1、第二章第二章 植植 物物 组组 织织 培培 养养 基基 本本 技技 术术第一节第一节 实验室设置及基本技术实验室设置及基本技术第二节第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分组织培养所需的环境条件及营养成分第三节第三节 培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌第四节第四节 外植体的选择和灭菌外植体的选择和灭菌第五节第五节 外植体的接种和培养外植体的接种和培养第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施第七节第七节 玻璃化现象及其预防措施玻璃化现象及其预防措施第八节第八节 试管苗的驯化和移栽试管苗的驯化和移栽第一节第一节 实验室设置及基本技术实验室设置及基本技术一、实验室组成一、实验
2、室组成二、仪器设备二、仪器设备三、培养器皿三、培养器皿及实验用具及实验用具四、洗涤技术四、洗涤技术五、灭菌技术五、灭菌技术六、无菌操作六、无菌操作 组织培养实验室布局的总体要求组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察一一、实验室组成基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室组织培养准备实验室缓冲室培养室无菌室（一）无菌室（二）无菌室
3、（二）二、仪器设备1、基本仪器设备136 6912 1358 冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。冰箱酸度计电炉天平纯水器培养基分装器搅拌器2、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜干热消毒柜无菌瓶顶过滤装置无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器喷雾消毒器（参考图）（参考图）3、无菌操作设备、无菌操作设备 超净工作超净工作台台无菌接种箱无菌接种箱4、细胞培养设备、细胞培养设备 摇 床培养架培养架HZC-250恒温振荡培养箱 150C 250D 光照培养光照培养箱
4、箱 5、细胞学鉴定设备、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜光学显微光学显微镜镜1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子 解剖刀接种针四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤、玻璃器皿洗涤新购置玻新购置玻璃器皿璃器皿1%稀HCl浸渍浸渍12h洗衣粉洗衣粉洗涤洗涤清水清水冲洗冲洗晾干晾干备用备用已用过的已用过的玻璃器皿玻璃器皿2、塑料用品洗涤、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用新的塑料器皿打开即用已用过的已用过的塑料器皿塑料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水清水冲洗冲洗2%5%盐盐酸浸泡酸浸泡30min清水清水冲洗冲洗蒸馏水蒸馏水冲洗冲洗晾干备
5、用晾干备用3、金属用品洗涤、金属用品洗涤热洗衣粉水热洗衣粉水洗净洗净冲洗冲洗擦干擦干五、灭菌技术五、灭菌技术物理方法：物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤除菌等除菌等化学方法：化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法、灭菌方法2、灭菌、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa 温度在121 灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力饱和蒸汽压力温度（温度（）饱和蒸汽压力饱和蒸汽压力温度（温度（）kg/cm21
6、b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿灭菌：塑料器皿灭菌：多采用多采用高压蒸汽消毒灭菌高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：）金属用具灭菌：灼烧灭菌灼烧灭菌 浸入浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用却后使用（
7、5）接种室灭菌）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室接种室超净工超净工作台作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射（6）外植体灭）外植体灭菌菌流水冲洗流水冲洗1020min或更长时间或更长时间70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗45次次在在10%的次氯酸钠、的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡饱和漂白粉浸泡30min左右左右备用备用常用消毒剂消毒灭菌比较表常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度（%）去除难易去除难易消毒时间消毒时间（min）效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水
8、溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好六、无菌操作六、无菌操作实验员消毒实验员消毒实验室、无实验室、无菌台灭菌菌台灭菌实验器材实验器材的灭菌的灭菌无菌接种无菌接种消消 毒毒实验台实验台卫生卫生培养室培养室培养培养1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，、
9、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射照射40min左右，后关闭。左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。和四周的台壁。4、用、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。的酒精擦拭工作台和双手。5、用沾有、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培养酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。、在酒精灯火焰附近切割备
