光镜：长通（LP）短通（SP）带通（BP）光电信号转换：光电倍增管（PMT）光电二极管荧光补偿原理荧光补偿原理 颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%补偿模型图补偿模型图鞘流系统鞘流系统 流动室Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液鞘液鞘流原理 鞘流公式 Re=dv Re为雷
8、诺（Reynolds）系数，d 为管道直径，v 为液体流速，密度为，黏滞系数为。当Re单核细胞单核细胞成熟粒细胞成熟粒细胞原幼细胞，原幼细胞，在红细胞中不表达；在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞（成熟粒细胞单核细胞单核细胞原幼细胞原幼细胞淋巴细胞）淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性。CD45的临床应用的临床应用 用用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群个群体体，当幼稚细胞达70-80%时，即
9、可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液细胞免疫表型正常人血液细胞免疫表型 T淋巴细胞：淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞，部分细胞CD（16+
10、56）+，无，无CD4+CD8+双双阳性细胞阳性细胞 B淋巴细胞：淋巴细胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞：细胞：CD45+、CD（16+56）+/CD3-单核细胞：单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒细胞：中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比CD33表达更高表达更高 嗜酸性粒细胞：嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比CD33表达更高表达更高正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图正常人骨髓有
11、核细胞免疫表型散点图正常人骨髓细胞免疫表型正常人骨髓细胞免疫表型 淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞）单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系细胞:原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异 巨核细胞：CD45+、CD41+
12、/CD61+幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+Neutrophil Maturation I II III IV V CD 45 CD 33 CD 11b CD 15 CD 34 HLA-DR CD 13 CD 16 Neutrophil Maturation Antigen Density 103 102101 Monocyte Maturation I II III 102 103 101 CD 33 CD 34 CD 11b CD 13 HLA-DR CD 14 Monocytoid Maturation Antigen Density CD 45 CD 15 AMLAML免疫
13、表型免疫表型急性急性T T淋巴细胞白血病（淋巴细胞白血病（T-ALLT-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图骨髓细胞免疫分型散点图急性早幼粒细胞白血病（急性早幼粒细胞白血病（AML-M3AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图骨髓细胞免疫分型散点图FCMFCM在临床白血病分型中的作在临床白血病分型中的作用用能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病（如HCL）免疫分型免疫分型 对下列情况具有重要意义对下列情况具有重要意义 用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞
14、来源的白血病。用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形态学为急性淋巴细胞白血病（形态学为急性淋巴细胞白血病（ALLALL）或急性未分化白）或急性未分化白血病（血病（AULAUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。慢性淋巴细胞白血病。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。微小残留白血病。阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿(PNH)(PNH)=阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜
15、的获得性缺陷，对激活阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血补体异常敏感的一种慢性血管内溶血=患者体内红细胞呈不均一性患者体内红细胞呈不均一性=利用流式细胞术和利用流式细胞术和CD55CD55和和CD59CD59单克隆抗体，对单克隆抗体，对PNHPNH患者红细患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿PNHPNH=正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性=PNH患者血细
