1、抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究 抗肿瘤药根据其作用原理大致抗肿瘤药根据其作用原理大致可以分为以下几类：可以分为以下几类：细胞毒性药细胞毒性药生物反应调节剂生物反应调节剂分化诱导剂分化诱导剂化学预防药化学预防药逆转肿痛耐药性药物逆转肿痛耐药性药物抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法放疗及化疗增效剂放疗及化疗增效剂1.细胞毒性药的药效学研究细胞毒性药的药效学研究这类药可以通过体外和体内两种方法来这类药可以通过体外和体内两种方法来评价其疗效：评价其疗效：体外常用的方法：、噻唑蓝实验法体外常用的方法：、噻唑蓝实验法(MTT法法)
2、、染料排斥试验、生长曲线、染料排斥试验、生长曲线法、集落形成法、法、集落形成法、SRB法法体内常用的方法：动物移植性肿瘤实体内常用的方法：动物移植性肿瘤实验法验法 MTT法的基本原理：法的基本原理：四氮唑四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲转化成不溶性的蓝紫色的甲月替月替(formazan)，而死的细胞则无此功能。用
3、二甲，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽基亚讽(DMSO)溶解甲溶解甲月替月替后，在一定波长下后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。存活率。操作步骤操作步骤:1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含酶消化后，用含10小牛血清的小牛血清的RPMI l640培养基配成培养基配成5000个个ml的细胞悬液，接种在的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种孔培养板中，每孔接种200l，37，5CO2 培养培养24h 2.实验组换新的含不同浓度被测样品的培实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，
4、对照组则换含等体积溶剂的培养基，养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设每组设35平行孔，平行孔，37，5CO2 培养培养45 d3弃去上清液，每孔加入弃去上清液，每孔加入200 l新鲜配新鲜配制的含制的含0.2mgml MTT的无血清培养的无血清培养基基37继续培养继续培养4h。小心弃上清，并加。小心弃上清，并加入入200 l DMSO，用微型超声振荡器混匀，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参，参比波长为比波长为450nm测定光密度值。测定光密度值。结果评定结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑
5、制率：肿瘤细胞生长抑制率肿瘤细胞生长抑制率(1-OD实验实验/OD对照对照)100 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯。合成化合物或植物提取纯品的品的IC5010 gm1或植物粗提物的或植物粗提物的IC5020 gm1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。杀伤作用。染料排斥试验的基本原理：染料排斥试验的基本原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、
6、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。的细胞比例。生长曲线法的基本原理：生长曲线法的基本原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由
