1、第一篇第一篇 造血细胞及其检验造血细胞及其检验 第一章第一章 现代造血理论现代造血理论 造血造血（hematopoiesis）是指血细胞的）是指血细胞的生成过程。生成过程。造血干细胞造血干细胞在造血微环境中增殖、分化在造血微环境中增殖、分化为各类血细胞。为各类血细胞。造血系统造血系统通过造血器官、造血干细胞、通过造血器官、造血干细胞、造血调控因子等组成的复杂网络来维持造血调控因子等组成的复杂网络来维持血液细胞的动态平衡。血液细胞的动态平衡。第一节第一节 造血器官和造血微环境造血器官和造血微环境 一、造血器官一、造血器官 人体的造血器官是生成血液的器官人体的造血器官是生成血液的器官 起源于起源于
2、中胚叶中胚叶，主要包括，主要包括骨髓骨髓、胸腺胸腺、淋淋巴结巴结、肝脏肝脏和和脾脾等等 其造血过程分为其造血过程分为胚胎期造血胚胎期造血和和出生后造血出生后造血（一）胚胎期造血器官（一）胚胎期造血器官 人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参与造血脾、胸腺和骨髓均参与造血 根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期造根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期造血又分为血又分为三三个时期：个时期：卵黄囊造血期卵黄囊造血期 、肝造血期肝造血期 、骨髓造血期骨髓造血期 1卵黄囊造血期卵黄囊造血期（中胚叶造血期）（中胚叶造血期）始于胚胎始于胚胎3周周左右，卵黄
3、囊壁上的左右，卵黄囊壁上的中胚层细中胚层细胞胞开始分化聚集成团，称为开始分化聚集成团，称为血岛血岛（blood island）。血岛是人类最初的造血中心。）。血岛是人类最初的造血中心。血岛血岛外周的细胞逐渐变长，分化为外周的细胞逐渐变长，分化为血管内血管内皮细胞皮细胞 血岛血岛中央的细胞形成中央的细胞形成多能造血干细胞多能造血干细胞，继，继尔分化成尔分化成幼稚红细胞幼稚红细胞，以后大量的多能造，以后大量的多能造血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织继续增殖、分化为继续增殖、分化为干细胞干细胞。胚胎胚胎 2个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩
4、,被被肝、脾取代其造血功能。肝、脾取代其造血功能。2肝造血期肝造血期 始于胚胎始于胚胎第第6周周，是卵黄囊血岛的，是卵黄囊血岛的造血干造血干细胞细胞移植到肝脏的结果，以造移植到肝脏的结果，以造红细胞红细胞为主，为主，后期可生成后期可生成粒细胞粒细胞和和巨核细胞巨核细胞。肝脏是胚胎肝脏是胚胎25个月个月的造血中心，持续至的造血中心，持续至第第7个月时，逐渐被骨髓造血替代。个月时，逐渐被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。胎肝胎肝造血的规律：造血的规律：造血细胞造血细胞分布在肝窦、肝细胞索之间。分布在肝窦、肝细胞索之间。胎肝造血以胎肝造血以幼稚红细胞幼
5、稚红细胞为主，巨核细胞为主，巨核细胞常与红系细胞在一起。常与红系细胞在一起。胎肝造血细胞的密度随妊娠日期的不同胎肝造血细胞的密度随妊娠日期的不同而变化。证明肝造血在第而变化。证明肝造血在第15周周以前为上以前为上升期，升期，1530周周为旺盛期，为旺盛期，24周周以后为以后为减退时期，至出生前停止。减退时期，至出生前停止。故肝造血为故肝造血为第二代造血第二代造血。脾造血脾造血 始于胚胎第始于胚胎第3个月，主要生成个月，主要生成红细胞红细胞、粒细胞、粒细胞，第，第5个月时产生个月时产生淋巴细胞淋巴细胞、单核细单核细胞胞，而红细胞和粒细胞的产生逐渐减少。至，而红细胞和粒细胞的产生逐渐减少。至出生时
6、，脾已成为产生淋巴细胞的器官。出生时，脾已成为产生淋巴细胞的器官。胸腺胸腺 在胚胎期主要产生在胚胎期主要产生淋巴细胞淋巴细胞和少量红和少量红细胞、粒细胞，胚胎后期成为诱导和分化细胞、粒细胞，胚胎后期成为诱导和分化T淋淋巴细胞的器官。巴细胞的器官。淋巴结淋巴结 在胚胎早期可产生红细胞，但时间在胚胎早期可产生红细胞，但时间很短，在胚胎很短，在胚胎4个月以后，成为个月以后，成为终生制造淋巴终生制造淋巴细胞细胞和和浆细胞浆细胞的器官的器官。3骨髓造血期骨髓造血期 自胚胎第自胚胎第14周周骨髓开始造血，骨髓开始造血，5个月个月以后成以后成为胚胎期的造血中心。为胚胎期的造血中心。骨髓中的造血干细胞来源于骨