10、用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。口各部分都烧到。9、取下接种器械，在火焰上消毒。、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操作期间应经常用注意：操作期间应经常用70%70%75%75%的酒精擦拭工的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在作台和双手；接种器械应反复在95%95%的酒精中浸泡的酒精中浸泡和在火焰上消毒。和在火焰上消毒。第二节第二节 植物组织培养所需的环境植物组织培养所
11、需的环境 条件及营养成分条件及营养成分一、环境条件一、环境条件 与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到到温度、光照、湿度温度、光照、湿度等各种物理条件，不同等各种物理条件，不同气体、培养气体、培养基基的组成、的组成、pH值值和和渗透压渗透压等各种化学条件，以及等各种化学条件，以及外植体外植体部位、大小、细胞密度部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。重要问题。温度温度光照光照湿度湿度气体气体渗透压渗透压
12、pH值值一般最适温度在一般最适温度在252之间之间环境条件环境条件最常用的是最常用的是光照光照16h，黑暗，黑暗8h 一般情况下，培养器内相对湿度应达一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在培养室内环境的相对湿度在70%80%氧气氧气是愈伤组织生长所必需的是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从调节渗透压常常从糖糖入手入手 培养基的培养基的pH值大多在值大多在5.06.5，5.8二、营养成分二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：在植物体内起到一定的生理作用：a a、组成各
13、种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡点等化学方面的作用；定、电荷平衡点等化学方面的作用；d d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。器官建成。Arnon和和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元）提出的确定植物必需营养元素的素的3个标准个标准:阿隆和斯托德
14、阿隆和斯托德 A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。国内外公认的高等植物所必需的营养元素有国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：）种：C、H、O、N、P、K、Ca、
15、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等等9种种微量营养元素：占干物质重量的微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下以下 有的只含有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等等7种种按照国际植物生理协会的建议：按照国际植物生理协
16、会的建议：所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为大量元素的元素为大量元素 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为微量元素的元素为微量元素1、大量元素、大量元素N N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。占有重要的位置。P P是磷脂的主要成分。培养基中常用是磷脂的主要成分。培养基中常用KHKH2 2POPO4 4 NaHNaH2 2POPO4 4等。等。K K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等对碳水化合物合成
17、，转移，以及氮素代谢等有密切关系。有密切关系。MgMg、S S、CaCa是叶绿素的组成成分，又是激酶的是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S S是含是含S S氨基酸的蛋白质的组成成分。氨基酸的蛋白质的组成成分。CaCa是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，膜结构有显著作用，此外，CaCa及钙调素在细胞及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。信号转导中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，铁铁的使用最大：的使用最大：一些氧化酶的组成成分一些氧化酶的
18、组成成分 叶绿素形成的必要条件叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-FeEDTA-Fe）鳌合）鳌合物防止铁的沉淀物防止铁的沉淀 硼硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长长 锰锰参与植物的光合、呼吸代谢参与植物的光合、呼吸代谢 钼钼参与氮素的代谢参与氮素的代谢 氯氯是光合作用水光解的活化剂是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激酶的辅助因子或激活剂活剂参与代谢的调节参与代谢的调节。缺铁症状缺铁症
19、状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。桃树桃树缺铜症状：缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的的芽开始生长，形成丛生的细枝。细枝。菊花菊花缺锰症状：缺锰症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间叶
20、脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。由幼叶开始。菜豆菜豆梨缺锰症梨缺锰症缺钼症状：缺钼症状：叶较小，叶脉间失绿叶较小，叶脉间失绿,有有坏死斑点，且叶边缘焦坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。且枯焦。白菜白菜缺硼症状：缺硼症状：受精不良，籽粒减受精不良，籽粒减少少，“花而不实花而不实”，“蕾而不花蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生停止生长，而形成簇生状；状；常引起各种腐烂病。常引起各种腐烂病。马铃薯马铃薯缺锌症状：缺锌症状：小叶病
