1、抗肿瘤药物新药研究药理学教研室药理学教研室讲课内容抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物研究方法抗肿瘤药物研究方法体内法体内法 体外法体外法 抗肿瘤药物机制研究抗肿瘤药物机制研究新靶点抗肿瘤药研究新靶点抗肿瘤药研究抗肿瘤新药研究的实验设计抗肿瘤新药研究的实验设计抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展恶性肿瘤，仍为恶性肿瘤，仍为第一位致死疾病，第一位致死疾病，WHOWHO发表了发表了全全球 癌 症 报 告球 癌 症 报 告20142014，20122012年年全球有全球有14001400万新万新癌症病例，死亡癌症病例，死亡人数达人数达820820万万。中国每年新增病中国每年新增病例
2、为例为350350万，死万，死亡人数为亡人数为250250万万中国新增癌症病中国新增癌症病例高居第一位。例高居第一位。患 病 人 数 为 约患 病 人 数 为 约200/10200/10万万（但低（但低于发达国家）。于发达国家）。每每6 6小时有一名病人诊断为癌症患者。小时有一名病人诊断为癌症患者。2 2月月4 4日是日是“世界癌症日世界癌症日”抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展 肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致对其生长的正常调控，导致克隆性异常克隆性异常增生或凋亡不足
3、增生或凋亡不足而形成的新生物，这种而形成的新生物，这种新生物往往形成局部肿块。新生物往往形成局部肿块。致瘤因素致瘤因素 基因突变基因突变 细胞突变细胞突变 肿瘤肿瘤 良性肿瘤良性肿瘤增殖慢、不转移、易根治、死亡率低增殖慢、不转移、易根治、死亡率低恶性肿瘤恶性肿瘤增殖快、易转移、难根治、死亡率高增殖快、易转移、难根治、死亡率高恶性肿瘤恶性肿瘤根据其组织来源不同可分为三类：根据其组织来源不同可分为三类：癌：癌：由上皮组织引起的恶性肿瘤统称为癌。由上皮组织引起的恶性肿瘤统称为癌。肉瘤肉瘤:由中胚组织引起的恶性肿瘤统称为肉癌。由中胚组织引起的恶性肿瘤统称为肉癌。母细胞瘤：母细胞瘤：其他的恶性肿癌则称为
4、母细胞瘤。其他的恶性肿癌则称为母细胞瘤。治疗方法：术疗、放疗、化疗（治疗方法：术疗、放疗、化疗（抗肿瘤药治疗抗肿瘤药治疗）。）。化疗化疗是利用化学药物是利用化学药物杀死肿瘤细胞杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的抑制肿瘤细胞的生长繁殖生长繁殖和和促进肿瘤细胞的分化促进肿瘤细胞的分化的一种治疗方式，它的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段，原发灶、转移灶和亚临床转是一种全身性治疗手段，原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用。移灶均有治疗作用。抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展l近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。偶然发现偶然发现（氮（氮 芥芥 类）类）l寻找抗癌药的途径寻找抗癌药的途径 随机筛选
5、随机筛选（亚硝基脲类）（亚硝基脲类）推理设计推理设计（抗代谢药物）（抗代谢药物）抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展 l5050年代通过动物筛选化疗药物发现了年代通过动物筛选化疗药物发现了5-FU5-FU、MTXMTX、CTXCTX等，化疗学有了发展。等，化疗学有了发展。l6060年代认识到年代认识到肿瘤细胞动力学肿瘤细胞动力学及及化疗药药代化疗药药代动力学动力学的重要性。大部分目前所用的抗癌药的重要性。大部分目前所用的抗癌药已发现。急淋、睾丸癌等可化疗治愈。已发现。急淋、睾丸癌等可化疗治愈。l7070年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的成熟的化疗
6、方案化疗方案。抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展l8080年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效，探索抗药性产生的原因，化疗疗效，探索抗药性产生的原因，5%5%肿瘤肿瘤患者可治愈。患者可治愈。l9090年代新抗癌药进入临床，年代新抗癌药进入临床，多药耐药基因发多药耐药基因发现现，生物治疗生物治疗，基因治疗基因治疗，辅助治疗辅助治疗改善等，改善等，疗效进一步提高。疗效进一步提高。l目前发展目前发展靶向治疗靶向治疗，肿瘤免疫治疗肿瘤免疫治疗，提高特，提高特异性疗效，减少副作用。异性疗效，减少副作用。l 氮芥类氮
