1、第一节 药物发现的基本模式第二节 基于整体动物的药物筛选技术第三节 虚拟筛选技术第四节 高通量筛选和高内涵筛选第五节 其他现代药物发现常用技术主要内容第一节 药物发现的基本模式 发现发现主要有两种模式，主要有两种模式，一是偶然发现，二是一是偶然发现，二是主动寻找获得主动寻找获得。随着社会的发展，人们对药物的需求。随着社会的发展，人们对药物的需求还在不断变化，要求将会不断提高。因此，药物发现还在不断变化，要求将会不断提高。因此，药物发现将是一个永远需要进行的研究课题，如何调整和改进将是一个永远需要进行的研究课题，如何调整和改进研究模式和研发策略也成为研究人员普遍面临的一个研究模式和研发策略也成为
2、研究人员普遍面临的一个严峻挑战。严峻挑战。一、药物的偶然发现 偶然发现是指人们在生活过程中，捕捉到的非主观安排的却具有药物特性的现象，由此形成了治疗疾病的药物。例如青霉素、奎宁等药物的发现过程都具有极大地偶然性。偶然发现并非完全是偶然事件，也必须具备获得药物发现的知识和思想准备。但由于偶然发现的随机性，这种药物的发现途径不可能成为要学发展所依赖的途径。二、药物的主动获得（一）药物筛选 1.随机筛选 随机筛选依赖的是具有适当的筛选方法和来源广泛的被筛选样品，两方面的多样性是获得药物的基本条件。2.定向筛选 定向筛选通常是采用特定的筛选方法，对特定的样品群进行筛选。（二）基于靶点的药物发现策略 1
3、.基于GPCR受体的药物发现策略 2.基于激酶的药物发现策略 3.基于离子通道的药物发现策略（三）基于组合的药物发现策略 1.基因组学的药物发现 2.蛋白质组学与药物发现 3.代谢组学与药物发现（四）系统生物学与药物发现（五）网络药理学与新药发现三、药物发现模式的转变 19世纪末以前，药物的发现主要靠亲身体验和临床经验积累，这种模式发现的药物优点是偏重于临床，偏重于应用。19世纪工业革命后，新药发现模式也发生了根本性变化，药物发现速度迅速提高。20世纪后期，药物发现正在向基因组学为基础的现代药物发现模式转变。第二节 基于整体动物的药物筛选技术 在整体动物水平进行药物活性筛选是新药研发过程中的重
4、要技术。20世纪80年代以前，整体动物实验一直是药物筛选的基本方法。随着分子生物学、细胞生物学的快速发展，逐渐形成以分子的细胞水平为主的高通量和高内涵体外筛选技术，它们为加快新药发现发挥了巨大作用。但相对于分子和细胞水平的体外筛选，整体动物水平筛选具有直观、全面的优点。在整体动物水平筛选获得的活性结果对预测被筛选选样品的临床效果和应用前景具有十分重要的价值因此，整体动物水平筛选在新药研发过程中具有不可替代的作用和地位。一、传统整体动物水平筛选技术（一）传统整体动物水平筛选模型 1.自发性动物水平筛选模型 自发性动物模型是在自然情况下试验动物所发生的疾病模型，包括突变系的遗产疾病和近交系的肿瘤模
5、型。突变系的遗传疾病很多，可分为代谢性疾病，分子疾病和特种蛋白质合成异常性疾病等。如无胸腺裸鼠、自发性乳腺癌小鼠、肌肉萎缩症小鼠、肥胖症小鼠、癫痫大鼠自发性高血压大鼠和青光眼兔等。2.诱发性动物模型诱发性动物模型是通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用与动物，造成动物组织、器官和全身一定的损害，出现某些类似于人类疾病的功能、代谢或形态结构方面的病变。例如用化学致癌剂、放射线、病毒诱发的肿瘤等，采用手术方法制备的脑卒中、心急缺血模型等。实验或诱发性动物模型在短时间内可大量复制，并能严格控制各种条件使用复制出的疾病模型是和研究目的的需要，是最常用的动物水平药物筛选模型。3.转基因动物模型转基因
6、动物模型是用实验方法将已发现发的疾病相关基因导入动物的染色体基因组内进行整合，建立与人类相同疾病的并能遗传给后代的一类动物模型。转基因动物模型避免了诱发性动物模型与人类某种症状相似的疾病在致病原因、机制方面不尽相同的缺点，其结果准确、经济、试验次数少，大大缩短了实验时间。目前已研究出大量的转基因动物模型用于药物筛选研究，特别是在抗肿瘤、抗病毒、抗老年痴呆、抗帕金森病的药物筛选中取得突破性进展。（二）传统整体动物水平筛选技术特点 传统整体动物水平药物筛选通常是将受试样品对模型动物处理一定时间后，对比受试药物与正常或模型对照组检测指标变化的差异进而判断样品的作用。在传统整体动物水平进行药物筛选检测
