1、第二章第二章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 Chapter 2 Methods in Cell Biology Research 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法Methods for observing cell morphology and structures 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法Methods for analyzing cell constituents 细胞培养、细胞工程细胞培养、细胞工程Cell culture and cell engineering 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化Dynamic analysis of
2、biological macromolecules in cells 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生物Model organisms in cell biology 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法各类细胞直径的比较 显微镜显微镜电子显微镜电子显微镜复式显微镜复式显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光学显微镜光学显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜 研究用显微镜研究用显微镜单式显微镜单式显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜扫描隧道显微镜扫描隧
3、道显微镜光学显微镜的分辨率光学显微镜的分辨率resolution of optical microscope分辨率分辨率(resolution)区分开两个质点间的最区分开两个质点间的最小距离小距离.对任何显微镜来说，最重要的性能参数是对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分分辨率辨率，而不是放大倍数。而不是放大倍数。普通光镜的最大分辨普通光镜的最大分辨率是率是0.2m。0.2um0.2um0.2nm0.2nm0.1nm0.1nm一、普通复式光学显微镜技术一、普通复式光学显微镜技术1 1、普通光学显微镜、普通光学显微镜 light microscope2、相差显微镜、相差显微镜 phase con
4、trast microscope 将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对比度，构造上的特殊之处：比度，构造上的特殊之处：环形光阑环形光阑（condenser annulus）相位板相位板（annular phase plate）用途：用途：可以观察未经染色的标本和活细胞可以观察未经染色的标本和活细胞F.Zernike于于1935年发明并年发明并因此获因此获1953年年诺贝尔物理奖诺贝尔物理奖倒置相差显微镜倒置相差显微镜 inverted phase contrast microscope物镜与照明系统颠倒，前者物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之
5、下，后者在载物在载物台之下，后者在载物台之上，可以台之上，可以用于观察培养用于观察培养皿中的活细胞。皿中的活细胞。3、微分干涉显微镜、微分干涉显微镜 differential interference contrast(DIC)microscope 在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的能显示结构的三维立体投影。三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强与相差显微镜相比，立体感更强4、荧光显微镜、荧光显微镜 fluorescence microscope 为落射式照明，即光源通
6、过物镜投射于样品为落射式照明，即光源通过物镜投射于样品 光源为波长较短的光，分辨力强光源为波长较短的光，分辨力强 用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光集多种功能于一体的集多种功能于一体的万能研究显微镜万能研究显微镜兼有明视野、相差、兼有明视野、相差、微分干涉、荧光、显微分干涉、荧光、显微摄影等功能，是高微摄影等功能，是高级研究仪器。级研究仪器。5、激光共聚焦扫描显微镜、激光共聚焦扫描显微镜 laser confocal scanning microscope 激光作光源；激光作光源；通过检测器前小孔成像；通过检测器前小孔成像；扫描激光聚焦点也是瞬时扫
7、描激光聚焦点也是瞬时成像焦点成像焦点共聚焦。共聚焦。分辨力为普通光镜的分辨力为普通光镜的1.4-1.7倍倍.Epi-fluoresceneConfocal荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较（小鼠肾小球）（小鼠肾小球）Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin,a green-fluorescent lectin,was used to label elements of the glomeruli and convoluted tubules.The filamentous actin prevalent in glomeruli
8、and the brush border were stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin.The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI.Molecular Probes FluoCells prepared slide#3(F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30 OilZeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr荧光观察细胞结构荧光观察细胞结构细胞内的动态变化细胞内的