21、，叶片变小叶病，叶片变小，两节之间小，两节之间缩短。叶脉间缩短。叶脉间失去绿色或者失去绿色或者变白。变白。植物缺素症植物缺素症缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短；节间变短；缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；缺锰缺锰：新叶脉间
22、失绿；：新叶脉间失绿；缺铁缺铁：叶片黄，叶脉绿；：叶片黄，叶脉绿；缺硼缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；缺锌缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；缺铜缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；缺钼缺钼：不能形成花器或花早落。：不能形成花器或花早落。3、碳源、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以酸，以糖类糖类物质最重要。物质最重要。糖类物质特点：糖类物质特点：具有遇热易变具有遇热易变 利于吸收和利
23、用利于吸收和利用 使用浓度一般在使用浓度一般在2%-5%2%-5%提供能源和调节渗透压提供能源和调节渗透压 4、维生素类、维生素类 以各种以各种辅酶辅酶的形式存在的形式存在 参与多种代谢活动参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为主要分为脂溶性维生素脂溶性维生素和和水溶性维生素水溶性维生素 常用维生素有常用维生素有V VB1B1和和V VB6B6 5、肌醇、肌醇 环己六醇环己六醇 细胞壁的构建材料细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动生理活动 促进活性物质发挥作用促进活性物质发挥作用6、
24、氨基酸、氨基酸 蛋白质的组成成分蛋白质的组成成分 有机氮源有机氮源 可直接被细胞吸收利用可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是培养基中常用的是甘氨酸甘氨酸7、天然复合物、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂化学成分不明、复杂 天然营养混合物天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、琼脂、琼脂 是使用最普遍的凝固剂是使用最普遍的凝固剂用量一般在用量一般在6-10g/L6-10g/L之间之间颜色以浅、透明度高的好，洁净为上品颜色以浅、透明度高的好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使除了琼脂
25、外，在组织培养中还可以使用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。9、活性炭、活性炭 吸附培养基及培养物吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分促进培养物生长和分化化 促进生根促进生根10、抗生素、抗生素 防止外植体内生菌造防止外植体内生菌造成的污染成的污染活性炭活性炭1111、生长素类、生长素类 促进细胞伸长和分裂促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成诱导愈伤
26、组织形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH中，后者的溶解效中，后者的溶解效果更好果更好 常用的生长素：常用的生长素：IAA(IAA(吲哆乙酸吲哆乙酸)NAA(NAA(奈乙酸奈乙酸 )2,4-D(2,4-D(二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)IBA(IBA(吲哆丁酸吲哆丁酸)1212、细胞分裂素类、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控用于离体成花的调控 溶于溶于0.5-1.0mol/L0.5-1.0mol
27、/L的盐酸或稀薄的的盐酸或稀薄的NaOHNaOH中中 常用的细胞分裂素：常用的细胞分裂素：KT(KT(激动素激动素)BA(6-BA(6-卞基腺嘌呤卞基腺嘌呤)2-ip(2-ip(异戊烯氨基嘌呤异戊烯氨基嘌呤)玉米素玉米素13、赤霉素类和脱落酸、赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类、赤霉素类 组织培养中不常使用组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂促进细胞的分裂 主要是主要是GAGA3 3 B B、抑制细胞分裂和伸长抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力促进休眠和提高抗逆能力培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养基形态不同：固体培
28、养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基营养水平不同：基本培养基、完全培养基一、培养基的种类一、培养基的种类第三节第三节 培养基的配制、灭菌与保存培养基的配制、灭菌与保存1 1、MSMS培养基培养基 无机盐浓度高无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐含有一定数量的铵盐 营养丰富营养丰富 不需要添加更多的有机附加物不需要添加更多的有机附加物二、几种常见培养基的特点二、几
29、种常见培养基的特点2 2、WhiteWhite培养基培养基 19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 1963 1963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素含量含量微量元素微量元素含含量量铁盐铁盐含量含量有机物有机物含含量量其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4
30、4H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺盐酸硫胺素素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆盐酸吡哆辛辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基3 3、B5B5培养基培养基 19681968年由年由GamborgGamborg等为培养大豆根细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l)KNO3 2500 FeSO47H2O27.