7、髓中的造血干细胞来源于肝肝、脾脾的的种植种植，可维持终生。可维持终生。胚胎期的骨髓主要生成胚胎期的骨髓主要生成红细胞红细胞、粒细胞粒细胞和和巨巨核细胞核细胞，也生成淋巴细胞和单核细胞。，也生成淋巴细胞和单核细胞。胚胎期造血的三个时期是不能截然分开，胚胎期造血的三个时期是不能截然分开，而是此消彼长，互为交错。而是此消彼长，互为交错。（二）出生后造血（二）出生后造血 出生后造血主要靠出生后造血主要靠骨髓骨髓。在正常情况下在正常情况下骨髓骨髓是是唯一唯一能产生能产生红细胞红细胞、粒细胞粒细胞和和血小板血小板的场所，也生成淋巴细胞的场所，也生成淋巴细胞和单核细胞。和单核细胞。脾脾和和淋巴结淋巴结为终生
8、制造为终生制造淋巴细胞淋巴细胞的器官。的器官。1骨髓骨髓 骨髓骨髓是位于是位于骨髓腔骨髓腔内的海绵样胶状组织，有内的海绵样胶状组织，有红骨髓红骨髓和和黄骨髓黄骨髓之分。之分。婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨髓。髓。大约从大约从5岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细胞，随年龄增长，长骨远端的胞，随年龄增长，长骨远端的红骨髓红骨髓逐渐被逐渐被脂肪组织脂肪组织代替转化为代替转化为黄骨髓黄骨髓。到到18岁以后，红骨髓只限于颅骨、脊椎骨岁以后，红骨髓只限于颅骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及长骨的近心端。、肋骨、胸骨、骼骨以及长骨的近心端
9、。因此，在作骨髓穿刺或活检时，因此，在作骨髓穿刺或活检时，成人成人可选择可选择的部位是的部位是骼骨骼骨、棘突棘突、胸骨胸骨等处，等处，胫骨粗隆胫骨粗隆则只适用于则只适用于2岁岁以下的幼儿。以下的幼儿。成人的红骨髓和黄骨髓约各占成人的红骨髓和黄骨髓约各占50%，但黄骨，但黄骨髓仍有造血潜能，当机体需要时又髓仍有造血潜能，当机体需要时又转变转变为红为红骨髓而参与造血。骨髓而参与造血。2.淋巴器官淋巴器官 分为分为中枢淋巴器官中枢淋巴器官和和周围淋巴器官周围淋巴器官。中枢淋巴器官中枢淋巴器官主要包括主要包括胸腺胸腺和和骨髓骨髓，主导，主导淋巴细胞的产生、增殖、分化和成熟。淋巴细胞的产生、增殖、分化和
10、成熟。周围淋巴器官周围淋巴器官主要包括主要包括淋巴结淋巴结、脾脾、肠粘肠粘膜相关淋巴组织膜相关淋巴组织等，是淋巴细胞聚集和免等，是淋巴细胞聚集和免疫应答发生的场所。疫应答发生的场所。(1)胸腺（胸腺（thymus）来自骨髓的来自骨髓的淋巴干细胞淋巴干细胞经增殖和在经增殖和在胸腺素胸腺素的作用下，诱导分化为的作用下，诱导分化为免疫活性细胞免疫活性细胞，进，进入入胸腺髓质胸腺髓质，然后释放入血并迁移到外周，然后释放入血并迁移到外周淋巴器官的胸腺依赖区成为胸腺依赖淋巴淋巴器官的胸腺依赖区成为胸腺依赖淋巴细胞即细胞即T细胞细胞。青春期后，胸腺逐渐退化，。青春期后，胸腺逐渐退化，被脂肪组织取代。被脂肪组
11、织取代。(2)淋巴结（淋巴结（lymph node）淋巴结的外周部分为皮质，淋巴结的外周部分为皮质，B细胞细胞在淋巴在淋巴结皮质区滤泡中央增殖、发育；结皮质区滤泡中央增殖、发育；皮质深层和滤泡间隙为副皮质区，富含由皮质深层和滤泡间隙为副皮质区，富含由胸腺迁移而来的胸腺迁移而来的T细胞，又称细胞，又称胸腺依赖区胸腺依赖区；淋巴结中央部分为髓质，髓质区的淋巴结中央部分为髓质，髓质区的B细胞细胞、浆细胞及巨噬细胞集结构成、浆细胞及巨噬细胞集结构成髓索髓索(3)脾脾 脾切面大部分呈暗红色，称脾切面大部分呈暗红色，称红髓红髓，其中散，其中散布着许多灰白色小结节，为布着许多灰白色小结节，为白髓白髓。白髓是
12、淋巴细胞的聚集处，在白髓是淋巴细胞的聚集处，在中央小动脉中央小动脉周围周围主要是主要是T细胞，是脾的胸腺依区；细胞，是脾的胸腺依区；白髓中的脾小结位于脾动脉白髓中的脾小结位于脾动脉周围淋巴鞘周围淋巴鞘内内一侧，内有生发中心，主要由一侧，内有生发中心，主要由B细胞构成。细胞构成。脾具有脾具有造血造血、储血储血及及免疫免疫等多种功能，是等多种功能，是T、B细胞分化成熟的细胞分化成熟的主要主要场所之一。场所之一。3.髓外造血髓外造血 正常情况下，胎儿出生正常情况下，胎儿出生2个月以后，骨髓以个月以后，骨髓以外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细胞、粒细胞和血小板。胞
13、、粒细胞和血小板。但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢复造血功能（常可导致相应器官肿大），复造血功能（常可导致相应器官肿大），称为称为髓外造血髓外造血。髓外造血髓外造血是机体对血细胞的需求特别增高是机体对血细胞的需求特别增高或对骨髓造血障碍的一种补偿，或对骨髓造血障碍的一种补偿，尤其常见于尤其常见于儿童儿童。这种代偿作用有限且不完善。这种代偿作用有限且不完善。髓外造血部位除髓外造血部位除肝、脾、淋巴结肝、脾、淋巴结外，也可外，也可以累及以累及胸腺、肾、肾上腺、腹腔后脂肪及胸腺、肾、肾上腺