9、动态变化FRETFRP鲁斯卡鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，德国物理学家，1932年研制年研制第一台电子显微镜，第一台电子显微镜，1986年获诺贝尔物理奖。年获诺贝尔物理奖。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术 Electron microscopy 1 1、光镜与电镜的主要区别、光镜与电镜的主要区别（1）光源不同）光源不同:可见光可见光/紫外线紫外线-电子束电子束（2）透镜不同）透镜不同:玻璃玻璃-电磁透镜电磁透镜（3）真空）真空（4）显示记录系统）显示记录系统（5）分辨率）分辨率:0.2 um-0.2 nm1、透射电子显微镜、透射电子显微镜 transmission electr
10、on microscope,TEM 透射式电子显微镜透射式电子显微镜用于观察小于用于观察小于0.2m的细微结的细微结构构，称为亚显微结构，称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构或超微结构（ultramicroscopic structures）.Figure 3-20.Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions.超薄切片制样技术超薄切片制样技术 取材取材 固定固定 脱水脱水 渗透、包埋渗透、包埋 超薄切片超薄切片 厚度厚度40-
11、50nm 染色染色电镜的实际分辨率电镜的实际分辨率与切片厚度有关与切片厚度有关负染色技术负染色技术 Negative staining 负染色负染色是用重金属盐对铺展在载网上的样品进是用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬从而衬托出样品的精细结构托出样品的精细结构。Figure 3-29.Electron micrograph of negatively stained actin filaments.Each filament is about
12、8 nm in diameter and is seen,on close inspection,to be composed of a helical chain of globular actin molecules.(Courtesy of Roger Craig.)亦称冰冻断裂，亦称冰冻断裂，主要主要用来观察膜断裂面的蛋白用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构质颗粒和膜表面结构。冷冻蚀刻电镜技术冷冻蚀刻电镜技术 Freeze Etching electron microscopy2、扫描电子显微镜、扫描电子显微镜 scanning electron microscope,SEM 20
13、世纪世纪60年代问世，年代问世，用来观察标本的表面结构用来观察标本的表面结构 目前扫描电镜的分辨力为目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。Figure 3-23.Scanning electron microscopy.Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog(A).For comparison,the same structure is shown by differential-interference-contrast
14、 light microscopy(B)and by thin-section electron microscopy(C).三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope,STM Binnig和和Rohere 1981年发明，年发明，1986年获奖；年获奖；可观察到原子级的图像。可观察到原子级的图像。A.X-ray crystallography X射线衍射射线衍射B.NMR spectroscopy核磁共振成像核磁共振成像第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用离心技术分离细胞器与生物大分子一、用离心技术分离细胞器与生物大分
15、子 普通离心机：转速普通离心机：转速25000 r/min 超速离心机：超速离心机：30000 r/min 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器于分离不同大小的细胞和细胞器。1 1、差速离心、差速离心 differential centrifugation 细胞器沉降顺序：核、线粒细胞器沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体。内质网与高基体。2 2、密度梯度离心、密度梯度离心 density gradient centrifugation 用介质在离心管内形成连续或不连续的
16、密度梯度，用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，通过离心力场细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。的作用使细胞分层、分离。常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖 分为分为速度沉降速度沉降（velocity sedimentation）和和等等密度沉降密度沉降（equilibrium sedimentation）。其它生化分离方法其它生化分离方法纸色谱柱色谱亲和色谱Figure 3-42.SDS polyacrylamide-gel electrophoresis(SDS-PAGE).Figure 3-44
17、.Separation of protein molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45.Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显示方法的显示方法 为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理加以显示，称为加以显示，称为组织化学和细胞化学染色组织化学和细胞化学染色方法方法（histochemica