7、于代谢产物的积随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。集落形成法的基本原理：集落形成法的基本原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂单个细胞分裂6代或代或6代以上时，其后代代以上时，其后代所组成的群体所组成的群体(集落集落)便含便含50个以上细胞。个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反
8、映了单个细胞的增殖潜力，故析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。常用的认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为集落形成法可分为贴壁法贴壁法及及半固体培养半固体培养法法两种。两种。SRB法的基本原理：法的基本原理：SRB(sulforhodamine B)是一种蛋白质结合是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm波长的波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关读数与细胞数呈良好的线性关系。
9、故可用作细胞数的定量。系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一法的一个缺点是个缺点是OD值可随放置时间而变，而值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。模的试验。动物移植性肿瘤实验法动物移植性肿瘤实验法 大多数肿瘤化疗药物都是经过动物移植大多数肿瘤化疗药物都是经过动物移植性肿瘤试验而被发现的，因此动物移植性肿性肿瘤试验而被发现的，因此动物移植性肿瘤实验法是筛选新药中最通用的方法。瘤实验法是筛选新药中最通用的方法。其优点是其优点是肿瘤生长均匀，个体差异小。肿瘤生长均匀，个体差异小。接种成功率高，可达接种成功率高，可达100。对宿主的影响也
10、类似，易于客观判断对宿主的影响也类似，易于客观判断疗效。疗效。动物移植性肿瘤可在同种或同品系动动物移植性肿瘤可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留，以供实验物中连续移植，长期保留，以供实验用。实验周期较短。用。实验周期较短。缺点：缺点：假阳性问题：由于动物瘤株恶性度高，生假阳性问题：由于动物瘤株恶性度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的肿长迅速，对药物的敏感性比人类自发的肿瘤高得多，且动物肿瘤的生物学特点与人瘤高得多，且动物肿瘤的生物学特点与人癌有较大的差距，因此对动物肿瘤生长有癌有较大的差距，因此对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人癌不一定有效。抑制作用的药物对人癌不一定有效。假阴性问题
11、：一种药物未必对各种类型的假阴性问题：一种药物未必对各种类型的动物移植性肿瘤都有效，选择某一瘤株供动物移植性肿瘤都有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。筛选都可能漏筛药物。对于假阳性问题，现在对于假阳性问题，现在有用人的实体瘤细胞接种在有用人的实体瘤细胞接种在裸鼠上，进行实验来加以克裸鼠上，进行实验来加以克服。服。几种常用的动物移植性肿瘤几种常用的动物移植性肿瘤小鼠白血病小鼠白血病L1210大鼠大鼠Walker-256瘤瘤Lewis肺癌肺癌 白血病白血病L1210是在是在1948年用甲基胆蒽年用甲基胆蒽DBA/2小鼠诱发所得，它是一种能在小鼠诱发所得，它是一种能在DBA/2小鼠及其杂交一代小
12、鼠及其杂交一代BDF1和和CDF1小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在小鼠白血病小鼠白血病1210的实验治疗中，将的实验治疗中，将1 105个腹水细胞接种在个腹水细胞接种在BDFl或或CDFl小鼠小鼠腹腔内。在接种后腹腔内。在接种后24h开始给药治疗，实开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的小鼠平验结束后比较对照组与实验组的小鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。均存活时间，即可判断药物的疗效。Walker256瘤瘤是是1928年在一个怀孕大年在一个怀孕大白鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或
