1、2.1 细菌的基本知识2.1.1细菌的形态球菌(Coccus)杆菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形状的细菌Microbiohydrometallurgy第二章：浸矿用细菌2.1.1细菌的形态Microbiohydrometallurgy细菌的分类a)球菌(Coccus)b)杆菌(Bacillus)c)螺旋菌(Spirlla)d)其他形状的细菌Microbiohydrometallurgy球菌(Coccus)球菌单球菌双球菌四联球菌八叠球菌葡萄球菌链球菌MicrobiohydrometallurgyMicrobiohydrometallurgy单球菌（显微镜下图）单球菌(sin
2、gle coccus)Microbiohydrometallurgy双球菌(double coccus).双球菌（显微镜下示意图）肺炎双球菌四联球菌(Micrococcus lactis)Microbiohydrometallurgy四联球菌显微镜下示意图 电镜照片八叠球菌(Sarcina ureae)八叠球菌（显微镜下示意图）Microbiohydrometallurgy尿素八叠球菌葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Microbiohydrometallurgy 电镜照片(SEM)显微镜下的金黄色葡萄球菌链球菌链球菌（显微镜下示意图）链球菌（SEM照片）Microbioh
3、ydrometallurgy杆菌（bacillus）显微镜下的杆菌示意图Microbiohydrometallurgy螺旋菌（Spirlla)Microbiohydrometallurgy 弧菌(vibrio)螺菌(spirllum）螺旋体(spirochaeta)显微镜下的螺旋菌Microbiohydrometallurgy 幽门螺旋菌左：显微数码摄像右：结构示意图Microbiohydrometallurgy特殊形态的细菌Microbiohydrometallurgy2.1.2 细菌细胞的结构细菌细胞的结构 Microbiohydrometallurgy细菌细胞的结构 A.细胞壁B.细胞壁
4、以内的构造原生质体C.细胞壁以外的构造Microbiohydrometallurgy（一）细胞壁（cell wall)a.细胞壁的结构b.细胞壁的功能c.细胞壁的化学组成d.无壁细胞与原生质体e.观察细菌的方法Microbiohydrometallurgya.细菌细胞壁（cell wall）的结构Microbiohydrometallurgyb.细胞壁的功能n固定细胞外形n协助鞭毛运动n保护细胞免受外力的损伤n为正常细胞分裂所必需n阻拦有害物质进入细胞n与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性密切相关Microbiohydrometallurgyc.细胞壁化学组成高等植物 纤维素 霉菌 几丁质
5、酵母 甘露聚糖，葡聚糖 细菌肽聚糖N乙酰葡萄糖胺N乙酰胞壁酸短肽脂多糖磷壁酸Microbiohydrometallurgyd.无壁细胞细胞与原生质体Microbiohydrometallurgye.观察细菌的方法(1)观察工具(2)观察方法Microbiohydrometallurgy(1)观察工具（tools）普通光学显微镜（Microscope）暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜电子显微镜（SEM）Microbiohydrometallurgy相差显微镜其基本原理：把透过标本的可见光的相 位差变成振幅差，从而提高了标本内各种结构之间的对比度，使标本中 的结构清晰可辨；若观察生长在培养瓶中的生
6、物细胞，则需应用倒置相差显微镜。它与相差显微镜基本相同，它的特点是物镜安装在载物台的下方，光源及长焦距聚光器安装在载物台的上方；可以对体外培养细胞进行长时间观察、拍照、摄电影及录像等以记录生活细胞的行为。Microbiohydrometallurgy暗视野显微镜暗视野显微镜由於不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体，当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由於物体(标本)所在的位置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的变化。Microbiohydrometallurgy萤光显微镜在萤光显微镜上，必须在