14、、腹腔后脂肪及胃肠道胃肠道。二、造血微环境二、造血微环境 造血微环境造血微环境（hematopoietic microenvironment）是指造血细胞）是指造血细胞生长生长、发育发育的内环境。的内环境。由由微血管系统微血管系统、末梢神经末梢神经、基质基质、基质细胞基质细胞及基质细胞分泌的及基质细胞分泌的细胞因子细胞因子等组成，不仅是等组成，不仅是造血细胞的支架，还可通过细胞之间的相互造血细胞的支架，还可通过细胞之间的相互作用和释放的细胞因子影响造血活动。作用和释放的细胞因子影响造血活动。（一）骨髓微血管系统（一）骨髓微血管系统 骨髓微血管系统是造血微环境的重要组成部骨髓微血管系统是造血微环
15、境的重要组成部分分,其功能在于向造血组织输送营养物质，排其功能在于向造血组织输送营养物质，排出代谢废物，从而有利于造血细胞的更新。出代谢废物，从而有利于造血细胞的更新。毛细血管注人管腔膨大的毛细血管注人管腔膨大的静脉窦静脉窦，再彼此沟，再彼此沟通汇集成通汇集成集合窦集合窦，最后进人，最后进人中央静脉中央静脉。静脉窦静脉窦与与集合窦集合窦（统称为（统称为骨髓血窦骨髓血窦）是骨髓）是骨髓血管系统的核心结构。血管系统的核心结构。血窦（血窦（Sinusoid）是动脉毛细血管分成的是动脉毛细血管分成的不规则窦状腔隙。不规则窦状腔隙。血窦内是成熟的血细胞，血窦之间则充以血窦内是成熟的血细胞，血窦之间则充以
16、骨髓实质骨髓实质(造血索造血索)，主要是活跃的，主要是活跃的造血实质造血实质细胞细胞。血窦壁是由连续的内皮细胞、颗粒状基底血窦壁是由连续的内皮细胞、颗粒状基底膜和外皮细胞所组成，其窦壁的薄厚是可膜和外皮细胞所组成，其窦壁的薄厚是可变的变的,绝大多数的窦壁仅有一层绝大多数的窦壁仅有一层内皮细胞内皮细胞组组成，平时无孔，当血细胞穿过内皮细胞时成，平时无孔，当血细胞穿过内皮细胞时形成临时通道。形成临时通道。不同造血功能的骨髓其微血管的结构不同不同造血功能的骨髓其微血管的结构不同 造血功能旺盛时，骨髓血窦很丰富，窦壁孔隙造血功能旺盛时，骨髓血窦很丰富，窦壁孔隙增多；增多；造血功能低下的骨髓，骨髓血窦减
17、少，无造血造血功能低下的骨髓，骨髓血窦减少，无造血功能的黄骨髓中，微血管呈毛细管状。功能的黄骨髓中，微血管呈毛细管状。骨髓的微血管系统通过调节物质与能量的交换骨髓的微血管系统通过调节物质与能量的交换、血细胞的释放、组织内的酸碱度、氧和二氧、血细胞的释放、组织内的酸碱度、氧和二氧化碳分压等影响造血细胞的增殖和分化。化碳分压等影响造血细胞的增殖和分化。（二）骨髓神经（二）骨髓神经 骨髓的神经来源于骨髓的神经来源于脊神经脊神经，其神经供应十，其神经供应十分广泛，骨髓的全部动脉都伴有神经束，分广泛，骨髓的全部动脉都伴有神经束，其分支缠绕于动脉壁呈网状，神经纤维终其分支缠绕于动脉壁呈网状，神经纤维终止于
18、动脉壁的平滑肌纤维。止于动脉壁的平滑肌纤维。骨髓小动脉上的交感神经纤维受延髓血管骨髓小动脉上的交感神经纤维受延髓血管运动中枢的控制，但绝大多数的骨髓微血运动中枢的控制，但绝大多数的骨髓微血管床主要受血管活性物质的调节。管床主要受血管活性物质的调节。骨髓神经的骨髓神经的作用作用：（1）通过调节血管的舒缩，改变血窦的大小）通过调节血管的舒缩，改变血窦的大小及血流速度的快慢等影响造血及血流速度的快慢等影响造血（2）神经分泌的体液因子可直接作用于造血）神经分泌的体液因子可直接作用于造血细胞细胞（3）基质细胞分泌的细胞因子调节造血功能）基质细胞分泌的细胞因子调节造血功能（三）基质细胞及其分泌的调控因子（
19、三）基质细胞及其分泌的调控因子 骨髓基质细胞骨髓基质细胞包括成包括成纤维细胞纤维细胞、内皮细胞内皮细胞、脂肪细胞脂肪细胞和和巨噬细胞巨噬细胞等，等，它们通过与造血干细胞的密切接触起到它们通过与造血干细胞的密切接触起到支支持持和和营养营养造血细胞的作用。造血细胞的作用。各种基质细胞都有各种基质细胞都有分泌细胞因子分泌细胞因子的功能，的功能，其分泌的生物大分子物质都与造血细胞的其分泌的生物大分子物质都与造血细胞的粘附粘附有关，可粘附固定造血细胞。有关，可粘附固定造血细胞。基质细胞还分泌多种细胞因子，基质细胞还分泌多种细胞因子，如白细胞介素、如白细胞介素、FLT-3配基、干细胞因子、配基、干细胞因子