7、指标范围较广，生理、生化、血液、免疫、组织病理学、行为学或生长发育等均可作为检测指标反应药物活性。二、小型模式动物整体水平筛选技术（一）小型模式动物分类 1.线虫 杆状线虫与人类基因高同源性，体积较小，组织透明，容易培养，生命周期较短。目前，线虫主要由于筛选衰老、感染、神经退行性疾病等的防治药物。2.果蝇 果蝇与线虫类似，与人类基因有高度同源性，同时具有体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短、繁殖力强、子代数量多以及便于进行表型分析等多种特点。在利用果蝇建立的疾病模型涉及较多的是神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺病及脆性X综合征等，以及肿瘤、心血管疾病、线粒体病等
8、。3.斑马鱼 斑马鱼是脊椎动物，其心血管系统、视觉系统、免疫系统等与人类相应系统有许多共同点，斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%。相对果蝇、线虫坚硬的表皮，药物吸收困难，斑马鱼胚胎则可通过扩散来吸收药物，因此斑马鱼整体动物模型是非常合适的小分子药物筛选模型。（二）小型模式动物筛选技术特点 由于线虫、果蝇及斑马鱼等小型模式动物具有容易饲养、个体小、繁殖快等优点，已有研究人员将其用于高通量或高内涵药物筛选，操作流程可在96孔或384孔微板中进行。小型模式动物模型是药物整体动物水平筛选新技术的发展趋势，对于提高新药研发速度和效率将起到重要作用，将来有可能取代一些体外模型的等，但其目前仍然主要是
9、作为传统动物模型补充。第三节第三节 虚拟筛选技术虚拟筛选技术一、非药物类化合物排除法二、假阳性化合物排除法三、药效团搜索法四、分子对接法五、分子相似法六、反向分子对接法一、非药物类化合物排除法非药物类化合物制药主要包括以下几种类型：非药物类化合物制药主要包括以下几种类型：存在非药物类元素如过度金属元素的化合物；存在非药物类元素如过度金属元素的化合物；分子量小于分子量小于100100或大于或大于10001000的化合物；的化合物；碳原子总数小于碳原子总数小于3 3的化合物；的化合物；无氮原子、氧原子和硫原子的化合物；无氮原子、氧原子和硫原子的化合物；违反违反“Lipinskis rule of
10、five”Lipinskis rule of five”中两条或两条以上规则的化合中两条或两条以上规则的化合物；物；对于非中暑神经系统的药物筛选，则应排除血脑屏障系数对于非中暑神经系统的药物筛选，则应排除血脑屏障系数logBBlogBB大大于于0.30.3的化合物，其中的化合物，其中logBBlogBB是药物分子在大脑中和血液中稳态浓度比是药物分子在大脑中和血液中稳态浓度比值的对数，即值的对数，即log(log(CbrainCbrain/CbloodCblood)；对于中枢神经系统的药物筛选，则应排除血脑屏障系数对于中枢神经系统的药物筛选，则应排除血脑屏障系数logBBlogBB小于小于0 0
11、的化合物。的化合物。大多数非药物类化合物具备以上特征，因此利用这种排除法，可以排除非特异性的无活性化合物，适用于大多数高通量药物筛选前的化合物样品准备。但也有例外，如抗肿瘤药物的筛选不排除金属有机化合物，麻醉用药的筛选不排除小分子量的化合物等。二、假阳性化合物排除法 理论上讲，具有化学反应活性的化合物本不应该收集到用于药物筛选的化合物样品库中，但实际上化学合成工作者已经为高通量筛选 大量的化学反应中间产物，如醛、环氧化物、卤代烷等。这些化合物无易于与生物大分子发生化学反应，在基于受体、酶或细胞检测试验中总是表现为假阳性，从而干扰药物研发的进程。而在药物筛选的前期，排除这些假阳性化合物的方法称为
12、假阳性化合物排除法 化合物是否为假阳性取决于化合物与生物大分子之间产生的相互作用是源于生物学反应还是化学反应。如果产生生物学反应的化合物是我们寻找的目标，那么产生化学反应的化合物则被认为是假阳性化合物，可以通过这种办法予以排除。但特殊情况下，如果与生物大分子发生某种化学反应的化合物才是我们筛选与发现的目标，这种排除方法则并不适用。三、药效团搜索法药效团模型的构建是先导化合物发现的重要方法。药效团可以通过配体和受体两方面来构建。药物靶点的结构未知时，可以基于配体的结构进行药效团的构建。当化合物的活性已知时，还可以建立药效团的3D-QSAR模型。由于药效团模型是基于活性配体的结构构建的，因此参与模