18、l and cytochemical staining method）；如：细胞内如：细胞内DNA和和RNA的原位显示的原位显示 Myofibrillar ATPase:Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀脱氢酶):Identifying Oxidati ve Potential Promoter:GUS 是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物合，对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物有荧光素和酶有荧光素和酶 免疫荧光法免疫荧光
19、法（immunofluorescent technique）酶标免疫法酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）免疫细胞化学免疫细胞化学 immuno-cytochemistry二、细胞内特异蛋白质的定位和定性免疫荧光法免疫荧光法酶标免疫法酶标免疫法 利用分子探针检测细胞内特殊利用分子探针检测细胞内特殊DNA序列、和序列、和RNA基因表达的方法。基因表达的方法。四、细胞内特异核酸序列的定位和定性原位杂交（in situ hybridization）人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片果蝇果蝇HBHB基因表达的基因表达的原位杂交照
20、片原位杂交照片五、定量细胞化学分析技术 对单个细胞进行快对单个细胞进行快速定量分析分选的速定量分析分选的一门技术；一门技术；流式细胞术 flow cytometry第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 活体或在体活体或在体(in vivo in vivo)离体或体外离体或体外(in vitro in vitro)细胞培养细胞培养 (cell culture)(cell culture)就是选用最佳生存条就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术；件对活细胞进行培养和研究的技术；原代培养原代培养(primary culture)：从动物机体取出：从
21、动物机体取出进行培养的细胞群。进行培养的细胞群。传代培养传代培养(passage)：将细胞从一个培养瓶转移将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养传代培养。细胞株细胞株(cell strain)和和细胞系细胞系(cell line)一、动物细胞培养一、动物细胞培养cell culture二、植物细胞培养二、植物细胞培养 组织培养组织培养(tissue culture)：诱发产生愈伤组织，诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培养出再生植株诱导再分化可培养出再生植株 单倍体培养单倍体培养(haploid culture)：花药或花粉培养：花药或花粉培养获得单
22、倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体的个体 原生质体培养原生质体培养(protoplast culture)：两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为过程称为细胞融合细胞融合(cell fusion)或或细胞杂交细胞杂交(cell hybridization)基因型相同的细胞融合称为基因型相同的细胞融合称为同核体同核体；来自不同；来自不同基因型的杂交细胞称为基因型的杂交细胞称为异核体；异核体；诱导方法诱导方法：生物：生物(病毒病毒)、化学、化学(PEG)、物理、物理(电激、电激、激光激光)。三、细胞工程
23、三、细胞工程 细胞融合细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术 monoclonal antibody technique英国人英国人Kohler和和Milstein 1975年将两种年将两种细胞杂交而创立了单克细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获隆抗体技术，获1984年年诺贝尔奖诺贝尔奖显微操作技术显微操作技术 micromanipulation technique第四节第四节 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化一、荧光漂白恢复一、荧光漂白恢复（fluorescence photobleaching recovery,FRP）技术技术荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(fluore
24、scence recovery after photobleaching,FRAP)二、荧光共振能量转移技术二、荧光共振能量转移技术fluorescence resonance energy transfer三、单分子技术三、单分子技术single molecule techniques 光镊光镊（Optical tweezers）磁镊磁镊（magnetic tweezers）原子力显微镜原子力显微镜（atomic force microscopy）How do muscles produce works?研究生物大分子在细胞内合成、分布、定位等；研究生物大分子在细胞内合成、分布、定位等；一般
25、用一般用3H，14C，32P，35S，135I，45Ca等；等；放射性同位素标记放射性同位素标记切片或涂片切片或涂片 曝光曝光 观察观察五、放射自显影技术五、放射自显影技术 radioautography135I四、酵母双杂交yeast two-hybrid system 研究蛋白质和研究蛋白质和蛋白质之间的蛋白质之间的相互作用。相互作用。线虫线虫果蝇果蝇拟南芥第四节第四节 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生物大肠杆菌酵母小鼠作业题作业题名词：名词：ultramicroscopic structure,flow cytometry phase contrast microscope，in vivo,in vitro,immunocytochemistry，cell culture,monoclonal antibody 用于细胞生物学研究的显微镜有哪些？其主要用途？如何分离细胞中的细胞器，如线粒体和细胞核?如何对细胞中的特异蛋白质和mRNA进行定位？你对于细胞工程技术及应用有哪些了解？举例说明单分子技术在细胞生物学研究中的应用。