13、肌白鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或肌肉内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。肉内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。在接种后第在接种后第3d开始给药治疗，实验结束后比开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。间，即可判断药物的疗效。Lewis肺癌肺癌是是1951年在一个年在一个C57BL6小鼠上小鼠上发现的自发性肺内的未分化的上皮样癌。该瘤在发现的自发性肺内的未分化的上皮样癌。该瘤在传代中生长迅速，很快见有出血，并在同系小鼠传代中生长迅速，很快见有出血，并在同系小鼠移植时有很高的成活率移植时有很高的成活率(
14、约约98)。且恶性程度较。且恶性程度较高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性较低，但可高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性较低，但可向肺转移，特别是静脉接种时。可在肺形成瘤集向肺转移，特别是静脉接种时。可在肺形成瘤集落，此模型也可用于抗转移的实验研究在接种后落，此模型也可用于抗转移的实验研究在接种后第第l天开始结药治疗。实验结束后比较对照组与天开始结药治疗。实验结束后比较对照组与实验组的瘤重，即可判断药物的疗效。实验组的瘤重，即可判断药物的疗效。2.生物反应调节剂的药效学评价生物反应调节剂的药效学评价 生物反应调节剂生物反应调节剂(biological response modifiers，BRM)是一
15、类能单独或与化疗是一类能单独或与化疗药物同时应用，有助于提高化疗效果，减药物同时应用，有助于提高化疗效果，减低化疗药毒副反应的药物。这类药物主要低化疗药毒副反应的药物。这类药物主要出自植物和微生物，其作用机理大多是调出自植物和微生物，其作用机理大多是调节机体的免疫功能节机体的免疫功能。生物反应调节剂动物实验的特点：生物反应调节剂动物实验的特点：生物反应调节剂以口服剂型为主。生物反应调节剂以口服剂型为主。用药时间长。凡经口服给药者，服药期一般用药时间长。凡经口服给药者，服药期一般为为1530d。对实验动物的要求也较高，多推荐使用近交对实验动物的要求也较高，多推荐使用近交系小鼠。系小鼠。本类药物毒
16、性大多较低，本类药物毒性大多较低，LD50常不能求出，常不能求出，选用选用MTD并参考临床用量为给药剂量的依据。并参考临床用量为给药剂量的依据。生物反应调节剂用于体内抗癌试验生物反应调节剂用于体内抗癌试验的方法，与细胞毒类药物基本一致，但的方法，与细胞毒类药物基本一致，但需注意以下几点差异需注意以下几点差异：给药时间：细胞毒类药物一般在肿瘤接给药时间：细胞毒类药物一般在肿瘤接种后种后24h开始给药，而本类药物开始给药开始给药，而本类药物开始给药的时间和结束时间可以有多种设计，根的时间和结束时间可以有多种设计，根据目的不同较为灵活。据目的不同较为灵活。肿瘤细胞接种量肿瘤细胞接种量：一般比细胞毒类
17、药物：一般比细胞毒类药物低一个数量级，多在低一个数量级，多在11045 个瘤细胞。个瘤细胞。疗程疗程：给药期一般比细胞毒类药物长。：给药期一般比细胞毒类药物长。一些有抑瘤作用的一些有抑瘤作用的BRM类药物，除作类药物，除作肿瘤疗效的筛选外，还需作数项免疫肿瘤疗效的筛选外，还需作数项免疫功能测定指标。功能测定指标。肿瘤是一种分化阻止或分化缺陷病，肿瘤是一种分化阻止或分化缺陷病，采用某种手段克服这种分化缺陷就可使分采用某种手段克服这种分化缺陷就可使分化受阻的恶性细胞向正常分化。分化诱导化受阻的恶性细胞向正常分化。分化诱导剂就是使恶性肿瘤细胞分化成较成熟的细剂就是使恶性肿瘤细胞分化成较成熟的细胞，使