13、型构建的配体结构类型和配体数目均会影响药效团模型的构成。四、分子对接法 分子生物学和结构生物学的发展使得大量的生物大分子的三维结构被解析，未被解析的受体大分子结构常常可以通过同源建模的方法得到。在此基础上，可以基于药物靶点或同源蛋白的结构，以复合物的配体作为参照化合物，应用分子对接软件，从化合物样品数据库中搜索在空间和化学性质上均与药物靶点活性位点相契合的化合物。当药物靶点具有多个亚型时，应根据治疗疾病的特点，选择对药物靶点特定亚型契合度高，对其他亚型契合度低的化合物，以提高化合物的选择性，减少化合物的毒副作用。五、分子相似法基于分子相似性的虚拟筛选，将一个或多个与蛋白结合的配体结构作为数据库
14、搜寻的条件，从化合物数据库中搜索符合相似标准的化合物，用于高通量药物筛选。六、反向分子对接法将同一个活性分子分别对接到多个蛋白的活性位点，以确定该分子潜在的药物靶点的技术，能够高效、大规模的进行靶点的确定和验证，并预测与毒性相关的靶点。第四节 高通量筛选和高内涵筛选（一）高通量筛选技术高通量筛选技术（high throughput screening，HTS）和高内涵筛选技术（high content screening，HCS）均是以药物发现的基本规律为基础、应用多学科的理论知识、集多种先进技术于一体形成的快速、高效、大规模的药物筛选体系。高通量特点：1.符合药物发现的基本规律，较大限度的利
15、用了药用物质资源，提高了药物发现的概率。2.充分利用药用资源，检测体系一般在2250ul，样品用量一般在微克级别，节省了样品资源3.高度自动化操作：自动连续完成加样、稀释、转移、混合洗版、温孵、检测等操作4.多学科理论相结合（二）高通量筛选的基本过程1.初筛和复筛：在分子、细胞水平筛选样品，检测某一样品对某一靶点是否具有药理活性。2.深入筛选：在初筛和复筛的基础上，采用与初筛不同但密切相关的分子和细胞模型，对活性化合物进行深入的药理作用评价。3.确证筛选：对先导化合物进行更为深入的研究，包括药理作用、代谢过程、一般毒性等多方面的内容，以确定其开发前景。（三）、高通量筛选模型的常用技术方法1.高
16、通量药物筛选模型的一般要求（1）特异性：药物作用特异性和疾病相关特异性（2）灵敏性：一是能灵敏的反映样品在模型上的作用，二是阳性对照与空白对照之间的范围或信噪比能足以反映样品作用的层次。（3）稳定性：根据模型研究过程建立的标准操作程序能够在重复实验中获得一致的结果。（4）可操作性：建立的筛选模型在微量、体外可控条件下稳定的反映筛选结果，可进行大规模实验。2.常用高通量药物筛选模型（1）分子水平药物筛选模型，分为：1）以酶作为药物靶点 2）以受体作为药物靶点（2）细胞水平药物筛选模型：观察被筛选样品对细胞的作用，能反映出药物对细胞生长过程、作用途径的综合作用。（3）其他类型筛选模型：应用生物芯片
17、进行药物筛选，能在微小的芯片上获得大量生物活性数据。3.高通量药物筛选常用检测方法（1）比色检测法：最经典的酶检测方法，通过检测反应的底物或产物在紫外或可见光下最大吸收值的变化，间接测定反应体系中酶的活性（2）荧光检测法 1）荧光强度法 2）荧光偏振检测法 3）均相时间分辨荧光 4）荧光共振能量传递（3）发光检测法（4）放射性核素检测法（5）形态学方法（6）核磁共振检测法4.筛选模型的评价（1）信号本底比（S/B）信号本底比反映的是筛选模型获得的数据与本底数据之间的差距S/B=Msignal/Mbackgroung其中S/B为信号本底比，Msignal为测得信号的数据平均值，Mbackgrou
18、nd为测得的本底数据平均值（2）信噪比（S/N）：信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数（3）信号本底变异系数（CV）：相对变异值可以反映信号的变异情况CV（%）=100SD/M（4）Z因子：在评价药物高通量筛选模型的方法中，Z因子是广泛接受的评价指标。它将评价模型质量的主要参数信号窗和信号变异相结合，达到了良好的评价效果二、高内涵筛选技术（一）高内涵筛选技术的概念所谓高内涵筛选（HCS）是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛选样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。（二）高内涵筛选的优势1.