7、标本的照明光中，选择出特定波长的激发光，以产生萤光，然后必须在激发光和萤光混合的光线中，单把萤光分离出来以供观察。因此，在选择特定波长中，滤光镜系统，成为极其重要的角色。萤光显微镜原理：(A)光源：光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。(B)激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。(C)萤光标本：一般用萤光色素染色。(D)阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。Microbiohydrometallurgy扫描是电子显微镜（SEM）SEM特别适用於研究标本表面的细微构造 先标本表面先镀上一薄薄的一层黄金l利
8、用电子束扫描标本表面电子束激发了标本表面的电子被激发的电子被聚集后再聚焦於萤幕上（显现标本表面的形态）SEM的景深很深可供显示三度空间的形态 3.缺点：(1)先前用来处理标本的化学或物理方法会杀死细胞(2)显微照片上会出现一些活细胞所没有的添加物 Microbiohydrometallurgy（二）观察的方法细菌染色法死菌正染色负染色：简单染色法鉴别染色法 革兰氏染色法 抗酸性染色法芽孢染色法荚膜染色法等 姬姆萨染色法活菌:用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑）等作活菌染色Microbiohydrometallurgy细胞壁与革兰氏染色Microbiohydrometallurgy甲菌乙菌媒染碘液脱
9、色乙醇复染沙黄紫色（G）红色(G-)初染结晶紫（二）细胞壁以内的构造原生质体1.细胞膜（cell membrane）2.细胞质和内含物(cytoplasm andinclusion body)3.核区(nuclear region or area)4.特殊的休眠构造芽孢(endospore,spore)Microbiohydrometallurgy细胞膜（cell membrane）Structure of Cytoplasmic MembraneMicrobiohydrometallurgy细胞膜示意图Microbiohydrometallurgyabcdefa:内嵌蛋白;b、c:内嵌蛋白或
10、整合蛋白d:外周蛋白;e:多酶复合体;f:脂双分子层（三）细胞壁以外的构造Microbiohydrometallurgy糖被（glycocalyx）鞭毛 (flage,复flaglla)菌毛（fimbria,复fimbriae）性毛（pili,单数pilus）各种鞭毛的形态Microbiohydrometallurgy2.2 浸矿用细菌浸矿用细菌的分类：中温细菌中等嗜热细菌高温菌Microbiohydrometallurgy氧化亚铁硫杆菌（T.f）氧化硫硫杆菌（T.t）氧化亚铁微螺菌（L.f）Thiobacillus caldus嗜热铁氧化钩端螺菌（L.t）耐热氧化硫硫杆菌（S.f）硫化叶菌氨
11、基酸变性菌2.2.1 浸矿微生物种类浸矿微生物种类自养菌：自养菌：在生长和繁殖过程中，不需要任何有机在生长和繁殖过程中，不需要任何有机 营养，而是完全靠各种无机盐而生存的营养，而是完全靠各种无机盐而生存的 这类微生物。这类微生物。异养菌：异养菌：需要提供现成有机营养才能生存的一类需要提供现成有机营养才能生存的一类 微生物。微生物。与矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，与矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得到实际应用的主要是自养类微生物。到实际应用的主要是自养类微生物。自养化能菌的特征1)靠氧化培养基中的亚铁离子
12、或硫化合物取得能量以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞。2)菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。3)除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。说明：氧化硫硫杆菌、氧化铁铁杆菌和氧化铁硫杆菌三种自养菌的性能十分相近，而且难以将它们分开，所以有人视它们为一种菌，定名为氧化铁硫杆菌。2.2.2 中温细菌中温浸矿细菌中最重要的是矿质化学营养细菌，它们嗜酸 最适pH1.52.0,专性自养,最适生长温度为 25 35.通常只存活一个星期左右，它可将硫代硫酸盐氧化成元素硫，又将元素硫氧化成硫酸。Microbiohydrome
13、tallurgy2.2.2.1 氧化亚铁硫杆菌氧化亚铁硫杆菌(T.f菌菌)(氧化亚铁硫杆菌氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans简称简称T.f)T.f 菌被认为是酸性环境中浸矿的主导菌种菌被认为是酸性环境中浸矿的主导菌种,T.f菌主要代菌主要代谢是氧化谢是氧化Fe2+为为 Fe3+而获得能量而获得能量,亦可氧化硫化矿物、元亦可氧化硫化矿物、元素硫、及可溶硫化合物素硫、及可溶硫化合物,如硫代硫酸盐如硫代硫酸盐,甚至可氧化溶液甚至可氧化溶液中的一价铜离子及二价锡离子中的一价铜离子及二价锡离子,并对溶液中的并对溶液中的 Cu2+,Ca2+,Mg2+,Fe3+,Ag+,Au+