20、、粒一巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺粒一巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子等，激因子、巨噬细胞集落刺激因子等，这些细胞因子不仅直接作用于造血细胞，而这些细胞因子不仅直接作用于造血细胞，而且作用于基质细胞，改变基质细胞的增殖和且作用于基质细胞，改变基质细胞的增殖和分泌状况，诱导其它细胞因子的生成。分泌状况，诱导其它细胞因子的生成。对造血细胞的增殖、分化和发育成熟起重要对造血细胞的增殖、分化和发育成熟起重要的调控作用。的调控作用。Go on.第二节第二节 造血细胞的生长发育和造血调控造血细胞的生长发育和造血调控一、造血细胞的生长发育一、造血细胞的生长发育 胚胎造血组
21、织的发育是血细胞发生、发育研胚胎造血组织的发育是血细胞发生、发育研究的基础，也是血液学研究必不可少前提。究的基础，也是血液学研究必不可少前提。造血细胞的生长发育是一个连续不断的复杂造血细胞的生长发育是一个连续不断的复杂过程，造血器官内的各种造血细胞在造血微过程，造血器官内的各种造血细胞在造血微环境中通过细胞与细胞之间的相互作用，在环境中通过细胞与细胞之间的相互作用，在各种细胞因子的诱导下，按一定的规律发育各种细胞因子的诱导下，按一定的规律发育成为各种成熟的血细胞，然后释放入血循环成为各种成熟的血细胞，然后释放入血循环中。中。（一）造血细胞生长发育的概念（一）造血细胞生长发育的概念 造血细胞的生
22、长发育包括造血细胞的生长发育包括增殖增殖、分化分化、成成熟熟和和释放释放四个方面。四个方面。造血细胞的造血细胞的增殖增殖是指血细胞通过分裂而使是指血细胞通过分裂而使其数量增加的过程。其数量增加的过程。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。母细胞有丝分裂后形成的子细胞同时都倾向分化母细胞有丝分裂后形成的子细胞同时都倾向分化成熟。成熟。子细胞还可进一步增殖，每增殖一次就越倾向于子细胞还可进一步增殖，每增殖一次就越倾向于进一步分化。进一步分化。一般来讲，一个原始细胞到成熟细胞可经过一般来讲，一个原始细胞到成熟细胞可经过45次分裂，如次分裂，如1个原始红细胞可产生个原始红
23、细胞可产生32个或个或64个成个成熟红细胞。熟红细胞。而巨核细胞的增殖（连续双倍增殖而巨核细胞的增殖（连续双倍增殖DNA）与其他）与其他系统血细胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增系统血细胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增大一倍，但大一倍，但胞质并不分裂胞质并不分裂，属多倍体细胞，形态，属多倍体细胞，形态上也表现为从原始到成熟胞体上也表现为从原始到成熟胞体逐渐变大逐渐变大。造血细胞的分化（造血细胞的分化（differentiation）是指细胞发育过程中是指细胞发育过程中失去失去某些潜能又某些潜能又获得获得新的功能的过程，即由多潜能转变为单潜新的功能的过程，即由多潜能转变为单潜能的过程。能的过程
24、。分裂后的细胞在分裂后的细胞在形态形态和和功能功能上产生了新的上产生了新的特征，分化过程是特征，分化过程是不可逆不可逆的。的。造血细胞的成熟（造血细胞的成熟（maturation）是细胞从造血干细胞定向分化后，从是细胞从造血干细胞定向分化后，从原始原始经经幼稚幼稚到到成熟成熟的细胞发育过程，的细胞发育过程，血细胞越成熟其形态越血细胞越成熟其形态越易易辨认，功能也日辨认，功能也日趋完善。趋完善。成熟的血细胞在骨髓内通过成熟的血细胞在骨髓内通过“髓血屏障髓血屏障”释放入血循环中，各种调节因素控制着血释放入血循环中，各种调节因素控制着血细胞的增殖、分化、成熟和释放，从而维细胞的增殖、分化、成熟和释放
25、，从而维持血细胞持血细胞数量数量和和质量质量的稳定。的稳定。（二）造血细胞生长发育的过程（二）造血细胞生长发育的过程 根据造血细胞的功能和形态特征，根据造血细胞的功能和形态特征，造血细胞的生长发育过程可为：造血细胞的生长发育过程可为：造血干细胞造血干细胞、造血祖细胞造血祖细胞、原始及幼稚细胞原始及幼稚细胞三个阶段。三个阶段。原始及幼稚细胞阶段的细胞是在骨髓涂片中原始及幼稚细胞阶段的细胞是在骨髓涂片中从形态学上可以辨认各系各阶段的血细胞从形态学上可以辨认各系各阶段的血细胞。造血干造血干细胞阶细胞阶段段造血组造血组细胞阶细胞阶段段原始原始及幼及幼稚细稚细胞阶胞阶段段成成熟熟细细胞胞二、造血干祖细胞
26、二、造血干祖细胞 干细胞（干细胞（stem cell）是具有自我复制和多是具有自我复制和多向分化能力的细胞。向分化能力的细胞。早期胚胎中的原始生殖细胞即早期胚胎中的原始生殖细胞即胚胎干细胞胚胎干细胞，具有广泛的发育和分化潜能，称为，具有广泛的发育和分化潜能，称为全能全能干细胞干细胞（totipotent hematopoietic stem cell,T HSC）。）。胚胎干细胞胚胎干细胞可分化为各类组织干细胞，造可分化为各类组织干细胞，造血组织中存在血组织中存在造血干细胞造血干细胞、血管干细胞血管干细胞和和间质干细胞间质干细胞。（一）造血干细胞（一）造血干细胞 造血干细胞造血干细胞（hema
