1、1回顾Functional analysisState 1State 22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabase searchDifferential analysis?2第四章第四章 电泳图谱的图像分析及电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术蛋白质消化技术 3蛋白质表达谱蛋白质表达谱l使用2D凝胶的比较蛋白质组学 比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2D-SDS-PAGE，比较蛋白质点的图型。研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开发出保存这些信息的大批数据库。4双向电泳分析软件双向电泳分析软件lImageMaster 2DElite（M
2、elanieTM）lPDQuest 6 0 l英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesisl德国Decodon GmbH的Delta 2D等5l图像分析的基础：使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征比较的基础。6第一节第一节 电泳图谱的图像分析电泳图谱的图像分析掌握：掌握：蛋白电泳图像分析系统熟悉：熟悉：使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检测
3、，匹配 和分析了解：了解：二维电泳蛋白谱数据库7电泳图谱的图像分析简介what can we get from image analysis?双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一要技术之一,双向电泳根据双向电泳根据等电点和分子量等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再质再PAGEPAGE上可形成密度不同、分布不均的上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。复杂点图谱。如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、对图谱上的蛋
4、白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。是双向电泳分析软件所要解决的问题。8凝胶的图像处理分析及细胞蛋白凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立谱的建立 典型流程典型流程l凝胶图像的扫描：凝胶图像的扫描：l图像加工：图像加工：l斑点检测和定量：斑点检测和定量：l凝胶配比：凝胶配比：l数据分析：数据分析：l数据呈递（数据呈递（report）l2-DE数据库的建立：数据库的建立：9PDQuest 软件简介软件简介PDQuestPDQuest软件是显示（软件是显示（imagingimaging）、分析）、分
5、析（analyzinganalyzing）双向电泳图谱数据库查询的一）双向电泳图谱数据库查询的一个软件包个软件包硬件：硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率，256色，SCI接口，windows操作系统软件：软件：PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA10PDQuest 软件的使用软件的使用以以PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳分分析软件为例将双向电泳分析的基本实验过程做一简单介绍。析的基本实验过程做一简单介绍。11PDQuest 软件软件PDQU
6、EST 2-D分析软件系统和其他分析软件系统和其他2-D分析分析软件软件系统一样，包括：系统一样，包括：一一 图象采集与加工：图象采集与加工：二二 斑点检测斑点检测三三 斑点匹配斑点匹配四四 数据分析及输出数据分析及输出12PDQuest 软件的使用http:/ images)141、扫描：凝胶染色后用扫描仪扫描，透射模式，全彩凝胶染色后用扫描仪扫描，透射模式，全彩RGB,RGB,分辨率为分辨率为400dpi-800dpi400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以，尽量排除气泡，文件以tifftiff格式格式保存。保存。2、图片加工：l在在PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析
7、软件中打开以分析软件中打开以tifftiff格式保存的文件可格式保存的文件可以以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“OpenOpen”命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的文件格式2D Scan2D Scan。）l单击工具栏上的单击工具栏上的control thecontrol the image displayimage display 图标，图标，会出现一个对话框，通过改变此对话框的会出现一个对话框，通过改变此对话框的High Hi
8、gh 和和LowLow的值的值以改变明亮度。以改变明亮度。1516l用工具栏的用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在切割的区域，然后在imageadvance cropsave imageadvance cropsave crop settingscrop settings下保存下保存crop
9、crop的设定条件并输入保存的的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在名称，其他的图象切割时在imageadvance imageadvance cropload crop settingscropload crop settings中选定先前保存的名称即中选定先前保存的名称即可可 ）17图象采集与加工后就要进行斑点检测，图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为分析软件通过一个称之为“蛋白质斑点检测向导（蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。的程序来实现的。二、斑点检测(spots detecti
10、on)18l单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。l该程序首先需人工设定检测参数需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其他一些选项等。l这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“字（Spot Crosshairs）”表示，检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。l在Parameter S