7、芥类l 乙撑亚胺类乙撑亚胺类l 生物烷化剂生物烷化剂 亚硝基脲类亚硝基脲类l （按化学）（按化学）甲磺酸酯及多元醇类甲磺酸酯及多元醇类l 金属铂类配合物金属铂类配合物l 嘧啶拮抗剂嘧啶拮抗剂l 分分 类类1 抗代谢药物抗代谢药物 嘌呤拮抗剂嘌呤拮抗剂l （混和）（混和）（按作用机理）（按作用机理）叶酸拮抗剂叶酸拮抗剂l 抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素l 其它类其它类 植物药有效成份植物药有效成份 （按来源）（按来源）抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展药物分类药物分类直接作用直接作用DNA的药物的药物干扰干扰DNA合成的药物：合成的药物：抗有丝分裂的药物：抗有丝分裂的药物：高等植物提取的天然产物
8、高等植物提取的天然产物（有丝分裂抑制剂）（有丝分裂抑制剂）及其衍生物及其衍生物烷化剂烷化剂金属铂类金属铂类抗生素类抗生素类作用作用DNA拓扑异构酶的药物拓扑异构酶的药物抗代谢药物抗代谢药物 分分 类类2（作用原理）（作用原理）抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展药物分类药物分类抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展新分类新分类1、细胞毒类抗肿瘤药细胞毒类抗肿瘤药2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物3、肿瘤新生血管生成抑制药物、肿瘤新生血管生成抑制药物4、肿瘤耐药逆转剂、肿瘤耐药逆转剂5、细胞分化诱导剂、细胞分化诱导剂6、基因调节药物、基因调节药物
9、7、单克隆抗体药物、单克隆抗体药物抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药1、细胞毒类抗肿瘤药细胞毒类抗肿瘤药1）拓扑异构酶抑制剂）拓扑异构酶抑制剂:喜树碱类化合物2）胸苷酸合成酶抑制剂）胸苷酸合成酶抑制剂:培美曲塞 3）铂类抗肿瘤药物）铂类抗肿瘤药物:顺铂和奥沙利铂抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物1）蛋白酪氨激酶（）蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂）抑制剂:依马替尼2）表皮生长因子受体（）表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶）酪氨酸激酶抑制剂抑制剂:吉非替尼 3）法尼基
10、转移酶抑制剂）法尼基转移酶抑制剂:替匹法尼抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药3.肿瘤新生血管生成抑制药物肿瘤新生血管生成抑制药物 原理：原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管原理：原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，开发和研究能够破坏或抑制血管生成、生成的，开发和研究能够破坏或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物（称为有效地抑制肿瘤生长和转移的药物（称为TA TA 抑制抑制剂），是新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一。剂），是新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一。代表药物代表药物:angiostatin和和endostatin Avastin抗肿瘤药物治疗与发展
11、抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药4.肿瘤耐药逆转剂肿瘤耐药逆转剂代表药物：代表药物：钙拮抗药钙拮抗药（维拉帕米及其衍生物）（维拉帕米及其衍生物）钙调蛋白拮抗药钙调蛋白拮抗药（包括氯丙嗪等吩噻嗪类衍生物）（包括氯丙嗪等吩噻嗪类衍生物）环孢素类环孢素类（及其衍生物（及其衍生物PSC833PSC833，SDZ280-466SDZ280-466等）等）抗雌激素类化合物抗雌激素类化合物（他莫昔芬）等。（他莫昔芬）等。抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药5.细胞分化诱导剂细胞分化诱导剂 原理：通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩原理：通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小、消退的目的已