14、等金属离子具有一定的耐受力等金属离子具有一定的耐受力,同时同时固定二氧化碳以生长。该菌种浸矿的适宜温度为固定二氧化碳以生长。该菌种浸矿的适宜温度为 3035,温度过高或过低温度过高或过低,其浸矿性能均下降。其浸矿性能均下降。MicrobiohydrometallurgyT.f菌菌 的的SEM 照片照片 图 T.f 菌 的一组SEM 照片 Microbiohydrometallurgy2.2.2.2 氧化硫硫杆菌氧化硫硫杆菌(T.t菌菌)n氧化硫硫杆菌氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thooxidans简称简称T.t)这种菌不能氧化亚铁离这种菌不能氧化亚铁离子子,但能够生长在元素硫但能够
15、生长在元素硫及一些可溶性硫化合物及一些可溶性硫化合物上上,将浸出过程中产生的将浸出过程中产生的元素硫氧化。能增强浸元素硫氧化。能增强浸矿作用。矿作用。Microbiohydrometallurgy图 T.t 菌 的SEM 照片 2.2.2.3 氧化亚铁微螺菌氧化亚铁微螺菌(L.f菌菌)n氧化亚铁微螺菌氧化亚铁微螺菌(Leptospirillum ferrooxidans简称简称L.f)1974 年年,Balashova 等人从等人从 Armenia 铜矿分离出铜矿分离出L.f菌菌株株,发现它只能氧化溶液中发现它只能氧化溶液中的亚铁离子的亚铁离子,对元素硫及硫对元素硫及硫化矿物无氧化作用。化矿物
16、无氧化作用。Microbiohydrometallurgy图 L.f 菌 的SEM 照片 2.2.3中等嗜热细菌中等嗜热细菌主要为硫杆菌属 Sulfobacillus 的 TH株系,在50 左右依赖黄铁矿、黄铜矿生长.绝大多数需要酵母提取液或某种有机物为营养物.1992年Golovacheva.R.S.等分离出微螺菌属的一种中等嗜热菌L.thermoferrooxidans，其适应温度范围为4550C，最佳pH为1.651.9，如图5所示，该菌螺旋状，有鞭毛，嗜氧，只能氧化水溶液与矿物中，属硫杆菌属，不能氧化亚铁，可氧化还原态硫。图.等嗜热菌L.thermoferrooxidans的SEM照片
17、Microbiohydrometallurgy2.2.4 高温菌高温菌(Thermocidophiles)嗜酸嗜高温古细菌（Thermocidophili archaebacteria）是微生物进化的一个独支系，共四个种属能氧化硫化物，即：硫化叶菌(Sulfololus),氨基酸变性菌(Acidanus),金属球菌(Metallosphaera)和硫化小球菌(Sulfurococcus)都极端嗜高温、嗜酸，球状无鞭毛，不游动，直径为1m，多分布在含硫温泉中。近年来，云南热温泉水中发现了一种高温菌，在65温度下浸出黄铜矿，其速率为氧化亚铁硫杆菌的6倍，其形貌如图6所示，是一种严格无机化能自养型嗜
18、热嗜酸菌图.云南热温泉水中的高温菌（40000）Microbiohydrometallurgy2.3 细菌的采集、培养与驯化Microbiohydrometallurgy2.3.1 2.3.1 浸矿细菌的采集浸矿细菌的采集目前目前 ,生物浸出中最重要的浸矿细菌是以转化还原生物浸出中最重要的浸矿细菌是以转化还原态硫、亚铁为标志的两种类型的短杆菌属态硫、亚铁为标志的两种类型的短杆菌属 。它们具有。它们具有专性好氧专性好氧 ,嗜酸性嗜酸性 ,以氨、硫酸盐、磷酸盐、钾、钙、以氨、硫酸盐、磷酸盐、钾、钙、镁等无机物为养料镁等无机物为养料 ,生长所需的碳和氧从空气中摄取等生长所需的碳和氧从空气中摄取等特性
19、特性 ,是浸矿中必要的酸性介质和强氧化剂。这两种类是浸矿中必要的酸性介质和强氧化剂。这两种类型的细菌相对集中地存在于金属硫化矿、氧化矿以及煤型的细菌相对集中地存在于金属硫化矿、氧化矿以及煤矿的酸性矿坑水和土壤中矿的酸性矿坑水和土壤中 ,采集这类细菌的最佳采样点采集这类细菌的最佳采样点是铜矿、铀矿、金矿等有酸性矿坑水的地方。是铜矿、铀矿、金矿等有酸性矿坑水的地方。a.采集地点 浸矿细菌可分布于土壤、水体及空气中，但较为集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑水。所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、铀矿等有酸性矿坑水的地方。如，矿坑水的pH值为1.53.5并呈棕色（说明有Fe3+存在），则很可能