27、topoietic stem cell,HSC）的概念于）的概念于20世纪初就有人提出，但世纪初就有人提出，但当时的含义不甚明确，研究内容模糊不清当时的含义不甚明确，研究内容模糊不清，直至发现了，直至发现了脾集落形成单位脾集落形成单位之后，造血之后，造血干细胞在六七十年代引起了人们的关注。干细胞在六七十年代引起了人们的关注。随着新技术的发展，造血干细胞在临床应随着新技术的发展，造血干细胞在临床应用等方面潜在的巨大价值被逐步发现，目用等方面潜在的巨大价值被逐步发现，目前已成为生命科学研究领域的热门课题。前已成为生命科学研究领域的热门课题。造血干细胞造血干细胞又称又称多能干细胞多能干细胞，由，由中
28、胚层细胞中胚层细胞分化而来，是各种血细胞的分化而来，是各种血细胞的始祖始祖，具有高度，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细胞而难以辨认。胞而难以辨认。在体内造血干细胞多数处于在体内造血干细胞多数处于G0期。期。造血干细胞造血干细胞可增殖分化为可增殖分化为髓系干细胞髓系干细胞和和淋巴淋巴干细胞干细胞。1.造血干细胞的基本特征造血干细胞的基本特征(1)自我更新自我更新：即细胞通过有丝分裂产生的：即细胞通过有丝分裂产生的两个子代细胞与亲代细胞具有相同的特征。两个子代细胞与亲代细
29、胞具有相同的特征。造血干细胞的自我更新是维持其数量平衡的造血干细胞的自我更新是维持其数量平衡的基础，亦称基础，亦称自我维持自我维持。高度的自我更新能力。高度的自我更新能力是造血干细胞基本的生物学特征之一。是造血干细胞基本的生物学特征之一。(2）多向分化多向分化：即造血干细胞具备分化为各：即造血干细胞具备分化为各系造血祖细胞的潜能，是造血干细胞的另系造血祖细胞的潜能，是造血干细胞的另一个基本的生物学特征，造血干细胞的分一个基本的生物学特征，造血干细胞的分化受到多种正负调控因子的调节，在特定化受到多种正负调控因子的调节，在特定的条件下可以分化成红细胞、粒细胞（中的条件下可以分化成红细胞、粒细胞（中
30、性、嗜酸性、嗜碱性）、单核细胞、血小性、嗜酸性、嗜碱性）、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、板、组织嗜碱细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞、B淋巴细淋巴细胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。分化是分化是不可逆不可逆的，造血干细胞一旦定向分的，造血干细胞一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其他的化为某种祖细胞，就不可能再变成其他的祖细胞。祖细胞。2造血干细胞检测造血干细胞检测 单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是判断该细胞为造血干细胞的判断该细胞为造血干细胞的“金标准金标准”。由于造血干细胞的数量极少，且形态上不能由于造血干细胞的数量极少，且
31、形态上不能区别，也没有造血干细胞的表面标志，目前区别，也没有造血干细胞的表面标志，目前还没有建立体外直接测定造血干细胞的方法还没有建立体外直接测定造血干细胞的方法。（1）脾集落测试法脾集落测试法 1961年年Till等首先采用体内试验小鼠脾集落形成间等首先采用体内试验小鼠脾集落形成间接证明了造血干细胞的存在：接证明了造血干细胞的存在：将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造血细胞，动物因造血功能衰竭而死亡；如输以供血细胞，动物因造血功能衰竭而死亡；如输以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中形成红系、粒
32、系、巨核系细胞组成的结节即脾集形成红系、粒系、巨核系细胞组成的结节即脾集落，经证实所有这些细胞都是由单个细胞增殖分落，经证实所有这些细胞都是由单个细胞增殖分化而来，即脾集落形成单位（化而来，即脾集落形成单位（CFU-S）；）；如将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也如将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也能存活。证实了骨髓或血液中存在血液细胞的祖能存活。证实了骨髓或血液中存在血液细胞的祖先细胞。先细胞。20世纪世纪80年代出现了一系列体外检测造血年代出现了一系列体外检测造血干细胞的试验方法，但只能部分证实造血干细胞的试验方法，但只能部分证实造血干细胞干细胞自我更新自我更新和和多向分化多向分