12、成为当今肿瘤治疗的研小、消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂。药物称分化诱导剂。代表药物：维代表药物：维A A酸类化合物酸类化合物 咪唑衍生物利阿唑咪唑衍生物利阿唑 维A酸类化合物维甲酸类化合物(Retinoic acids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA)，它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件，从而调节靶基因的转录。抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与
13、发展抗肿瘤新药抗肿瘤新药6.基因调节药物基因调节药物1 1）反义药物）反义药物:反义寡核苷酸药物（反义寡核苷酸药物（AODNsAODNs）2 2）DecoyDecoy核酸核酸:双链寡聚核酸双链寡聚核酸 3 3）RNARNA干扰干扰:(RNAinterference:(RNAinterference，RNAiRNAi)是将是将与与mRNAmRNA对应的正义对应的正义RNARNA和反义和反义RNARNA组成的双链组成的双链RNA(dsRNA)RNA(dsRNA)导入细胞，导致其相应的基因沉导入细胞，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制被称为默。这种转录后基因沉默机制被称为RNARNA干干扰
14、（扰（RNAiRNAi）。）。5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAse HAntisense DNA反义寡核苷酸药物（反义寡核苷酸药物（AODNs）反义药物又称反义寡核苷酸药物（反义药物又称反义寡核苷酸药物（AODNs），是指人工合成长度为，是指人工合成长度为1030个碱个碱 基的基的DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的物能与特定的 基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。n反义药物又称反义寡核苷酸药物（AODNs），是指人工合成长度为1030个碱 基的DNA
15、分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的 基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。AODNs 可以与其靶RNA链互补结合，形成RNA-DNA杂交双链。形成的杂交双链可以被RNA酶H识别并消化RNA链，由此释放出的 AODN可以继续与靶RNA链结合，最终导致编码基因沉默。由此可推RNA酶H过多表达可增强各种AODNs效应，反之RNA酶H受抑则降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反与翻译元件竞争空间因此可抑制RNA翻译。另外，AODNs 如果和mRNA结合可作用于内含子外显子接合处以中断其拼接过程。AODNs还可以占领校正RNA细胞内定位的蛋白RNA作用序列，
16、从而扰乱RNA运输n 药物：Vitravenea、反义药物、反义药物抗肿瘤药物治疗与发展抗肿瘤药物治疗与发展药物分类药物分类7、单克隆抗体药物、单克隆抗体药物:代表药物代表药物:曲妥珠单抗曲妥珠单抗（trastuzumab，Herceptin）单克隆抗体单克隆抗体(单抗单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的抗体。程技术制备的抗体。治疗肿瘤的优越性：治疗肿瘤的优越性：（1）单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用）单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用 （2）单抗药物具有更高的疗效）单抗药物具有更高的疗效 （3）单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用）单
17、抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用 将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成，用于肿瘤，病毒感染，心血管疾病等方面。瘤血管生成，用于肿瘤，病毒感染，心血管疾病等方面。抗肿瘤新药发现抗肿瘤新药发现Mathematical modelCell BiologyTarget selectionDrug design(Pre)clinical testing抗肿瘤新药研究策略抗肿瘤新药研究策略 药物药效发现药物药效发现 作用部