31、8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40(NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵素 10 Na2-EDTA37.3 B5培养基的组成和配方4 4、N6N6培养基培养基 19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3 KNO3和（和（N
32、H4NH4）SO4SO4含量高，不含钼含量高，不含钼组成成分 数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8(NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培养基组成及配方配制培养基应做好几点工作：配制培养基应做好几点工作：1 1、实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、实验用具的准备。包括配制
33、过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备清洗和准备.2 2、试剂、药品的准备、试剂、药品的准备3 3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量物的量三、培养基的配制具体操作如下：具体操作如下：1 1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2 2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元、根据
34、计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质素、铁盐、有机物、生长调节物质母液母液及其他特及其他特殊的附加物，搅拌均匀；殊的附加物，搅拌均匀；3 3、加水、加水定容定容至规定体积，搅拌均匀；至规定体积，搅拌均匀；4 4、调整培养基的、调整培养基的pHpH值；值；5 5、分装（倒）；、分装（倒）；6 6、封口（拧盖）。、封口（拧盖）。组织培养必须在无菌环境中进行，因组织培养必须在无菌环境中进行，因此培养基的灭菌操作非常重要。此培养基的灭菌操作非常重要。培养基分装封口后立刻进行灭菌，至培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在少在24h24h内完成灭菌程序。内完成灭菌程序。一般采用的
35、是一般采用的是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌。四、培养基的灭菌四、培养基的灭菌 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵、灭菌过程中，应尽量保持压
36、力恒定，严格遵守灭菌时间；守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。、高压锅工作时，应有专人看守。高压灭菌的原理在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，的压力下，锅内温度达锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽
37、孢。很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意事项注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到力表上升
38、达到0.1MPa时时,开始计时，维持压力开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。分钟。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在克水在100时，由气态变时，由气态变为液态时可放出为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅（千焦）的热量。这种
39、潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出
40、烧瓶口或降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。验灭菌效果。检验方法：检验方法：将培养基置于培养室中将培养基置于培养室中3 3天，若没有污染现象，天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。说明灭菌可靠，可以使用。保存在低温条件下。常温下保存时要进行防保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。尘和避光处理。保存时间不可过长。保存时间不可过长。五、培养基的保存五、培养基的保存第四节第四节 外植体的选择和灭菌外植体
41、的选择和灭菌 一、一、外植体的选择外植体的选择 二、二、外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 三、三、污染原因和预防措施污染原因和预防措施 一、外植体的选择一、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：植物组织培养的主要过程大致包括：外植体的外植体的选择选择、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。境条件的调控。1 1、选择优良的种质、选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，选取性状
42、优良的种质，或或特殊的基因型特殊的基因型。对材料。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。成功机率，增加其实用价值。2 2、选择健壮的植株、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，的植株上，选取发育正常的器官或组织选取发育正常的器官或组织。因为这些。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。成功。3 3、选择最适的时期、选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节组织培养选择材料
43、时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高速度快，增殖率高。4 4、选取适宜的大小、选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。
44、如。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。二、外植体的灭菌方法二、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂灭菌剂次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂漂 白白 粉粉氯氯 化化 汞汞酒酒 精精过氧化氢过氧化氢溴溴 水水硝硝 酸酸 银银使用浓度（使用浓度（%）9 910102 2饱和浓度饱和浓度0.10.11 170707575101012121 12 21 1清除的难易清除的难易易易易易易易较难较难易易最易最易易易较难较难消毒时间
45、消毒时间5 530305 530305 530302 210100.20.22 25 515152 210105 53030效效 果果很好很好很好很好很好很好最好最好好好好好很好很好好好2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行先要进行预处理预处理。植物材料一般采取的预处理。植物材料一般采取的预处理方法是：方法是：先对植物组织进行修整，去掉不需要先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很干净。经过预处理的植物
46、材料，其表面仍有很多多细菌细菌和和真菌真菌，因此还需进一步灭菌。，因此还需进一步灭菌。常规的表面灭菌处理方法常规的表面灭菌处理方法把材料放进把材料放进70%的酒精中约的酒精中约30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡5 10min。或用或用10%的的次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液浸浸泡泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗35次。次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。的接触。在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%的的Tween20（吐温）（吐温）或或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。湿润剂，则灭菌效果更好。
47、三、污染原因和预防措施三、污染原因和预防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在组织培养过程中培养基和培养材是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。未遵守操作规程等引起的。细菌污染的特点细菌污染的特点：是在材料附近的培养基中出是在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾
48、状痕迹。现浑浊和云雾状痕迹。一般在接种后一般在接种后12天即可天即可发现。发现。原因：材料带菌；原因：材料带菌；培养基灭菌不彻底；培养基灭菌不彻底；操作人员未遵守操作规程。操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。真菌污染的特点真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块。或绿等不同颜色菌丝块。在接种后在接种后310天才能发天才能发现。现。原因：周围环境不清洁；原因：周围环境不清洁；超净工作台的过滤装置失效；超净
49、工作台的过滤装置失效；培养瓶等器皿的口径过大。培养瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。环节注意防止污染的发生。2 2、污染的预防措施、污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高
50、压灭菌，再清除污染物，然先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施施:1）防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。枝条先进行预培养。u枝条枝条 水洗净水洗净 插入无糖的营养液或自来水插入无糖的营养液或自来水 抽枝抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。接种。这样便可大大减少材料的污染。u在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待在无菌条件下