11、et 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶图像需事先打开）。l蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分别为gel image 和和gel spot。192021l由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将gel scan、gel image 和gel spot图
12、打开，然后单击edit spot tool，出现一个对话框，此对话框中有增加斑点（make a spot at cursor）,删除斑点（remove spot at cursor）,合并斑点（combine spot in box）等图标，可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应的斑点处理。这些处理只能在gel image图象中处理，但相应的在gel spot图象中会同时得到显示。2223u蛋白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变，PDQUEST 可以建立一个建立一个Matchset。单击matchcreat matchset,出现一个Matchset的对话框，输入文
13、件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gel spot 图像的文件名，然后单击creat,出现一对话框，选择其中的一个图象做为参考图象（standard member）,整个Matchset用单个窗口（signal window）来表示，其中的亚窗口（subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成员胶（member gel）图像。三、斑点匹配(Matching spots)242526Matchset 建成后，接着便是建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）
14、与定位）与定位（position）以便进行匹配（）以便进行匹配（match）。）。单击工具栏中的单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有图标会出现一个窗口，其中有 landmark,unlandmark,match gel,match all gels等斑点匹配的等斑点匹配的工具工具,在在match菜单中也有这些工具。菜单中也有这些工具。标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为
15、所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志点后便可利用设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了。272829u对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击viewinterchange all images,这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image,
16、而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白质斑点以编辑蛋白质斑点。3031四、数据分析及输出（analysis and report）32为了分析蛋白质斑点之间差异表达，PDQUEST提供了多个分析程序，包括蛋白质斑点量量(Quantity)分析分析，散点图工具（Satter Plot Tool）,量的柱状图分析（Graph）等在内的多种分析程序。33量的分析量的分析打开Matchset，单击DatabaseAnalysisCreate Analysis Set,然后再单击参考图，就会出现一个对话框,输入名字（Name）,Type有多种选项,要做量的比较就选
17、Quantitative。3435比较（Compare）形式有两种，一种是Gel,可以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是Group，可以将同一样品的多块胶做为一组（这在Database Replicate GroupCreate Group下可以创建组），然后再组之间两两比较。然后再选择A 和B，分别表示两块胶或者是两组胶。Replicate Group363738在Select Spots Which are 中可以选择Increased,Increased or Decreased 或者是Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关系,默认的是2 times
18、,可以输入其他数值，如3 times。参数设好后就单击go,在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是Increased BA 2 times,那么这些黄色圈黄色圈标记的标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A 两倍的蛋白质点.39为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）,单击EditNormalize,出现一对话框，选择左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活，归一化归一化 Normalization4041散点图工具散点图工具 Scatter plot4243单击Reports 下的Sca
19、tter plot，会出现散点图分析的对话框，可以选择x,y轴，分别代表一块胶，Markers 下可以选择倍数，下面的散点图即显示了两个2-D胶图像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，在Reports Scatter plots 下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印出来。4445量化柱状图量化柱状图 Graphs46单击ReportsMore GraphsPage Graphs,在有边会出现一对话框，显示所有蛋白质点在不同胶上的量化柱状图，如果要显示所要分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框的Input下选择Analysis set,出现一对话框，然后选择分析的名称即可。在Re
20、portsQuantity Graphs下可输出所有的蛋白质点（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白质点（Specificd Analysis Set）在不同胶上的量化柱状图。474849应用材料：50无腔眼金鱼胚胎正常眼金鱼胚胎5152差异点：差异点：532D Gel DatabaseslBiobase Biobase 角质形成细胞角质形成细胞,膀胱癌等膀胱癌等 (丹麦丹麦Center for Genome Research)Center for Genome Research)http:/biobase.dk/cgi-bin/celishttp:/biobase.dk/cg