18、位作用部位 作用机制作用机制药药物物靶靶点点 药物结合药物结合 新药发现新药发现多靶点机制多靶点机制药效作用药效作用新药发现新药发现抗肿瘤药物研究方法抗肿瘤药物研究方法抗肿瘤药物研究方法抗肿瘤药物研究方法动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药耐药性实验方法抗肿瘤药耐药性实验方法肿瘤细胞凋亡的实验法肿瘤细胞凋亡的实验法抗肿瘤血管生成的实验法抗肿瘤血管生成的实验法动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）n诱发性动物肿瘤实验法诱发性动物肿瘤实验法n自发性
19、动物肿瘤实验法自发性动物肿瘤实验法动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用动物移植性肿瘤实验法（最通用确定用何种动物确定用何种动物确定用何种肿瘤模型确定用何种肿瘤模型确定给药设计、分组确定给药设计、分组确定药物剂量、给药途径确定药物剂量、给药途径确定药效学观察指标确定药效学观察指标u一般指标一般指标u肿瘤评价指标肿瘤评价指标u血液生化指标血液生化指标动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物的选择动物的选择 选用解剖生理特点符合实验目的要求的实验动物做试选用解剖生理特点符合实验目的要求的实验动物做试验，是保证
20、试验成功的关键。实验动物具有的某些解剖生验，是保证试验成功的关键。实验动物具有的某些解剖生理特点，为实验所要观察的器官或组织等提供了很多便利理特点，为实验所要观察的器官或组织等提供了很多便利条件。条件。在抗肿瘤研究的动物实验中，最常用在抗肿瘤研究的动物实验中，最常用的动物是小鼠。的动物是小鼠。常用小鼠品系常用小鼠品系1.BALB/c-nu/nu2.NOD-SCID3.BALB/c4.C57BL/6J5.DBA/26.ICR7.NIH8.KM常用小鼠品系常用小鼠品系近交系近交系C57BL/6BALB/cDBA129C3H突变系小鼠突变系小鼠SCID小鼠小鼠裸小鼠裸小鼠封闭群小鼠封闭群小鼠KMNI
21、H昆明小鼠 早期荷瘤昆明种小鼠早期荷瘤昆明种小鼠 中期荷瘤小鼠中期荷瘤小鼠 中晚期荷瘤小鼠中晚期荷瘤小鼠 中晚期荷瘤小鼠中晚期荷瘤小鼠 晚期荷瘤小鼠晚期荷瘤小鼠 动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物的选择动物的选择肿瘤的移植肿瘤的移植动物移植性肿瘤模型动物实验中心动物实验中心 清洁级准备室清洁级准备室 清洁级走廊清洁级走廊 小鼠饲养室小鼠饲养室动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物的选择动物的选择肿瘤的移植肿瘤的移植移植性动物肿瘤的质量鉴定移植性动物肿瘤的质量鉴定待
22、筛样品的制备待筛样品的制备待筛样品的制备待筛样品的制备合成药的制备合成药的制备抗菌药滤液的制备抗菌药滤液的制备中草药样品的制备中草药样品的制备动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物的选择动物的选择肿瘤的移植肿瘤的移植移植性动物肿瘤的质量鉴定移植性动物肿瘤的质量鉴定待筛样品的制备待筛样品的制备待筛药物的给药途径待筛药物的给药途径剂量的选择及分组动物的确定剂量的选择及分组动物的确定剂量的选择及分组动物的确定剂量的选择及分组动物的确定动物死亡下一步试验剂量0-34不变35-75乘以0.576-100乘以0.25100（24h内）乘以0.
23、2对照组鼠数试验组鼠数对照组鼠数试验组鼠数组数组数动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法n动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物移植性肿瘤实验法（最通用）动物的选择动物的选择肿瘤的移植肿瘤的移植移植性动物肿瘤的质量鉴定移植性动物肿瘤的质量鉴定待筛样品的制备待筛样品的制备待筛药物的给药途径待筛药物的给药途径剂量的选择及分组动物的确定剂量的选择及分组动物的确定疗效评价疗效评价疗效评价疗效评价 瘤重抑制率瘤重抑制率T/C100%100%或瘤重抑制率（或瘤重抑制率（1-T/C）100%100%（T：给药组平均瘤重；：给药组平均瘤重；C：对照组平均瘤重）：对照组平均瘤重）疗效评价疗效评价 瘤重抑制率瘤重抑制率
24、T/C100%100%或瘤重抑制率（或瘤重抑制率（1-T/C）100%100%（T：给药组平均瘤重；：给药组平均瘤重；C：对照组平均瘤重）：对照组平均瘤重）生命延长率（生命延长率（T/C-1）100%100%或生命延长率或生命延长率T/C100%100%（T：给药组平均生存时间；：给药组平均生存时间；C：对照组平均生存时间）：对照组平均生存时间）一般指标：体重、进食、动物一般状态等一般指标：体重、进食、动物一般状态等 肿瘤评价指标：瘤重，相关瘤基因的表达，抑肿瘤评价指标：瘤重，相关瘤基因的表达，抑癌率，肿瘤细胞学指标。癌率，肿瘤细胞学指标。血液生化指标：与肿瘤生长、转移有关的血清学血液生化指标