18、之自然死亡，而不是通过杀伤的作胞，使之自然死亡，而不是通过杀伤的作用来治疗恶性肿瘤的一类药物。用来治疗恶性肿瘤的一类药物。3.分化诱导剂的药效学评价分化诱导剂的药效学评价常用的细胞分化诱导研究方法：常用的细胞分化诱导研究方法：细胞形态学及组织化学研究方法细胞形态学及组织化学研究方法细胞功能的研究方法：如吞噬功能测定、血细胞功能的研究方法：如吞噬功能测定、血红蛋白红蛋白(Hb)含量测定、黑色素含量测定、甲含量测定、黑色素含量测定、甲胎蛋白胎蛋白(AFP)和白蛋白和白蛋白(Alb)分泌量的测定、细分泌量的测定、细胞增殖能力测定等。胞增殖能力测定等。与分化有关的基因及其表达的研究方法：癌与分化有关的
19、基因及其表达的研究方法：癌基因是一类主要的增殖分化调控因素。几乎基因是一类主要的增殖分化调控因素。几乎所有增殖旺盛的细胞均有所有增殖旺盛的细胞均有myc表达，表达，c-fos是一是一种分化标志，检测这些基因的表达可以反映种分化标志，检测这些基因的表达可以反映细胞的分化情况。细胞的分化情况。4.化学预防药的药效学评价化学预防药的药效学评价 癌的发生和发展是一个多阶段过程，癌的发生和发展是一个多阶段过程，一般要经历始发突变、促癌和演变三个一般要经历始发突变、促癌和演变三个阶段。根据癌变的多阶段理论及预防药阶段。根据癌变的多阶段理论及预防药物作用的时间顺序，化学预防药物可分物作用的时间顺序，化学预防
20、药物可分为三类：为三类：抗始发剂抗始发剂(antiinitiator)、抗促抗促癌剂癌剂(antipromotor)和和抗演进剂抗演进剂(antiprogressor)评价化学预防药疗效的常用方法评价化学预防药疗效的常用方法 利用利用体外诱导细胞转化体外诱导细胞转化的方法使细胞的方法使细胞发生癌变，在这个过程中加入化学预防药，发生癌变，在这个过程中加入化学预防药，观察对细胞癌变的影响。观察对细胞癌变的影响。软琼脂集落形成实验是检测转化细胞和软琼脂集落形成实验是检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法。肿瘤细胞最为常用的方法。原理：除某些造血细胞外，正常细胞以原理：除某些造血细胞外，正常细胞以及无限
21、细胞系均不能在软琼脂培养中生及无限细胞系均不能在软琼脂培养中生长，只有恶性转化了的细胞和肿瘤细胞长，只有恶性转化了的细胞和肿瘤细胞才能在软琼脂培养中生长并增殖，并且才能在软琼脂培养中生长并增殖，并且在软琼脂培养中的集落形成率与细胞的在软琼脂培养中的集落形成率与细胞的恶性程度呈正相关。因此，用来观察转恶性程度呈正相关。因此，用来观察转化细胞的恶性程度、受试药物对肿瘤细化细胞的恶性程度、受试药物对肿瘤细胞恶性程度、侵袭能力的影响。胞恶性程度、侵袭能力的影响。体内诱癌试验体内诱癌试验 在实验研究中癌化学预防作用的最在实验研究中癌化学预防作用的最可靠指标是对化学致癌的抑制，尤其是可靠指标是对化学致癌的
22、抑制，尤其是在体内对致癌物诱发肿瘤的抑制。在体内对致癌物诱发肿瘤的抑制。常用的比较成熟的化学致癌模型是常用的比较成熟的化学致癌模型是苯并芘诱导的小鼠肺腺癌苯并芘诱导的小鼠肺腺癌体外检测抗致突变作用的方法：体外检测抗致突变作用的方法：抗微核形成实验抗微核形成实验抗抗Ames实验实验非程序非程序DNA合成抑制实验合成抑制实验 抗微核形成实验抗微核形成实验 微核试验是检测环境致癌物、化学诱变剂微核试验是检测环境致癌物、化学诱变剂引起染色体损伤的一种快速、简便的方法。引起染色体损伤的一种快速、简便的方法。原理：遗传毒物或化学诱变剂作用于间期原理：遗传毒物或化学诱变剂作用于间期细胞染色质或有丝分裂染色体
23、和纺锤体时，细胞染色质或有丝分裂染色体和纺锤体时，能导致染色体断裂、断片或整条染色体从能导致染色体断裂、断片或整条染色体从纺锤体脱落、继而在分裂末期及以后的间纺锤体脱落、继而在分裂末期及以后的间期细胞中形成与主核脱离的微核。期细胞中形成与主核脱离的微核。抗抗Ames试验试验Ames试验或称鼠伤寒沙门氏菌回复突试验或称鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是一种经济、敏感和应用广泛变试验，是一种经济、敏感和应用广泛的检测原核生物基因突变的方法。的检测原核生物基因突变的方法。原理：利用沙门氏菌原理：利用沙门氏菌(S.typhimurium)的的遗传基因突变性质，以组氨酸要求性的遗传基因突变性质，以组氨酸要求