33、化两个特征，两个特征，如混合集落如混合集落(CFU-Mix)培养，培养，高增殖潜能细胞高增殖潜能细胞(HPP-CFC）培养，）培养，原始细胞集落形成细胞（原始细胞集落形成细胞（CFU-Blast)培养培养，长期培养起始细胞（，长期培养起始细胞（LTC-IC)检测等。检测等。（2）单克隆抗体法单克隆抗体法 利用利用FACS自动细胞分选系统分选出单个自动细胞分选系统分选出单个CD34+细胞亚群细胞细胞亚群细胞-CD34+CD38+及及CD34+CD38，在无血清体系中加入各种细胞因子（如在无血清体系中加入各种细胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及及Epo）刺激，结果表明，）刺激，结
34、果表明，CD34+CD38单个细胞可形成原代集落，并可向单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等红系、粒系、巨噬系、巨核系等 细胞分化。细胞分化。证明了证明了CD34+CD38细胞的性能接近于造血干细细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能力，还有实验表明，造血干细胞具有向淋巴细胞力，还有实验表明，造血干细胞具有向淋巴细胞分化的能力。分化的能力。目前造血干细胞的表面标记尚未确定。目前造血干细胞的表面标记尚未确定。一般认为一般认为CD34阳性细胞具有长期重建造血阳性细胞具有长期重建造血的能力，推测部分造血干细胞
35、的能力，推测部分造血干细胞CD34阳性；阳性；CD34阳性阳性CD38阴性细胞比阴性细胞比CD34阳性细胞阳性细胞具有更强的长期造血能力；具有更强的长期造血能力；AC 133阳性细胞也被认为是早期造血细胞阳性细胞也被认为是早期造血细胞的标志。的标志。明确造血干细胞的表面标记不但具有重要明确造血干细胞的表面标记不但具有重要理论价值，也有助于分离纯化高质量的造理论价值，也有助于分离纯化高质量的造血干细胞供临床应用。血干细胞供临床应用。（二）造血祖细胞（二）造血祖细胞 造血干细胞造血干细胞进一步分化为各种进一步分化为各种造血祖细胞造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell
36、）。）。造血祖细胞造血祖细胞是一类由造血干细胞分化而来，是一类由造血干细胞分化而来，但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细胞群，过去称为胞群，过去称为定向干细胞定向干细胞。造血祖细胞有年龄结构，根据其分化能力，造血祖细胞有年龄结构，根据其分化能力，可分为可分为多向祖细胞多向祖细胞和和单向祖细胞单向祖细胞，多向祖细胞可进一步分化多向祖细胞可进一步分化 为单向祖细胞。为单向祖细胞。通过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖通过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖细胞的存在。细胞的存在。产生红细胞的祖细胞称为：产生红细胞的祖细胞称为：红细胞爆式集落形成单位红细胞爆式集
37、落形成单位（BFU-E)（早期）（早期）和和红细胞集落形成单位红细胞集落形成单位(CFU-E)BFU-E 产生粒细胞和单核细胞的祖细胞称为：产生粒细胞和单核细胞的祖细胞称为：粒粒-单核细胞集落形成单位单核细胞集落形成单位（CFU-GM）CFU-GM 产生巨核细胞的祖细胞称：产生巨核细胞的祖细胞称：巨核细胞集落形成单位巨核细胞集落形成单位（CFU-Meg）CFU-Meg 另外，产生嗜酸性粒细胞的祖细胞称为另外，产生嗜酸性粒细胞的祖细胞称为嗜酸性粒细胞集嗜酸性粒细胞集落形成单位落形成单位（CFU-Eo）；）；产生嗜碱性粒细胞的祖细胞称为产生嗜碱性粒细胞的祖细胞称为嗜碱性粒细胞集落形成嗜碱性粒细胞集
38、落形成单位单位（CFU-Bas）；）；产生产生T淋巴细胞的祖细胞称为淋巴细胞的祖细胞称为T淋巴细胞集落形成单位淋巴细胞集落形成单位（CFU-TL）；）；产生产生B淋巴细胞的祖细胞称为淋巴细胞的祖细胞称为B淋巴细胞集落形成单位淋巴细胞集落形成单位(CFU-BL)。这些祖细胞失去了自我更新的能力，但有较强的增殖和这些祖细胞失去了自我更新的能力，但有较强的增殖和定向分化能力。定向分化能力。造血祖细胞表面的主要免疫标记已明确，因此，根据这造血祖细胞表面的主要免疫标记已明确，因此，根据这一特性，可采用流式细胞术或其他免疫学技术来分析造一特性，可采用流式细胞术或其他免疫学技术来分析造血祖细胞，甚至可以使之