21、i-bin/celislECO2DBASE ECO2DBASE 大肠杆菌大肠杆菌 (在在NCBINCBI库中库中)ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASElHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 (德国柏林德国柏林)http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisshttp:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisslHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人类心脏人类心脏
22、 (英国英国Harefield,Heart Science Center)Harefield,Heart Science Center)http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlhttp:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmllLSB LSB 人类人类,小鼠和大鼠肝脏等小鼠和大鼠肝脏等 (美国美国Large Scale Biology)Large Scale Biology)http:/.2dmaps/patterns.htmlhttp:/.2dmaps
23、/patterns.htmllQUESTRef52 QUESTRef52 细胞细胞,大鼠胚胎大鼠胚胎,酵母酵母 (美国美国Cold Spring Harbor Lab)Cold Spring Harbor Lab)http:/siva.cshl.org/http:/siva.cshl.org/lSWISS-2DPAGE SWISS-2DPAGE 十个人类图谱十个人类图谱,包括包括:肝肝,浆细胞浆细胞,红细胞红细胞,血小板血小板,以及酵以及酵母母,大肠杆菌大肠杆菌 (瑞士日内瓦瑞士日内瓦,University Hospital)2-DE,University Hospital)2-DE数据库数据
24、库hthttp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmltp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmllYeast Yeast S.cerevisiae,S.pombeS.cerevisiae,S.pombe等等 (瑞典瑞典Goteborg University)Goteborg University)http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/lYeast Yeast S.cerevisiae(S.cerevisiae(美国美国Proteome Inc.)Pro
25、teome Inc.)http:/ 蛋白质消化技术蛋白质消化技术57一、为什么需要消化蛋白质？、为什么需要消化蛋白质？l在讨论分离和消化方法之前，让我们先考虑复杂蛋白质混合物的问题。MS仪器能够从相对复杂的混合物样品中获得肽数据。然而，当样品混合物的复杂程度降低时，MS能鉴定很多的肽片段。58为什么蛋白质组学不简单地测定完整蛋白质的质量？为什么蛋白质组学不简单地测定完整蛋白质的质量？MS仪器较少对完整蛋白质进行质量测定的主要的三个原仪器较少对完整蛋白质进行质量测定的主要的三个原因：因：尽管MS仪器已经相当完善，但是仪器所进行的测定仍然会发生错误。蛋白质的质量越大，绝对误差越大 不是所有的蛋白质
26、都能进行完整蛋白质的质量测定。MS对大分子蛋白质和疏水蛋白质很难进行质量测定 完整蛋白质质量测定的灵敏度远低于肽质量测定和肽串联MS分析的灵敏度。59 从从MSMS分析得到的肽段数据可直接分析得到的肽段数据可直接与蛋白质和核苷酸序列数据库中与蛋白质和核苷酸序列数据库中的蛋白质序列进行比较。通过肽的蛋白质序列进行比较。通过肽MSMS数据与数据库信息的比较以鉴数据与数据库信息的比较以鉴定蛋白质。定蛋白质。某些某些蛋白质水解酶蛋白质水解酶在特定位点将在特定位点将蛋白质切割成肽蛋白质切割成肽 。这一节讨论可。这一节讨论可切割蛋白质产生肽提供切割蛋白质产生肽提供MSMS分析所分析所用的酶及其方法用的酶及
27、其方法 60二、消化可以达到什么目的？二、消化可以达到什么目的？l理想的消化方法是在某些特定的氨基酸残基上切割蛋白质，产生最合适于MS分析的片段。6-20氨基酸的肽段对MS分析和数据库比较理想。l一般短于6氨基酸的肽太短，不能在数据库检索中产生唯一的序列匹配。l另一方面，在串联MS分析中，很难从长于20个氨基酸的肽段上获得序列信息。l因而蛋白质消化的目标是尽可能多的获得合适长度的肽段供MS分析。613.蛋白酶介绍蛋白酶介绍l胰蛋白酶lGlu-C（V8蛋白酶）l溴化氰62胰蛋白酶胰蛋白酶l胰蛋白酶是蛋白质组学分析中常用的蛋白酶。胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基位点切割蛋白质。但若在赖氨酸或精氨酸的C
28、端方向有脯氨酸则不能切割。63Glu-CGlu-C（V8V8蛋白酶）蛋白酶）l是内切蛋白酶，它在醋酸氨或碳酸氢氨缓冲液中切割谷氨酸残基的羧基侧，但在磷酸钠缓冲液中切割谷氨酸和天冬氨酸。Glu-C的一个优点是与胰蛋白酶相比有明显的不同切割专一性，这提高了得到蛋白质互补肽片段的可能性。这对分析具有高赖氨酸和精氨酸区域的蛋白质特别有用，这些区域能被胰蛋白酶充分切割产生没有足够序列信息的极短的肽段。64Data analysis of mass spectrum-PMFData analysis of mass spectrum-PMF65其他蛋白酶和切割试剂其他蛋白酶和切割试剂l还有几种酶也可以用于
29、蛋白质组分析。包括LysC、胰凝乳蛋白酶、Asp-N和几种“非专一性”蛋白酶。这些酶的切割专一性对大部分蛋白质组分析 不理想。这些只在一个氨基酸位点切割的酶产生几个大片段。这些大片段在串联MS分析中不能提供有用的序列信息。另一方面，胰凝乳蛋白酶切割太频繁（能切割酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸位点），产生过多序列肽段的小肽。不过，当一个感兴趣的蛋白质序列，特别是在某些感兴趣区域，不能产生令人满意的胰蛋白酶太肽，可以选择使用这些酶。66非专一性蛋白酶非专一性蛋白酶l非专一蛋白酶也是蛋白质消化中常用的酶，例如枯草杆菌细胞溶素蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶。这些酶或多或少地随机切割蛋白质产生多个重叠肽。由于专一性较差，消化必须在相对较短的时间内进行以防止消化的过快，产生多个重叠的优点是能获得较多的蛋白质序列数据67溴化氰溴化氰l常用的化学试剂是溴化氰（CNBr），它在甲硫氨酸位点切割蛋白质。CNBr的反应具有高度专一性，但是在大多数的蛋白质中甲硫氨酸残基含量较少，CNBr切割产生数量较少的大片段，这些大片段在串联MS分析中不能产生有用序列。684.4.在凝胶中消化蛋白质在凝胶中消化蛋白质1D或2D-SDS-PAGE分离蛋白质的消化通常使用的方法是“在凝胶中”消化。从凝胶中切出感兴趣条带或点，进行脱色，然后用蛋白酶处理。酶进入凝胶基质，将蛋白质消化成肽，然后通过漂洗将肽从凝胶中洗脱。