24、性的变异变异(his-his+)为指标，当这些菌株欠为指标，当这些菌株欠缺缺DNA损伤的修复功能时，对多种致突损伤的修复功能时，对多种致突变物质具有很高的敏感性。一般通用的变物质具有很高的敏感性。一般通用的菌株是菌株是TA97、TA98、TA100和和TAl02。非程序非程序DNA合成抑制实验合成抑制实验 非程序非程序DNA合成合成(UDS)是指发生在是指发生在S期期以外的与以外的与DNA损伤有关的一种损伤有关的一种DNA合成。合成。它可以通过同位素标记的特异前体它可以通过同位素标记的特异前体(常用常用3H胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷)参入参入DNA而显示。而显示。UDS是目前公认的检测真核细胞基
25、因突变或损是目前公认的检测真核细胞基因突变或损伤修复的有效而经济的一种方法，在当前伤修复的有效而经济的一种方法，在当前被用于研究受试物质的抗始发突变作用。被用于研究受试物质的抗始发突变作用。原理：依据体细胞突变学说，化学致癌物通过对原理：依据体细胞突变学说，化学致癌物通过对DNA的攻击而导致细胞癌变。化学致癌物造成的攻击而导致细胞癌变。化学致癌物造成的的DNA损伤有三种主要类型：碱基损伤、链断损伤有三种主要类型：碱基损伤、链断裂和交链形成。这三种损伤均可引起细胞启动其裂和交链形成。这三种损伤均可引起细胞启动其修复过程而进行修复过程而进行DNA修复。修复。DNA损伤的修复过损伤的修复过程十分复杂
26、，对不同的阶段有不同的检测方法。程十分复杂，对不同的阶段有不同的检测方法。一般习惯上把放射性自显影及液体闪烁计数法显一般习惯上把放射性自显影及液体闪烁计数法显示的非半保留复制的抑制称为非程序示的非半保留复制的抑制称为非程序DNA合成合成抑制试验。抑制试验。肿瘤细胞耐药表型和机制肿瘤细胞耐药表型和机制 肿瘤细胞耐药性按耐药性来源可分为肿瘤细胞耐药性按耐药性来源可分为内在耐药和获得性耐药，按耐药表型内在耐药和获得性耐药，按耐药表型(即即对一种或同时对多种结构和作用机制不同对一种或同时对多种结构和作用机制不同的药物发生耐药的药物发生耐药)来分，可分为原药性和来分，可分为原药性和多药耐药性两种。多药耐
27、药性两种。5.逆转肿瘤耐药性药物的药效学评价逆转肿瘤耐药性药物的药效学评价体外细胞培养的方法体外细胞培养的方法建立耐药的肿瘤细胞株：建立耐药的肿瘤细胞株：例如可以用逐步增例如可以用逐步增加培养基中阿霉素浓度的方法，诱导出一株加培养基中阿霉素浓度的方法，诱导出一株耐阿霉素的人源性白血病细胞系。耐阿霉素的人源性白血病细胞系。缺定剂量：测定被检测药物在敏感细胞株和缺定剂量：测定被检测药物在敏感细胞株和耐药细胞株的细胞毒性，用无毒剂量或小于耐药细胞株的细胞毒性，用无毒剂量或小于IC10的剂量进行试验。的剂量进行试验。测定细胞存活率：多采用测定细胞存活率：多采用MTT法。求出各试法。求出各试验组存活率验
28、组存活率(或抑制率或抑制率)，效果评价用逆转倍，效果评价用逆转倍数数(FR)：FR=IC50（不加逆转剂）（不加逆转剂）/IC50（加逆转剂）（加逆转剂）6.抗肿瘤侵袭、转移药物的药效学评价抗肿瘤侵袭、转移药物的药效学评价 肿瘤转移的基本步骤：肿瘤转移的基本步骤：原发瘤增殖，肿瘤新血管生成。原发瘤增殖，肿瘤新血管生成。肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜、基质和正常细胞。肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜、基质和正常细胞。瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活。瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活。瘤细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并瘤细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并增殖。增殖。瘤细胞穿出血管或淋巴
