1、第三节第三节 免疫检测免疫检测 1一、抗原、抗体的检测一、抗原、抗体的检测 抗原抗体反应，又称血清学反应（主要指抗原抗体反应，又称血清学反应（主要指体外的反应）。体外的反应）。（一）抗原抗体反应的特点（一）抗原抗体反应的特点1、特异性和交叉反应、特异性和交叉反应2、可逆性、可逆性(分子表面的结合分子表面的结合)非共价键结合非共价键结合 (范德华力分子空间构型的互补程度、静电引力、氢键、疏水性作用)是分离纯化抗原或抗体的理论依据是分离纯化抗原或抗体的理论依据2 3、比例性和可见性、比例性和可见性 比例不合适比例不合适出现游离的抗原或抗体，小分出现游离的抗原或抗体，小分子的免疫复合物形成，加电解质
2、也不可见；子的免疫复合物形成，加电解质也不可见；比例合适比例合适出现网格状的大复合物，游离的出现网格状的大复合物，游离的抗原或抗体少，加电解质，可见；抗原或抗体少，加电解质，可见；因此，在抗原抗体反应中，为得到肉眼可见的因此，在抗原抗体反应中，为得到肉眼可见的反应现象，需要调整抗原、抗体的比例。反应现象，需要调整抗原、抗体的比例。4、阶段性、阶段性 抗原抗体特异性结合阶段，短抗原抗体特异性结合阶段，短 可见反应阶段，长可见反应阶段，长34 5（二）血清学反应的种类（二）血清学反应的种类1、凝集反应（、凝集反应（agglutination reaction）概念：颗粒性抗原与相应抗体结合，在适概
3、念：颗粒性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集量电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集块的反应。块的反应。反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。素。6 1、颗粒性抗原抗体颗粒性抗原抗体 直接凝集直接凝集 类别及应用：类别及应用：7玻片法玻片法8 血凝反应强度示意图血凝反应强度示意图9试管法试管法例：伤寒杆菌的诊断例：伤寒杆菌的诊断肥达试验肥达试验10可溶性抗原相应抗体可溶性抗原相应抗体 不凝集不凝集 2、可、可溶性抗原溶性抗原-无关载体抗体无关载体抗体 间接凝集间接凝集正向正向 反向反向11 常用载体常用载体 RBC、聚苯乙烯乳胶、
4、活性碳、胶、聚苯乙烯乳胶、活性碳、胶体金体金 123、待测可溶性抗原抗体、待测可溶性抗原抗体+可可溶性抗原溶性抗原-无关载体无关载体 间接凝集抑制间接凝集抑制13（二）沉淀反应（二）沉淀反应（percipitation reaction）概念：沉淀原、沉淀素概念：沉淀原、沉淀素 类别及应用：类别及应用：1、液体内的沉淀实验、液体内的沉淀实验环状沉淀反应、絮环状沉淀反应、絮状沉淀反应状沉淀反应 2、凝胶内的沉淀反应、凝胶内的沉淀反应常用的凝胶有琼脂、常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。3、免疫浊度试验、免疫浊度试验14AbAg环状沉淀示意图环状沉
5、淀示意图沉淀管内径沉淀管内径1.51.52mm2mm1 15min5min出现沉淀环为阳性出现沉淀环为阳性30min30min不出现沉淀环为阴性不出现沉淀环为阴性151:21:41:81:16 1:32 1:64 1:128各管抗原倍比稀释各管抗原倍比稀释加入抗血清加入抗血清各管抗体量不变各管抗体量不变振摇振摇 混匀、混匀、37孵育孵育沉淀量不同沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管出现沉淀量最多的管为最适比例管轻摇轻摇絮絮状状沉沉示示 意意 图图淀淀AgAbAg16单扩17火箭电泳1819双向免疫扩散双向免疫扩散20双扩 本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种本法常用于抗原或抗体
6、的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。抗原材料的抗原相关性分析。21 “1 1”为单一抗原抗体系统。为单一抗原抗体系统。“n n”为多个抗原抗体系统。为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。可以用混合抗体鉴定抗原纯度。22 1.1.周围周围6 6个孔放不同稀释度的相应个孔放不同稀释度的相应AbAb。2.2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。该抗体的效价。3.3.可进行任意稀释。可进行任意稀释。23对流免疫电泳24免疫电泳 常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋
7、白常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。25（三）补体结合试验（三）补体结合试验 概念：概念：组成：待检系统、指示系统组成：待检系统、指示系统2627（四）中和试验（四）中和试验 病毒中和试验病毒中和试验 血清血清 病毒病毒 细胞细胞 细胞是否感染细胞是否感染 毒素中和试验毒素中和试验 血清血清 外毒素外毒素 毒素活性作用是否丧失毒素活性作用是否丧失 2829（五）免疫标记测定技术（五）免疫标记测定技术 概念：用具有高敏感度的标记物，标记抗体或抗原后进概念：用具有高敏感度的标记物，标记抗体或抗原后进
8、行的抗原抗体反应。行的抗原抗体反应。分类：免疫组化技术、免疫测定分类：免疫组化技术、免疫测定 常用标记物：酶、荧光素、同位素、胶体金等常用标记物：酶、荧光素、同位素、胶体金等 30大鼠大鼠VSMC平滑肌特异性平滑肌特异性-Actin免疫组化染色照片免疫组化染色照片31间接免疫荧光法检测自身抗体和病原体抗体间接免疫荧光法检测自身抗体和病原体抗体32 1、免疫酶标记技术、免疫酶标记技术 用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应。以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。中抗原或抗体的含量。(1)常用酶常
9、用酶：辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）(2)常用方法：酶联免疫吸附试验常用方法：酶联免疫吸附试验 33ELISA原理示意图34间接法35双抗夹心法36抗原竞争法37 免疫荧光技术免疫荧光技术 常用荧光素：常用荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）FITC,495nm 2、罗丹明（红色荧光）、罗丹明（红色荧光）RB200 3、R藻红蛋白藻红蛋白 R-PE 38免疫荧光技术（可在同一标本中测多个抗原或抗体）39 放射免疫分析法放射免疫分析法 同位素分析的灵敏性同位素分析的灵敏性 抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 优点：优
10、点：灵敏度高灵敏度高 特异性强特异性强 精确性好精确性好 样品用量少样品用量少 测定方法规范、自动化测定方法规范、自动化 常用同位素：125I、131I、3H、14C、32P 40放射免疫测定 WESTERN 原理41免疫胶体金技术免疫胶体金技术42 43444546快速斑点免疫金渗滤法检测示意图快速斑点免疫金渗滤法检测示意图47 常用抗原抗体反应的相对敏感度常用抗原抗体反应的相对敏感度 （/L）血清蛋白电泳（区带电泳）血清蛋白电泳（区带电泳）1000mg 免疫电泳免疫电泳 50100mg 单向免疫扩散单向免疫扩散1020mg 双向免疫扩散双向免疫扩散 10mg 火箭电泳火箭电泳 5.0mg
11、对流免疫电泳对流免疫电泳 1.0mg 免疫比浊免疫比浊 1.0mg 补体结合反应补体结合反应 10ug 凝集反应凝集反应 10ug ELISA 10ug RIA 10ug48二、免疫细胞的检测二、免疫细胞的检测 在体外或体内，对机体免疫细胞进在体外或体内，对机体免疫细胞进行鉴定、计数、功能测定行鉴定、计数、功能测定。1、免疫细胞的分离免疫细胞的分离 自然沉降法自然沉降法 密度梯度离心密度梯度离心+花环试验（或黏附试花环试验（或黏附试验等）验等）免疫磁珠法免疫磁珠法 图图 流式细胞分离术流式细胞分离术 图图等等49 Percoll分层液分层液 5051流式细胞仪分离细胞52 2、免疫细胞的计数、免疫细胞的计数 图图 各种血细胞各种血细胞 1.2.3.单核细胞单核细胞 4.5.6.淋巴细胞淋巴细胞 7.8.9.10.11.中性粒细胞中性粒细胞12.13.14.嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 15.嗜酸性粒细嗜酸性粒细胞胞 16.红细胞红细胞 17.血小板血小板.53流式细胞仪检测细胞表面标记54 55 56 57