39、分离纯化。血祖细胞，甚至可以使之分离纯化。（三）造血干祖细胞的临床应用（三）造血干祖细胞的临床应用 造血干祖细胞的临床应用主要涉及到造造血干祖细胞的临床应用主要涉及到造血干祖细胞移植。血干祖细胞移植。目前造血干祖细胞主要来源于骨髓、外目前造血干祖细胞主要来源于骨髓、外周血和脐血，不同来源的造血干祖细胞周血和脐血，不同来源的造血干祖细胞的移植在临床上各有其优缺点。的移植在临床上各有其优缺点。造血干祖细胞移植主要应用于：造血干祖细胞移植主要应用于：1.血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等；等；2.血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障
40、碍性贫血、异常血红蛋白病、碍性贫血、异常血红蛋白病、Fanconi贫贫血、难治性贫血等；血、难治性贫血等；3.实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等；卵巢癌、神经母细胞瘤等；4.其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免疫性疾病、基因治疗等。疫性疾病、基因治疗等。三、造血调控三、造血调控 造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以保持各种血细胞数量和质量的相对稳定。保持各种血细胞数量和质量的相对稳定。造血调控作用于血细胞发育的每一阶段，体内许多造血调控作用于血细胞发育的每
41、一阶段，体内许多因素参与了这一过程，其中细胞因子的调控占重要因素参与了这一过程，其中细胞因子的调控占重要地位。地位。细胞因子（细胞因子（cytokines）是一组基因编码的低分子是一组基因编码的低分子量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。能是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。（一）（一）集落刺激因子类集落刺激因子类(colony-stimulating factors,CSFs)CSFs在半固体细胞培养中能促进造血细
42、胞在半固体细胞培养中能促进造血细胞集落形成。主要有以下几种：集落形成。主要有以下几种：1.红细胞生成素（红细胞生成素（erythropoietin，EPO）主要的生物学功能是刺激红系祖细胞的增殖和分化，以提高红细胞数量。2.粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)除促进粒系祖细胞形成集落外，G-CSF可诱导某些白血病细胞株分化成熟，激活中性粒细胞的吞噬功能，诱导早期造血干祖细胞从场期进人细胞周期。3.粒一巨噬细胞集落刺激因子粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)GM-CSF除了促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化成熟外，对成熟细胞也产生作用 4.巨噬细胞集落刺激因子（巨噬细胞集
43、落刺激因子（M-CSF）促进单核系祖细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（多系集落刺激因子（multi-CSF）促进造血干祖细胞的增殖、分化，促进多系集落生长。6.血小板生成素（血小板生成素（thrombopoietin,TPO）促进造血干祖细胞的增殖、分化；促进巨核细胞集落形成。（二）（二）白细胞介素白细胞介素（interleukin,IL)白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与造血系统的造血调控，其主要生物学功与造血系统的造血调控，其主要生物学功能见（
44、临床免疫学检验。能见（临床免疫学检验。（三）（三）其他细胞因子其他细胞因子 1.干细胞因子（干细胞因子（stem cell factor,SCF）又称肥大细胞生长因子又称肥大细胞生长因子 促进肥大细胞生长；协同促进造血干祖细胞增殖、分化。2FLT-3配基配基(FLT-3 ligand,FL)诱导处于静止期的造血干祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。目前发现对造血有调节作用的细胞因子有近50种，它们对造血的调控有正向和负向调节，一种细胞因子对一类细胞可能以正向调节为主，而对另一类细胞则可能是反向抑制，并且不同的浓度作用效果也不一样。大多数人类的细胞因子可以通过基因工程制备，有的已成功用于临床，如EP