19、以细胞为单位2.多靶点检测，实现“一药多筛”3.准确可靠（三）高内涵药物筛选的技术和应用1.细胞形态观测（1）全细胞形态检测（2）亚细胞形态检测（3）多细胞或细胞间形态2.细胞毒性研究3.受体功能检测4.信号通路分析5.动态分析检测第五节：其他现代药物发现常用技术现代生物技术的出现深刻影响着药 物的发现和开发的进程。1：生物信息技术 生物信息技术学是综合运用数学、计算机与网络技术以及生物学等手段对各种生物信息进行收集、加工、存储、分析、整理和归纳，并对生物信息做出解析的学科。生物信息学的研究内容主要包括：1 建立、贮存并管理大量的生物学信息库。2 开发计算机用途和统计学方法，分析确定数据库中大
20、量数据的相关性。3 应用已知的生物学信息预测或分析生物大分子或小分子化合物的结构和功能。生物信息学能为药物分子设计提供丰富的数据库，包括药靶的基因序列及表达调控特点、三维结构、受体与配体结合作用、构效关系、化合物生物活性库等，从而为药物分子设计提供导向并促进化物的虚拟筛选。2生物芯片技术 生物芯片技术是指通过微小基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析单元或检测系统，对标记化合物、核酸、蛋白质、细胞或其它生物组份进行准确、规模化的快速筛选或检测。生物芯片也是高质量筛选的主要技术之一，通过在芯片上固定特定的寡核苷酸、cDMA、靶酶、受体蛋白，甚至还包括电信等，实现对候选化合物的大规模筛选。3
21、 表面等离子共振技术 表面等离子共振技术是分子结合与分离时可产生光强度变化，分子结合到一个固相化的生物生物靶分子上，当分析物溶液通过传感器芯片时，结合到靶分子上的分子可被及时检测。基于这一原理,SPR可广泛用于微量蛋白的快速筛选或检测，也可用于小于100Da的分子及完整的细胞功能研究,SPR也可用于高通量快速筛选以及先导化合物的优化，QSAR分析，预测药物的吸收、分布、代谢和排泄过程等。4 转基因技术 转基因技术是近年来发展起来的一种新兴的技术，它包括基因敲入和基因消除两种方式。转基因的特点是分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达。转基因技术的出现为研究药物对机体整体的作用提供了很好的技术
22、手段，为疾病的治疗提供了全新的机制，对创新药物的发现产生极大的促进作用。5 RNA干扰技术 RNA干扰技术是指将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链DNA.导入细胞诱导靶mRNA发生特异性降解从而导致基因沉默的现象。RNAi技术广泛存在于植物动物和人体内，对肌体基因表达的关于病毒感染的防护以及活跃基因的控制等生命活动均具有重要意义。RNAi可以高通量的发现药物靶标基因成为寻找新药作用靶标的有力工具，可高度特异性的干扰表达潜在靶点的基因，从而干扰机体疾病的发生与发展，其效果与高特异性靶蛋白的抑制效果类似。作用机制：病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些进行转录时，常产生一些dsRNAdsRNA。宿主细胞对这些。宿主细胞对这些dsRNAdsRNA迅即产生反应迅即产生反应，其，其胞质中的核酸内切酶胞质中的核酸内切酶DicerDicer将将dsRNAdsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNARNA（大约（大约212123 23 bpbp），即），即siRNAsiRNA。