20、存在氧化铁硫杆菌。b.采集方法取50250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于120烘箱灭菌20min，冷却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取酸性坑水。2.3.2 浸矿细菌的培养浸矿细菌的培养(一）一）培养培养步骤 1)配好的培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌操作下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。2)每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取15mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞置于2035恒温下，静置培养（或振动培养）710天。3)细菌生长繁殖使三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀。4)选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL
21、培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。5)按同样办法反复转移培养10次以上。每转移一次只需12滴，接种量逐渐减少而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养35天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。（二）培养目标（二）培养目标在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分
22、繁殖，活性越来越大。硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。（三）浸矿细菌的培养基（三）浸矿细菌的培养基液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培养基用于粗略地分离培养某种微生物。固体培养基是在液体培养基中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼脂溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，用H2SO4调节好酸度，冷却至常温即制成固体培养基。进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。常用培养基常用培养基1)9K培养基培养基:适用于培养氧化铁的喜中温细菌适用于培养氧化铁的喜中温细菌,其中其中(NH4)2SO4)=3 g/L,(KCl)=0.1g/L
23、,(K2HPO4)=0.5g/L,(MgSO47H2O=0.5g/L,(Ca(NO3)2=0.01g/L,(FeSO47H2O)=20 g/L。2)9K+S 培养基培养基:在在 9K培养基的基础上加入一定量的硫培养基的基础上加入一定量的硫粉粉,适用于培养氧化硫、氧化铁的喜中温细菌。适用于培养氧化硫、氧化铁的喜中温细菌。3)Waksman 培养基：适用于培养氧化硫的喜中温细菌，培养基：适用于培养氧化硫的喜中温细菌，其中其中(NH 4)2SO4)=0.2 g/L,(K2 HPO4)=3 g/L,(MgSO47H2O)=0.5g/L,(CaCl26H2O)=0.25g/L g/L,FeSO47H2
24、O痕量痕量,(S0)=2g/L。Microbiohydrometallurgy培养基的测定方法及监测目的培养基的测定方法及监测目的1.测定方法测定方法用用 EDTA 对对 Fe3+、Fe2+连续滴定测定连续滴定测定;用精密酸用精密酸度仪测定培养基的度仪测定培养基的pH值。值。2.监测目的监测目的pH是反应介质酸碱性的重要指标。硫杆菌具有是反应介质酸碱性的重要指标。硫杆菌具有将还原态的硫转化成硫酸的功能将还原态的硫转化成硫酸的功能,其发育会改变其发育会改变介质原有的酸性条件。通过监测介质原有的酸性条件。通过监测 pH 的变化的变化,可可以判断硫杆菌的发育情况。以判断硫杆菌的发育情况。Fe2+向向
25、Fe3+的转化标的转化标志着铁杆菌的活性状况。志着铁杆菌的活性状况。Microbiohydrometallurgy（四）细菌的培养特征（四）细菌的培养特征MicrobiohydrometallurgyMicrobiohydrometallurgyMicrobiohydrometallurgy细菌的其他培养细菌的其他培养 液体培养 半固体培养Microbiohydrometallurgy（五）氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法（五）氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法1)肉眼观察肉眼观察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成将被氧化变成高铁，培养