25、：与肿瘤生长、转移有关的血清学指标以及对免疫、造血系统、肝肾功能的影响等。指标以及对免疫、造血系统、肝肾功能的影响等。其他指标其他指标动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法抗肿瘤药物实验法抗肿瘤药物实验法肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法目的：目的：对候选化合物进行初步筛选；对候选化合物进行初步筛选；了解候选化合物的抗瘤谱；了解候选化合物的抗瘤谱；为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等如剂量范围、肿瘤类别等 肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法体外培养肿瘤细胞系体外培养肿瘤细胞系体外抗癌药物筛选方法体外抗癌药物筛选方法1.1.细胞种类：细
26、胞种类：人肝癌细胞株人肝癌细胞株2.2.培养天数：传代后第培养天数：传代后第1 1天；天；3.3.放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜 X40X40；4.4.培养基种类：培养基种类：1640+10%1640+10%胎牛血清胎牛血清5.5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长 1.1.食管癌细胞株表达食管癌细胞株表达MMPMMP2 2 2.2.培养的天数：培养的天数：2d;2d;细胞倍增时间细胞倍增时间-24h-24h左右；左右；3.3.放大倍速：倒置荧光显微镜，放大倍速：倒置荧光显微镜，100100倍；倍；4.4.培养基种类：培养基种类：1640+10%1640
27、+10%胎牛血清；胎牛血清；5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长；细胞贴壁生长；6.6.目的：鉴定食管癌细胞表达目的：鉴定食管癌细胞表达MMP-2MMP-2，胞浆中绿，胞浆中绿色荧光为色荧光为MMP-2MMP-2，细胞核红色荧光为，细胞核红色荧光为PIPI复染。复染。1.1.细胞种类：人胃肿瘤细胞细胞种类：人胃肿瘤细胞SGC7901SGC7901细胞细胞2.2.培养的天数：培养的天数：2 2天；天；3.3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10X10；4.4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；小牛血清（杭州四季青）；
28、5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长细胞呈梭型贴壁生长 1.1.人成骨肉瘤细胞人成骨肉瘤细胞Saos-2Saos-2细胞细胞2.2.细胞来源：美国细胞来源：美国ATCCATCC3.3.培养天数：传代后培养天数：传代后24h24h4.4.放大倍数：荧光显微镜放大倍数：荧光显微镜4040*5.5.培养基：培养基：85%McCoys 5A+15%FBS85%McCoys 5A+15%FBS6.6.染色方法：染色方法：AOAO7.7.描述：细胞多角形，贴壁良好，铺展面积大描述：细胞多角形，贴壁良好，铺展面积大 1.1.细胞种类：细胞种类：B BNHL(NHL(非何杰金淋巴瘤
29、细胞株非何杰金淋巴瘤细胞株):Daudi):Daudi细胞；细胞；2.2.培养的天数：培养的天数：2d2d；3.3.放大倍数：荧光显微镜显微镜放大倍数：荧光显微镜显微镜 X40X40；Hoechst 33258 Hoechst 33258 染色染色4.4.培养基种类：培养基种类：1640+10%1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，成团生长。细胞呈圆形，成团生长。1.1.细胞种类：细胞种类：小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞;sp2/0;sp2/0 2.2.培养的天数：复苏后培养的天数：复苏后1212小时；小时；3.3.放大倍速：倒置显微镜放大
30、倍速：倒置显微镜 X20X20；4.4.培养基种类：培养基种类：DMEM+6%FBSDMEM+6%FBS；5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈圆型或椭圆形，贴壁生长。细胞呈圆型或椭圆形，贴壁生长。1.1.细胞种类：细胞种类：人纤维肉瘤细胞人纤维肉瘤细胞2.2.培养的天数：培养的天数：5 5天；天；3.3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10X10；4.4.培养基种类：培养基种类：1640+10%1640+10%小牛血清；小牛血清；5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长。细胞贴壁生长。1.1.细胞种类：细胞种类：人口腔皮样癌人口腔皮样癌KBKB细胞