16、胞分为三型：型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间 型：CD59表达完全阴性=分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度红细胞红细胞 PNH分析分析 A 正常人正常人B D 病人病人造血干细胞计数造血干细胞计数 造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。胞。造血干细胞的特征是：造血干细胞的特征是：大小（大小（FSCFSC）和颗粒度（）和颗粒度（SSCSSC）介于成熟淋巴细胞、大淋）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似巴细胞相似 细胞内含有较多核酸物质细胞
17、内含有较多核酸物质 CD34 CD34表达弱阳性或强阳性表达弱阳性或强阳性 CD45 CD45表达弱阳性表达弱阳性 在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数造血干细胞计数造血干细胞计数血小板检测血小板检测=血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病CD41-CD61复合物：血小板无力症复合物：血小板无力症CD42a-CD42b 复合物：巨大血小板症复合物：巨大血小板症=血小板活化的相关检查血小板活化的相关检查血小板颗粒膜糖蛋白，如血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如血小板膜糖蛋白活化表位，如
18、PAC-1=血小板减少性疾病血小板减少性疾病血小板自身抗体检测血小板自身抗体检测网织血小板的检测网织血小板的检测=血小板脱落微粒的检测血小板脱落微粒的检测血小板活化血小板活化 IIb/IIIa复合物（复合物（CD41/CD61）在所有静止和）在所有静止和活化的血小板上都有表达活化的血小板上都有表达 血小板活化时发生的改变血小板活化时发生的改变IIb/IIIa复合物发生变构，表达复合物发生变构，表达PAC-1血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达时表达CD62P CD61CD61圈血小板门圈血小板门 PAC-1/PAC-1/1 1：阴性对照
19、，：阴性对照，静止的血小板静止的血小板 PAC-1/CD62PPAC-1/CD62P：试验管，：试验管，ADPADP刺激下活化的血小刺激下活化的血小板，报告血小板活化板，报告血小板活化百分含量百分含量血小板活化血小板活化脑栓塞病人血小板活化检测脑栓塞病人血小板活化检测 A CD61-SSC设分析门设分析门 B 阴性对照阴性对照 C 治疗前治疗前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%血小板活化的意义血小板活化的意义 直接测量循环血小板活化状态与反应性直接测量循环血小板活化状态与反应性 可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板可
20、直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成 心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性 缺血性脑血管病与血小板活化有关缺血性脑血管病与血小板活化有关 子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治疗疗效监测抗血小板治疗疗效监
21、测血小板无力症（血小板无力症（CD41缺陷，缺陷，PAC-I下调）下调）蓝蓝阴性对照阴性对照绿绿病人病人红红正常人正常人巨血小板症巨血小板症 蓝蓝阴性对照阴性对照 绿绿正常人正常人 红红病人病人 CD41表达上调表达上调 CD42a/CD42b缺失缺失血小板自身抗体血小板自身抗体 ITP病人病人流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=免疫功能研究=树突细胞研究=干细胞研究=癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究=血小板分析（心血管疾病）=环境微生物分析=分子生物学研究Cytometric Beads Array CBA系统系统简介简介 CBACBA：流式微球阵列又称液相多重蛋白定量技术，流
22、式微球阵列又称液相多重蛋白定量技术，是指用一系列荧光强度不同的微球，将可溶性微粒是指用一系列荧光强度不同的微球，将可溶性微粒进行捕获并检测的流式技术。每个进行捕获并检测的流式技术。每个CBACBA微球在微球在FL3FL3有有特定的荧光强度，大小一致，包被有适用于特定分特定的荧光强度，大小一致，包被有适用于特定分析（如其他抗体或可溶性蛋白）的特异性抗体，提析（如其他抗体或可溶性蛋白）的特异性抗体，提供了类似供了类似ELISAsELISAs孔板的捕获表面。简而言之，将包孔板的捕获表面。简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。这
23、种技术可大大节约样本用量，避免参数检测。这种技术可大大节约样本用量，避免ELISAsELISAs分析时对样本过度稀释导致分析灵敏度的降分析时对样本过度稀释导致分析灵敏度的降低。低。CBA原理原理操作步骤操作步骤l 检测物与捕获微球共孵育检测物与捕获微球共孵育;l 洗涤洗涤;l 标记荧光探测试剂（标记荧光探测试剂（FITCFITC或或PEPE标记）标记）;l 洗涤洗涤;l 流式细胞仪检测流式细胞仪检测;l CBACBA分析软件批量数据分析分析软件批量数据分析。CBA分析软件分析软件CBA技术 l能够同时对单个样本进行多种检测。能够同时对单个样本进行多种检测。l较传统检测大大节省样本量。较传统检测
24、大大节省样本量。l与与ELISAsELISAs相比灵敏度高、重复性好相比灵敏度高、重复性好。l所有分析只需一组标准曲线。所有分析只需一组标准曲线。l避免酶联反应所致人工假象。避免酶联反应所致人工假象。l节省操作时间。节省操作时间。l节省检测时间。节省检测时间。与传统的与传统的ELISAsELISAs检测相比检测相比细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻（建议用于悬浮细胞）建议用于悬浮细胞）PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合Annexin V Assay/PI能够区分死亡与凋亡能够区分死亡与凋亡Thank you for your attention!