26、基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。红棕色，最后产生高铁沉淀。2)重铬酸钾容量法测定重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。3)显微镜观察显微镜观察 观察细菌的形成，是否具有氧化观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。铁硫杆菌的形状特征。说明：上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离说明：上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。板分离。（六）平板分离方法方法 1)把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板
27、。把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。2)在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开。划线分散开。3)将划好的线培养皿在将划好的线培养皿在2530条件下恒温培养。条件下恒温培养。4)经经10天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样针天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般一般7天左右培养液就可变成红棕色。天左右培养液就可变成红棕色。5)将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此将
28、此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。（七）细菌生长曲线细菌生长分成四个时期 w 生长缓慢期 w 对数生长期 w 稳定生长期 w 衰亡期 说明：以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期，每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。a.生长缓慢期当细菌由一个环境转移到一个新环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，细菌生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。比较正常的情况是24周 如果在含硫化铜培养基中培养，一般要24周 如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢
29、期就很短，甚至没有缓慢期。b.对数生长期对数生长期随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率：这个时期新增加的细菌数目远超过死亡的细菌这个时期新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。数。dtnddtdnn)(log1c.稳定生长期稳定生长期 细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌数维细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的
30、。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期内尽进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期内尽量靠近对数期的细菌。量靠近对数期的细菌。d.衰亡期衰亡期 细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。耗完。(八）细菌的繁殖八）细菌的繁殖Microbiohydrometallurgy细菌分裂过程细菌分裂过程Microbiohydrometallurgy2.3.3 浸矿细菌的驯化浸矿细
31、菌的驯化细菌的驯化：细菌的驯化：对细菌进行转移培养过程中逐渐变化外界条件，使对新环境不适应的细菌死亡，而某些活力较强的细菌会发生变异，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成新在耐性菌株。1）影响细菌生长的因素影响细菌生长的因素（1）浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分而对其他物质有选）浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分而对其他物质有选择性。细菌较其他生物细胞对渗透压的变化有较强的适应能力，但择性。细菌较其他生物细胞对渗透压的变化有较强的适应能力，但外界盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过大，造外界盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过大，造成细菌死亡。成细菌死亡。