31、株；细胞株；2.2.培养的天数：培养的天数：3d3d3.3.放大倍数：倒置显微镜高倍镜放大倍数：倒置显微镜高倍镜 放大放大4040倍；倍；4.4.培养基种类：培养基种类：1640+10%1640+10%小牛血清；小牛血清；5.5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:贴壁生长细胞，呈不规则形状；贴壁生长细胞，呈不规则形状；BGC823BGC823：人胃腺癌细胞人胃腺癌细胞培养条件：培养条件：DMEMDMEM高糖高糖1010FBSFBS2mML-Glu2mML-Glu 1.K5621.K562：人白血病细胞：人白血病细胞2.2.形态：悬浮细胞、规则、圆形形态：悬浮细胞、规则、圆形3.3.培养条件
32、：培养条件：IMDMIMDM1010FBSFBS4mML-Glu4mML-Glu4.4.每每2 2到到3 3天换一次液，天换一次液，5.5.大约大约1x105cells/ml 1x105cells/ml 肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法体外试验常用方法有：体外试验常用方法有：l染料排斥法染料排斥法l四氮唑盐还原法（四氮唑盐还原法（MTTMTT法）法）l阿拉马蓝法阿拉马蓝法l磺酰罗丹明染色法磺酰罗丹明染色法 l集落形成法集落形成法l生长曲线测定法生长曲线测定法肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法 药物与细胞共培养时间一般为药物与细胞共培养时间一般为48-72 48-72 小小时，贴壁细胞需先
33、贴壁时，贴壁细胞需先贴壁2424小时后再给药。试验小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。Human NCI-H460 lung cancer cell without treatmentHuman NCI-H460 lung cancer cell With Compound A treatment肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法l以以MTTMTT法为例：法为例：试验原理：四氮唑试验原理：四氮唑(MTT)(MTT)是一种能接受氢原子的染料。活细胞线是一种能接受
34、氢原子的染料。活细胞线粒体中与粒体中与NADPNADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶转化成不溶性的蓝紫色的甲臜性的蓝紫色的甲臜(formazan)(formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽基亚讽(DMSO)(DMSO)溶解甲臜后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值溶解甲臜后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。，即可定量测出细胞的存活率。方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT5mg/ml MTT液液2020微升微升/孔，
35、继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于570nm570nm波长处检测波长处检测ODOD值。值。观测指标观测指标 直接指标为直接指标为9696孔板上各被测孔的孔板上各被测孔的ODOD值；然后按公式值；然后按公式（对照组（对照组ODOD值值-治疗组治疗组ODOD值）值）/对照组对照组ODOD值值100%100%计算出相应的细计算出相应的细胞生长抑制率；并进一步采用胞生长抑制率；并进一步采用LogitLogit法计算法计算50%50%生长抑制浓度生长抑制浓度IC50IC50值。值。抗肿瘤药物研究方法抗肿瘤药物研究方法动物肿瘤体内筛选法
36、动物肿瘤体内筛选法肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药作用机制研究方法抗微管药物试验方法抗微管药物试验方法抗癌药对抗癌药对DNADNA拓扑异构酶作用的实验法拓扑异构酶作用的实验法对对型拓扑异构酶作用型拓扑异构酶作用对对I I型拓扑异构酶作用型拓扑异构酶作用反义寡核苷酸药物研究反义寡核苷酸药物研究 （ASONASON：可进行人工大量合成）：可进行人工大量合成）抗肿瘤药物的研究进展及发展方向抗肿瘤药物的研究进展及发展方向 肿瘤组织十分复杂，包含有各群、各期和各型的肿瘤细胞肿瘤组织十分复杂，包含有各群、各期和各型的肿瘤细
37、胞。各群各群：肿瘤由增殖细胞群（干细胞），非增殖细胞群（肿瘤由增殖细胞群（干细胞），非增殖细胞群（Go期细胞）和期细胞）和 无增殖能力细胞群组成；此外还有化疗后产生的耐药细胞群。无增殖能力细胞群组成；此外还有化疗后产生的耐药细胞群。各期各期:增殖细胞群（干细胞）由增殖细胞群（干细胞）由G1期（期（DNA合成前期）、合成前期）、S期（期（DNA 合成期）、合成期）、G2期（细胞分裂前期）和期（细胞分裂前期）和M 期（细胞分裂期）。期（细胞分裂期）。各型各型：恶性肿瘤由包含不同遗传突变的各种细胞混杂构成，恶性肿瘤由包含不同遗传突变的各种细胞混杂构成，而每一而每一 种突变细胞都将造成不同的症状。种突
