1、原理 理论基础就是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。主要包括染色体畸变和基因突变两大类。诱发突变：用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变剂：化学诱变剂、物理诱变剂、生物诱变剂基本方法：诱变 +筛选诱变育种诱变育种概述概述诱变剂诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂各种射线，如紫外线、各种射线，如紫外线、X射线、射线、射线、射线、射线、射线、射线和超射线和超声波等声波等乙基磺酸乙酯（乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。亚硝酸、氮芥等。噬菌体、转座因子噬菌体、转座因子诱变育种诱变育种大多死亡大多死亡少数存活少数存活存活率存活率多
2、数未变多数未变少数突变少数突变突变率突变率多数负变多数负变少数正变少数正变正变率正变率多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大高产率高产率投产率投产率多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产出发菌株出发菌株计算出计算出诱变诱变诱变育种基本过程出发菌株选择制备菌悬液诱变处理筛选1、诱变育种、诱变育种出发菌株（parent strain)的选择用来进行诱变处理的菌株一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。其次 是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。从自然界中分离得到的野生型菌株；通过生产选
3、育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；已经诱变过的菌株。菌株来源菌株来源制备菌悬液待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106 107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。诱变剂使用 单一诱变剂处理；复合诱变
4、剂处理 诱变剂及诱变剂量选择 在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。不同微生物，使用的剂量不同；诱变率随诱变剂剂量的增加而提高。但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。诱变处理诱变处理诱变剂复合处理，可产生协同效应诱变剂复合处理，可产生协同效应一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。突变株的筛选摇瓶筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化随机筛选理性化筛选运用遗传学
5、、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。新型诱变技术 低能离子素诱变 激光、微波辐射诱变 原生质体诱变低能离子素诱变诱变育种详细过程：诱变育种详细过程：出发菌种（砂土管或冷冻管）出发菌种（砂土管或冷冻管）斜面斜面或肉汤培养或肉汤培养24 h单孢子悬液单孢子悬液 诱变处理诱变处理稀释涂布平板稀释涂布平板挑取单菌落传种斜面挑取单菌落传种斜面菌悬液菌悬液观察单菌落形态并统计其形态变异率观察单菌落形态并统计其形态变异率摇瓶初筛摇瓶初筛挑出高产斜面挑出高产斜面菌种保藏（砂
6、土管、冻干管或制备固体孢子）菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子）摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定）摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定）挑出高产菌株挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察作稳定性试验和菌种特性考察放大试验罐、中试考察放大试验罐、中试考察大型投产试验大型投产试验对照组对照组对照组对照组营养缺陷型突变菌株的筛选：营养缺陷型突变菌株的筛选：具有明显的遗传标记逐个检出法 影印培养法 逐个检出法 一般从菌落大小也可一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺落较小，即是营养缺陷型陷型 夹层培养法 影印平板（影印平板（Re
7、plica platingReplica plating）法是）法是LederbergLederberg夫妇在夫妇在19521952年建立年建立抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选未突变的菌株：代谢受阻，不能合成某种产物而死亡；未突变的菌株：代谢受阻，不能合成某种产物而死亡；抗反馈调节突变株抗反馈调节突变株：在结构类似物存在的情况下，仍能合成末端产物：在结构类似物存在的情况下，仍能合成末端产物形成菌落。形成菌落。抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。选育结构类似物抗性突变株 结构类似物是指一
8、些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质 主要用于末端产物的积累用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株代谢产物产生菌抗代谢物肌苷Bacillus pumilus（短小芽胞杆菌）8-氮鸟嘌呤肌苷Corynebacterium sp（一种棒状杆菌）6-硫鸟嘌呤腺嘌呤Salmonella typhimarium（鼠伤寒沙门氏菌）2，6-二氨基嘌呤烟碱酸Chlamydomonas eugametos（一种衣藻）3-乙酰吡啶色氨酸Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichia coli（大肠杆菌）乙硫氨酸酪氨酸E.coli对氟苯丙氨酸吡
9、咯叠氮（pyrrolnitrin）Pseudomonas aureofaciens（金色假单胞菌）6-氟色氨酸亮氨酸S.typhi三氟-DL-亮氨酸杂交育种细菌的杂交育种放线菌杂交育种霉菌杂交育种F+菌株菌株 F-菌株菌株Hfr菌株菌株F-菌株菌株细菌的杂交育种霉菌的杂交育种准性生殖准性生殖：霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组，霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组，即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。细胞杂交得到的分生
10、孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。细胞杂交得到的分生孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。准性循环（体细胞杂交）的三个连续过程准性循环（体细胞杂交）的三个连续过程准性生殖准性生殖：霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组，霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组，即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。细胞杂交得到的分生孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。细胞杂交得到的分生孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。准性循环（体细胞杂交）的
11、三个连续过程，见下准性循环（体细胞杂交）的三个连续过程，见下 图。图。霉菌的准性生殖a)遗传标记b)异核体形成c)杂合二倍体的形成d)染色体交换和单倍体霉菌的体细胞杂交p 准性生殖和有性生殖的相同点：相类似遗传现象：核融合、形成杂合二倍体、染色体再分离、同源染色体交换、出现重组体；均能导致基因重组。不同点：有性生殖通过减数分裂，准性生殖通过体细胞交换和单倍化。青霉素产生菌产黄青霉与灰黄霉素产生菌荨麻青霉 双重营养缺陷型间准性杂交青霉菌杂交育种实验操作步骤四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术原生质体：有时指去了壁的细胞，是生活细胞内全部具有生命的物质的总称，由原生质所构成。原生质体一般由细胞
12、膜、细胞质和细胞核三部分组成，是细胞内各类代谢活动的主要场所。四、原生质体融合技术定义：将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。即实现遗传重组。应用：选育高产菌株；产生新的产物选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤 步骤：1、可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组 的频率比较低；受接合型或亲株限制。1、重组频率高于杂交育种；3、遗传物质交换充分；4、可以与其他育种方法结合。原生质体融合育种的优点：四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术一般原理和过程一般原理和过程四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术1、选择亲株 选
13、择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 2、原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键 四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性2 2、原生质体制备、原生质体制备 四、原生质体融合技术四、原生质体融合技
14、术3、原生质体融合 聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合4、原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压。四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术5、融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。经纯化的亲株经纯化的亲株1具有遗传标记的亲株具有遗传标记的亲株1菌体培养菌体培养酶解细胞壁酶解细胞壁原生质体原生质体1再生再
15、生再生频率再生频率测定测定再生菌落再生菌落性状测定性状测定经纯化的亲株经纯化的亲株1具有遗传标记的亲株具有遗传标记的亲株1菌体培养菌体培养酶解细胞壁酶解细胞壁原生质体原生质体2再生再生再生频率再生频率测定测定再生菌落再生菌落性状测定性状测定融合融合106 106直接选择法直接选择法间接选择法间接选择法融合子融合子杂交性状测定杂交性状测定基因工程育种 目的基因获取 载体选择与准备 目的基因与载体连接成为重组DNA 重组DNA导入宿主细胞 重组体筛选表达系统 原核表达系统 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 真核表达系统 酵母、丝状真菌、昆虫、哺乳动物细胞、植物细胞基因工程育种问题：基因工程育种问题：基因工程菌的稳定性：基因工程菌的稳定性：工程菌在传代中出现不稳定包括：质粒不稳定及其表达产物的不稳定。u具体表现为质粒的丢失u重组质粒发生DNA片段脱落u表达产物不稳定。