32、（2）重金属离子可使细胞蛋白质凝固，大部分重金属离子对细菌有毒）重金属离子可使细胞蛋白质凝固，大部分重金属离子对细菌有毒性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡。性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡。（3）非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如）非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如F-，细菌对，细菌对它很敏感，浓度超过几个它很敏感，浓度超过几个ppm就会严重抑制细菌生长就会严重抑制细菌生长2)驯化方法驯化方法在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行浓度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行恒
33、温培养，待细菌适应能正常生长后，将它再恒温培养，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依此类推，每转移一次都提高金属离子培养。依此类推，每转移一次都提高金属离子浓度，最终可获得对该金属离子具有较强耐性浓度，最终可获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。的菌株。3)驯化育种驯化育种 在细菌浸出研究中所使用的细菌通常都要经过在细菌浸出研究中所使用的细菌通常都要经过驯化驯化 即将所要使用的细菌接种到所要浸出矿物的矿即将所要使用的细菌接种到所要浸出矿物的矿浆中或人工设计的类似环境中进行预培养浆中或人工设计的类似环境中进行预培养
34、从而获得从而获得能够适应新的生长环境的细菌能够适应新的生长环境的细菌.驯化育种按目的不同驯化育种按目的不同,可分为活性驯化和抗性驯可分为活性驯化和抗性驯化。方法是使用目的矿物不断转代培养或不断增加化。方法是使用目的矿物不断转代培养或不断增加有毒离子的转代培养。比如：氧化亚铁硫杆菌耐离有毒离子的转代培养。比如：氧化亚铁硫杆菌耐离子毒性的能力分别是子毒性的能力分别是15g/LAs3+、119g/LZn2+、72g/LNi2+、30g/LCo2+、56g/LCu2+、160g/LFe2+。Microbiohydrometallurgy4）驯化菌与非驯化菌的比较）驯化菌与非驯化菌的比较从图从图 1 中
35、可发现中可发现,接种驯化菌的矿浆镍的浸出率在最接种驯化菌的矿浆镍的浸出率在最初三天提高较慢，这是由于接种细菌量较少，矿浆中细初三天提高较慢，这是由于接种细菌量较少，矿浆中细菌初始浓度比较低所以浸出速率也较低。但是随着细菌菌初始浓度比较低所以浸出速率也较低。但是随着细菌的迅速繁殖，矿浆中的细菌浓度很快增大矿物的镍浸出的迅速繁殖，矿浆中的细菌浓度很快增大矿物的镍浸出速率也随之提高。速率也随之提高。而接种非驯化菌的矿浆中镍浸出速率则始终比较低而接种非驯化菌的矿浆中镍浸出速率则始终比较低 显微镜观察发现其中的细菌数量很少且增长缓慢，而接显微镜观察发现其中的细菌数量很少且增长缓慢，而接种了驯化菌的矿浆中
36、的细菌数则很快增加直至达到一个种了驯化菌的矿浆中的细菌数则很快增加直至达到一个最大值后才稳定下来最大值后才稳定下来.从图从图 2 中也可以看出中也可以看出 接种驯化菌的矿浆接种驯化菌的矿浆 Eh 很快升很快升高高 在达到最高值后缓慢下降在达到最高值后缓慢下降 而接种非驯化菌的矿浆而接种非驯化菌的矿浆 Eh升高较慢升高较慢.造成造成 Eh 升高的原因是矿浆中的升高的原因是矿浆中的Fe2+在细菌作在细菌作用下被氧化成为用下被氧化成为Fe3+三价铁三价铁 细菌活性越高细菌活性越高 Eh上升越快上升越快 由此确认驯化菌在矿浆中的繁殖速度和活性均大大高于由此确认驯化菌在矿浆中的繁殖速度和活性均大大高于非
37、驯化菌非驯化菌.Microbiohydrometallurgy驯化菌与非驯化菌浸出率比较驯化菌与非驯化菌浸出率比较Microbiohydrometallurgy2.4 细菌对各种离子的抗性细菌对各种离子的抗性2.4.1 阳离子对细菌的毒害作用阳离子对细菌的毒害作用金属离子对细菌的毒害作用主要是使细菌生长的延滞期增金属离子对细菌的毒害作用主要是使细菌生长的延滞期增长长,从而降低金属的浸出率。从而降低金属的浸出率。1）As3+的影响的影响毒害机理毒害机理:三价砷与蛋白质里的硫基反应使酶钝化三价砷与蛋白质里的硫基反应使酶钝化,导致导致糖类耗尽糖类耗尽,从而使细菌失去活性甚至死亡。从而使细菌失去活性甚