45、O较早地用来治疗各种贫血，尤其是与肾功能衰竭、化疗、肿瘤骨髓浸润有关的贫血，取得了显著疗效；G-CSF应用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症，骨髓移植和外周血造血干祖细胞的动员等。第三节第三节 造血干祖细胞体外培养技术造血干祖细胞体外培养技术 体内造血干祖细胞在一个极复杂的造血体内造血干祖细胞在一个极复杂的造血微环境中增殖、分化生成血液细胞。微环境中增殖、分化生成血液细胞。体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内的生理环境，将从机体中分离出的造血祖的生理环境，将从机体中分离出的造血祖细胞进行培养，使之生存、增殖分化。细胞进行培养，使之生存、增殖分化。造血祖细胞培养
46、主要应用于：造血祖细胞培养主要应用于：1）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量 2）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义 3）利用人工培养条件易于改变并能严格控制的特点）利用人工培养条件易于改变并能严格控制的特点，研究造血调节；，研究造血调节；4）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。一、造血干祖细胞体外培养的基本条件一、造血干祖细胞体外培养的基本条件（一）实验室条件（一）实验室条
47、件（二）培养的支持物（二）培养的支持物（三）营养液（三）营养液（四）细胞因子（四）细胞因子（五）血清（五）血清 二、造血干祖细胞体外培养二、造血干祖细胞体外培养 各种造血祖细胞的培养条件、体系组成虽有差各种造血祖细胞的培养条件、体系组成虽有差异，但培养过程大致相同。异，但培养过程大致相同。造血祖细胞的培养步骤如下：造血祖细胞的培养步骤如下：（1）分离培养细胞，并制成单个核细胞悬液。）分离培养细胞，并制成单个核细胞悬液。（2）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、刺激因子加入培养体系瓶内，混匀。、刺激因子加入培养体系瓶内，混匀。（3）将配制的培养体系
48、在）将配制的培养体系在37水浴，保温水浴，保温10min。（4）培养体系保温的同时，将琼脂等支持物煮沸）培养体系保温的同时，将琼脂等支持物煮沸融化（甲基纤维素不需加热）。融化（甲基纤维素不需加热）。（5）待支持物降至）待支持物降至40左右，加入培养体系并左右，加入培养体系并混匀。混匀。（6）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔内，一般平行做内，一般平行做3份。份。（7）待培养物冷却凝固后，于）待培养物冷却凝固后，于5%CO2、饱和湿、饱和湿度及度及37温箱内孵育。温箱内孵育。CFU-GM需需710天，天，CFU-E需需7天，天，BFU-E需需14天。天
49、。（8）观察结果。包括记数集落数，对部分难以确）观察结果。包括记数集落数，对部分难以确定细胞性质的集落应固定、染色后分析。定细胞性质的集落应固定、染色后分析。（一）粒一单核细胞系祖细胞（一）粒一单核细胞系祖细胞（CFU-GM）培养）培养【原理】受检者血液或骨髓经过分离获得的单个【原理】受检者血液或骨髓经过分离获得的单个核细胞在适当的细胞因子核细胞在适当的细胞因子(GM-CSF)作用下，在体作用下，在体外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落。每个集落可视为由一单核细胞组成的细胞集落。每个集落可视为由一个粒一单核细胞系祖细胞增殖、
50、分化而来。集落个粒一单核细胞系祖细胞增殖、分化而来。集落数的多少可以反映造血细胞中粒一单核细胞系祖数的多少可以反映造血细胞中粒一单核细胞系祖细胞的水平。细胞的水平。（二）红系祖细胞（二）红系祖细胞（BFU-E,CFU-E）培养）培养【原理】在培养体系中加人适量的【原理】在培养体系中加人适量的EPO，使骨髓，使骨髓中的造血细胞在半固体培养基上形成由红细胞组中的造血细胞在半固体培养基上形成由红细胞组成的集落（成的集落（BFU-E和和CFU-E）。每个集落可视为）。每个集落可视为一个红系祖细胞增殖分化而来，集落的多少可反一个红系祖细胞增殖分化而来，集落的多少可反映造血细胞中红系祖细胞的量。映造血细胞