29、管，在靶器官内形成微瘤细胞穿出血管或淋巴管，在靶器官内形成微转移处。转移处。肿瘤问质内新血管生成，转移瘤快速生长。肿瘤问质内新血管生成，转移瘤快速生长。抗肿瘤侵袭与转移药的评价可以通抗肿瘤侵袭与转移药的评价可以通过过动物实验动物实验和和体外细胞培养体外细胞培养两种方两种方法进行。法进行。动物实验：动物实验：例：小鼠子宫颈癌例：小鼠子宫颈癌U14肾侵袭模型肾侵袭模型 小鼠子宫颈癌小鼠子宫颈癌U14是昆明种小鼠的宫颈癌。是昆明种小鼠的宫颈癌。此瘤株后被移植于此瘤株后被移植于615近交系小鼠，致瘤率近近交系小鼠，致瘤率近100，并呈现血道和淋巴道双重转移的特性。，并呈现血道和淋巴道双重转移的特性。将
30、将U14瘤块接种于瘤块接种于615小鼠的肾包膜下，肿小鼠的肾包膜下，肿瘤生长并向肾实质内侵袭。荷瘤肾脏病理切瘤生长并向肾实质内侵袭。荷瘤肾脏病理切片后，在光镜下观察，用组织学半定量分级片后，在光镜下观察，用组织学半定量分级标准判定肿瘤侵袭肾实质的程度。标准判定肿瘤侵袭肾实质的程度。体外实验：体外实验：例例1：肿瘤细胞球样聚集体的侵袭模型：肿瘤细胞球样聚集体的侵袭模型 通过旋转摇动培养系统将肿瘤细胞制成球通过旋转摇动培养系统将肿瘤细胞制成球样聚集体，在半固体琼脂培养基上与球形鸡样聚集体，在半固体琼脂培养基上与球形鸡胚心肌小块紧密接触，使两者成为复合体。胚心肌小块紧密接触，使两者成为复合体。复合体
31、经过一定时问的旋转摇动培养后，组复合体经过一定时问的旋转摇动培养后，组织学切片观察肿瘤细胞对心肌组织的侵袭程织学切片观察肿瘤细胞对心肌组织的侵袭程度。度。该侵袭模型的特点：该侵袭模型的特点：经过旋转摇动培养后，心肌块的外围被成纤经过旋转摇动培养后，心肌块的外围被成纤维细胞层包绕，使宿主组织表面形成类似浆维细胞层包绕，使宿主组织表面形成类似浆膜样的结构。膜样的结构。心肌组织结构清楚，容易与肿瘤细胞相区别。心肌组织结构清楚，容易与肿瘤细胞相区别。攻击细胞为球体形式，模拟了体内实体瘤结攻击细胞为球体形式，模拟了体内实体瘤结构，便于观察恶性细胞在接触宿主组织后，构，便于观察恶性细胞在接触宿主组织后，如
32、何离开瘤母体而向宿主组织侵袭的过程。如何离开瘤母体而向宿主组织侵袭的过程。可用于癌侵袭过程定量和侵袭形态学模式的可用于癌侵袭过程定量和侵袭形态学模式的研究。研究。例例2：癌细胞对基底膜的浸润实验：癌细胞对基底膜的浸润实验：用一个孔径为用一个孔径为8 8m m的滤膜作为实验用基底的滤膜作为实验用基底膜。膜的上面用半固体凝胶覆盖；下面膜。膜的上面用半固体凝胶覆盖；下面用纤粘连接素覆盖。用纤粘连接素覆盖。B16-BL6B16-BL6细胞加在上细胞加在上面，孵育一段时间后，将下面的细胞固面，孵育一段时间后，将下面的细胞固定染色，进行细胞计数，用以判定细胞定染色，进行细胞计数，用以判定细胞的浸润情况。的
33、浸润情况。例例3.血管内皮细胞生长因子抑制实验：血管内皮细胞生长因子抑制实验：选择特定的肿瘤细胞株，进行培养，选择特定的肿瘤细胞株，进行培养，测定培养基中血管内皮细胞生长因子测定培养基中血管内皮细胞生长因子的含量或用的含量或用RT-PCR测定血管内皮细测定血管内皮细胞生长因子基因的表达情况。胞生长因子基因的表达情况。7.7.放疗及化疗增敏剂的药效学评价放疗及化疗增敏剂的药效学评价 对肿瘤细胞没有毒性或有细胞毒对肿瘤细胞没有毒性或有细胞毒作用，但用小于药物的有效剂量或作用，但用小于药物的有效剂量或毒性剂量与放射线合并作用于肿瘤毒性剂量与放射线合并作用于肿瘤细胞时能加强杀伤肿瘤细胞作用的细胞时能加
34、强杀伤肿瘤细胞作用的药物就被认为是药物就被认为是放疗增敏剂放疗增敏剂。可以用可以用MTT法检测放疗或化疗增敏剂法检测放疗或化疗增敏剂的活性，比较加和不加增敏剂细胞的的活性，比较加和不加增敏剂细胞的死亡情况。死亡情况。放射增敏及化疗增敏的临床应用，将遇到正常放射增敏及化疗增敏的临床应用，将遇到正常组织的耐受性问题。因此，在评价任何增敏剂组织的耐受性问题。因此，在评价任何增敏剂的临床应用可能性时，必须对肿瘤和正常组织的临床应用可能性时，必须对肿瘤和正常组织的反应都作出定量性的评价，评价指标为：增的反应都作出定量性的评价，评价指标为：增益系数益系数(TGF)：TGF=对肿瘤的对肿瘤的DMF/对正常组织的对正常组织的DMFDMF即剂量修饰系数，是反映任何能改变肿瘤即剂量修饰系数，是反映任何能改变肿瘤或正常组织放、化疗反应性的定量参数的统称。或正常组织放、化疗反应性的定量参数的统称。