38、至死亡。2）Ag+的影响的影响当当Ag+浓度达到浓度达到 50 g/L 以上时以上时,对氧化亚铁硫杆菌有害对氧化亚铁硫杆菌有害。Ag+浓度过高会产生很大毒害抑制浸矿细菌生长甚至导浓度过高会产生很大毒害抑制浸矿细菌生长甚至导致死亡。最近研究表明致死亡。最近研究表明,在金属硫化物的细菌浸出工业在金属硫化物的细菌浸出工业生产实践中生产实践中 Ag+浓度为浓度为 1020 mg/L时时,Ag 对氧化亚铁对氧化亚铁硫杆菌的毒性降低了硫杆菌的毒性降低了99%。Microbiohydrometallurgy3）Hg2+的影响的影响毒害机理毒害机理:Hg2+对硫醇类化合物具有较大的亲和性对硫醇类化合物具有较大
39、的亲和性,使得使得许多蛋白质和酶结构中必需的硫醇失去活。研究表明许多蛋白质和酶结构中必需的硫醇失去活。研究表明,金金属铜浸出率随属铜浸出率随 Hg2+浓度增加而增加浓度增加而增加,但在但在0.1 g/L 时时,细菌细菌几乎不生长。因为几乎不生长。因为 Hg2+存在使细菌延滞期延长存在使细菌延滞期延长,影响金影响金属的浸出率。属的浸出率。4）Mo6+的影响的影响试验表明试验表明,在在9 k培养基中培养基中1 mM的的Mo6+对氧化亚铁硫杆对氧化亚铁硫杆菌对铁的氧化已有抑制作用菌对铁的氧化已有抑制作用,2 mM 则完全抑制铁的氧化。则完全抑制铁的氧化。研究还发现研究还发现,Mo6+对细菌的毒害作用
40、是使得氧化亚铁硫对细菌的毒害作用是使得氧化亚铁硫杆菌不被杆菌不被MoS3 表面所吸附。表面所吸附。Microbiohydrometallurgy2.4.2 阴离子影响阴离子影响生产工艺用水中存在的或与矿物结合的阴离子生产工艺用水中存在的或与矿物结合的阴离子,它们它们在生物氧化时某些阴离子在生物氧化时某些阴离子 Cl、SCN 等破坏细菌的细胞等破坏细菌的细胞内部结构内部结构,从而对细菌产生毒害作用从而对细菌产生毒害作用 1）Cl-的影响的影响 毒害机理毒害机理:研究表明研究表明Cl-对细菌的毒害作用可能表现在破对细菌的毒害作用可能表现在破 坏细菌的膜坏细菌的膜。2）SCN-的影响的影响 毒害机理
41、毒害机理:研究表明硫氰化物能结合到主要酶的活性位研究表明硫氰化物能结合到主要酶的活性位 置上置上,从而抑制酶的功能从而抑制酶的功能。但其机理尚不清楚。但其机理尚不清楚。Microbiohydrometallurgy2.5 细菌的计量细菌的计量比浊法：利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同，比浊法：利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同，用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。将光用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。将光密度大小与标准曲线对比，可以推知菌液的浓度。密度大小与标准曲线对比，可以推知菌液的浓度。直接计数法：利用血球计数器，取菌液样品直接在显微镜直接计数法：利用血球计数
42、器，取菌液样品直接在显微镜下观察计数。若测定单位菌液体积所含活菌数目，则须下观察计数。若测定单位菌液体积所含活菌数目，则须用平皿计数法和稀释计数法。用平皿计数法和稀释计数法。平皿计数法：将稀释后的菌液用固体培养基制成平板，然平皿计数法：将稀释后的菌液用固体培养基制成平板，然后在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目，后在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目，再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。稀释法：稀释法：将菌液按将菌液按10的倍数在培养基中连续稀释成不同浓的倍数在培养基中连续稀释成不同浓度，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀释度，度，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀释度，此最高稀释度培养液中的细菌数目为此最高稀释度培养液中的细菌数目为1个，则可按总的个，则可按总的稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度，一般达到正稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度，一般达到正常繁殖情况下菌液活菌浓度为常繁殖情况下菌液活菌浓度为1061010个个/mL。