38、变细胞都将造成不同的症状。有的突变可形成肿瘤有的突变可形成肿瘤；有的会有的会 生成新的毛细血管生成新的毛细血管，供给新生肿瘤营养，促使肿瘤迅速增殖；，供给新生肿瘤营养，促使肿瘤迅速增殖；有的则浸润有的则浸润，侵袭正常组织致扩散转移，形成全身多灶性分布。，侵袭正常组织致扩散转移，形成全身多灶性分布。所以，很难用一种药物来抑制和杀灭肿瘤。所以，很难用一种药物来抑制和杀灭肿瘤。这是联合用药和综合治疗的依据。这是联合用药和综合治疗的依据。癌症的临床特点癌症的临床特点 及及 抗癌药的研究及发展方向抗癌药的研究及发展方向 1.1.难早发现难早发现 发展方向发展方向：由治癌向由治癌向 防癌防癌 （早期诊断试
39、剂）方向发展。（早期诊断试剂）方向发展。2.2.增殖迅速增殖迅速 传统抗癌药能有效地抑制迅速增长的肿瘤组织，但特异传统抗癌药能有效地抑制迅速增长的肿瘤组织，但特异 性较差，毒副作用大。性较差，毒副作用大。研究方向研究方向：高效低毒、高特异性的抗癌药：高效低毒、高特异性的抗癌药 例如：例如：抗体介导酶前体药物（抗体介导酶前体药物（ADEP）肿瘤血管生成抑制剂肿瘤血管生成抑制剂 (TAI)PD-1/PD-L1免疫疗法免疫疗法 2.1 ADEPADEP（抗体介导的酶前体药物）（抗体介导的酶前体药物）前药是一类本身无活性或活性很低，但在体内可转化为活前药是一类本身无活性或活性很低，但在体内可转化为活性
40、物质的药物。利用抗体作为载体携带前药的专一性活化性物质的药物。利用抗体作为载体携带前药的专一性活化酶，可以选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异酶，可以选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子。自性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子。自19871987年年BagshaweBagshawe提出提出ADEPTADEPT这一概念这一概念,已引起了人们广泛的关注已引起了人们广泛的关注,它它克服了以往化学免疫偶联物和免疫毒素存在的许多问题。克服了以往化学免疫偶联物和免疫毒素存在的许多问题。2.22.2 TAI TAI（肿瘤血管生成抑制剂）（肿瘤血管生成抑制剂）体
41、内直径超过体内直径超过2mm2mm实体瘤，瘤体内无一例外都有新生血管的实体瘤，瘤体内无一例外都有新生血管的形成。形成。新生血管的生成是肿瘤发展转移的重要条件新生血管的生成是肿瘤发展转移的重要条件，也是，也是所有癌症的共性。所以抑制新生血管生成可以阻断肿营养所有癌症的共性。所以抑制新生血管生成可以阻断肿营养供给，达到抑制肿瘤和抗转移的目的。供给，达到抑制肿瘤和抗转移的目的。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体程序性死亡受体1，是一种重要的，是一种重要的免疫抑制分子。为免疫抑制分子。为CD28超家族成员超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤细胞杂
42、交瘤2B4.11克隆出来。以克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要移植存活等均有重要的意义。其配体的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相也可作为靶点，相应的抗体也可以起到应的抗体也可以起到相同的作用。相同的作用。PD-1/PD-L1免疫疗法（免疫疗法（immunotherapy）是当前全世界备受）是当前全世界备受瞩目、广为研究的新一类抗癌免疫疗法，旨在瞩目、广为研究的新一类抗癌免疫疗法，旨在充分利用人体自身充分利用人体自身的免疫系统抵御、抗击癌症，通过阻断的免疫系统抵御、抗击癌症，
43、通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使信号通路使癌细胞死亡癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，有望实质性改善患具有治疗多种类型肿瘤的潜力，有望实质性改善患者总生存期。如此诱人的医疗价值和商业前景，各大制药巨头自者总生存期。如此诱人的医疗价值和商业前景，各大制药巨头自然绝不放过，竞赛空前的激烈！包括默沙东、百时美施贵宝、阿然绝不放过，竞赛空前的激烈！包括默沙东、百时美施贵宝、阿斯利康、罗氏。黑色素瘤则是首选被关注的适应症。斯利康、罗氏。黑色素瘤则是首选被关注的适应症。百时美施贵百时美施贵宝的宝的PD-1抑制剂抑制剂Opdivo（nivolumab）于）于2014年年7月在日本月在日本获得批准
44、，成为全球批准的首个获得批准，成为全球批准的首个PD-1抑制剂；而默沙东的抑制剂；而默沙东的Keytruda于于2014年年9月初获月初获FDA批准，是美国批准的首个批准，是美国批准的首个PD-1抑制剂。抑制剂。阿斯利康和罗氏的阿斯利康和罗氏的PD-L1抑制剂也已处于抑制剂也已处于III期临床。期临床。PD-1/PD-L1免疫疗法可用于其它更大范围的肿瘤，如肺癌。单免疫疗法可用于其它更大范围的肿瘤，如肺癌。单药疗法和组合疗法的临床试验紧锣密鼓地进行，以彻底发掘该类药疗法和组合疗法的临床试验紧锣密鼓地进行，以彻底发掘该类神奇药物的最大临床潜力和价值。神奇药物的最大临床潜力和价值。癌症的临床特点癌
45、症的临床特点及及抗癌药研究发展方向抗癌药研究发展方向 3.3.癌细胞易产生耐药性癌细胞易产生耐药性（化疗难点）（化疗难点）增强疗效或者降低增强疗效或者降低 毒性毒性 抗癌药的联合应用抗癌药的联合应用 （综合化疗）（综合化疗）易产生耐药性易产生耐药性 化疗失败（主要原因）化疗失败（主要原因）MDR（多药耐药）：多药耐药）：癌细胞一旦对某种抗癌药产生耐药性，同时对其他结构上无癌细胞一旦对某种抗癌药产生耐药性，同时对其他结构上无 甚相同至作用机理也各异的药物产生交叉耐药性。是导致肿甚相同至作用机理也各异的药物产生交叉耐药性。是导致肿 瘤化疗失败的最重要的原因，瘤化疗失败的最重要的原因，是肿瘤化疗中的
46、一大难点。是肿瘤化疗中的一大难点。研究方向：研究方向：MDR逆转剂逆转剂癌症的临床特点癌症的临床特点及及抗癌药研究发展方向抗癌药研究发展方向 4.4.易转移扩散易转移扩散 临床诊断的肿瘤患者大约有临床诊断的肿瘤患者大约有50%50%以上的已经发了转移，而大部以上的已经发了转移，而大部分癌症患者最后都死于转移。分癌症患者最后都死于转移。研究方向研究方向：抗肿瘤转移药。抗肿瘤转移药。（1 1）肿瘤转移多肽抑制剂，）肿瘤转移多肽抑制剂，（2 2）肿瘤细胞水解酶抑制剂如）肿瘤细胞水解酶抑制剂如：。发展方向：发展方向：体内作用时间长、可口服的伪肽类抗转移药。体内作用时间长、可口服的伪肽类抗转移药。5.5
47、.易复发易复发 方向：方向：杀灭对传统抗癌药不敏感的非增殖期的肿瘤细胞；杀灭对传统抗癌药不敏感的非增殖期的肿瘤细胞；现杀灭癌细胞的基因（抑癌基因）；现杀灭癌细胞的基因（抑癌基因）；通过药物使癌细胞转变成正常细胞（诱导分化）。通过药物使癌细胞转变成正常细胞（诱导分化）。癌症的临床特点癌症的临床特点及及抗癌药研究发展方向抗癌药研究发展方向 6.6.靶向抗肿瘤药物的研究靶向抗肿瘤药物的研究 为什么要进行靶向药物研究？为什么要进行靶向药物研究？如何进行？机制与方法？如何进行？机制与方法？目前有哪些药物已用于临床？目前有哪些药物已用于临床？（自学，写小综述）（自学，写小综述）抗肿瘤药物实验法抗肿瘤药物实
48、验法动物肿瘤体内筛选法动物肿瘤体内筛选法肿瘤细胞体外筛选法肿瘤细胞体外筛选法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药作用机制研究方法抗肿瘤药耐药性实验方法抗肿瘤药耐药性实验方法（自学，可写小综述）（自学，可写小综述）肿瘤细胞凋亡的实验法肿瘤细胞凋亡的实验法（自学，可写小综述）（自学，可写小综述）抗肿瘤血管生成的实验法抗肿瘤血管生成的实验法（自学，可写小综述）（自学，可写小综述）在今后在今后2020年中，随着基因导入系统、基因表达年中，随着基因导入系统、基因表达的可控性的深入研究以及更好更多的治疗基因的的可控性的深入研究以及更好更多的治疗基因的发现，基因治疗将会成为综合治疗恶性肿瘤一种发现，基因治疗将会
49、成为综合治疗恶性肿瘤一种极为有效的方法。并将在防止转移复发方面占据极为有效的方法。并将在防止转移复发方面占据极重要的地位，最终达到根治的目的。极重要的地位，最终达到根治的目的。从发展趋势看，今后治疗癌症将以从发展趋势看，今后治疗癌症将以基因治基因治疗疗和和免疫疗法免疫疗法为主，这是为主，这是肿瘤靶向肿瘤靶向治疗的基础。治疗的基础。作业与考核：作业与考核：1.1.文献小综述文献小综述 （占（占50%50%）2.2.如何设计实验，研究如何设计实验，研究新药新药A A是否有是否有抗肿瘤作用？它是通过什么机制起作抗肿瘤作用？它是通过什么机制起作用的？（占用的？（占50%50%）作业与考核：作业与考核：
50、1.1.文献小综述文献小综述 （50%50%）要求：某新药（抗肿瘤、抗骨质疏松或其他疾病）要求：某新药（抗肿瘤、抗骨质疏松或其他疾病）的研究进展（药物化学、来源、种类、作用与机制、的研究进展（药物化学、来源、种类、作用与机制、临床应用等方面），可特别侧重写某一方面。临床应用等方面），可特别侧重写某一方面。书写包括书写包括摘要、前言、一级和二级提纲（标题）、摘要、前言、一级和二级提纲（标题）、展望展望、参考文献、参考文献（不少于（不少于7 7篇）。篇）。全文不少于全文不少于20200000字（不包括摘要）。字（不包括摘要）。作业与考核：作业与考核：2.2.实验设计（占实验设计（占50%50%）（
