1、第六章 微生物检验的基本操作技术第一节 无菌操作一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用肥皂洗
2、手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前2030分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；3.无菌操作原则4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连
3、接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。二、无菌操作的环境要求 无菌室 超净工作台 无菌器材1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染 每日（使用前）紫外线照射（12小时）；每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）；每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。（3）无菌室使用要求 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离
4、在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作1015分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.3.无菌器材（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管
5、架、天平、工作台、手等。（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上只允许摆放以下物品：物物 品品数数 量量物物 品品数数 量量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个试管架2副接种针1个灭菌吸管根据需要消毒棉球1瓶电子称1台洗耳球1个250ml灭菌三角瓶2个镊子1个培养基根据需要油性笔1支混匀器1台三、无菌操作的基本技术1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无无菌操作菌操作。无菌操作技术无菌操作无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接
6、种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞2、微生物检验过程中的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放；（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准；（6）、不能用嘴直接吸吹吸管；（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。3、无菌操作技术详细图解（1）取菌技巧（2）接种技巧（3）错误示范（4）注意事项接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次）（1）取菌技巧A2.试管前端过火3.打打试管盖（1）取菌
7、技巧 A4.试管斜斜倾，放入接种环（1）取菌技巧A5.试管前端过火，盖上試管盖6.接种环烧红灭菌（1）取菌技巧A2.自 平板 上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)1.(方法二：平板反面拿起)（1）取菌技巧 B1.挤出安全安全吸球吸球內空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸，向下为放（1）取菌技巧C1.调整 Pipetman 刻度(P1000 吸取范围 200 1000l)2.插上灭过菌之 Tip(用力插紧)（1）取菌技巧 D3.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下 2 4 mm（1）取菌技巧 D5.慢慢释放按钮，即可 吸取液体（1）取菌技巧 D1.试管前端过火
8、2.打开试管盖（2）接种技巧方法一：以接接种环种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以PipetmanPipetman 吸取菌液，按钮压至最底排出菌液方法二：以安安全吸球全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液（2）接种技巧操作時离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入（3）错误示范（3）错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上（3）错误示范Pipetman 倒放，菌液容易流入 Pipetman 內第二节、微生物的接种、分离纯化和培养技术一、接种1、接种定义 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种；2、接种工具 在
9、实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。划线接种法 斜面接种法 涂布接种法 液体接种法 半固体穿刺接种法 3、微生物检验常见接种方法图4-2平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 1）、平板划线分离法平板划线分离法-分区划线分离法（1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3区依次划线；（2)每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；（3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线12次，使接种量逐渐减少，以获得
10、单个菌落；（4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。2）、斜面接种法主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。以菌种移种为例，其接种方法是：（1）取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧；（2）右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环；（3）以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰12次；（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端；（5）取
11、出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；（6）做好标识，置35培养 箱中培养1824小时。斜面培养一般形成均匀一致的菌苔。一般可观察表面、透明度、色泽等特征。大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面3）稀释涂布分离法：用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于37温箱中培养。4）、液体接种法（肉汤接种）（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以1824小时培养后观察生长特征。肉汤培养可观察如下几项：a.发育程度
12、：有无生长、微弱、中等、旺盛；b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、有颗粒、絮状生长；c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）；d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、颗粒、皱状）；e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察是否产酸和有无气体。5）、穿刺接种法（半固体接种）多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出；（3）
13、经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细菌有动力。液体接种液体接种半固体穿刺半固体穿刺营养肉汤：液体变混浊半固体琼脂培养基（半固体琼脂培养基（0.5%）：扩散生长）：扩散生长二、分离纯化1、几个定义 混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）；纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）；分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为分离纯化。包括倾注平板法、涂
14、布平板法、平板划线法等等。将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。整个操作过程应严格按照无菌操作。2、倾注平板法（倒平板）倒平板技术三、微生物的培养方法微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。通常分为：一般培养法（需氧培养）厌氧培养法 CO2培养
15、法1、一般培养法（需氧培养）培养温度:2537 2、厌氧培养方法（1）简易的厌氧培养法：A、庖肉培养法 B、铁丝圈厌氧培养法 C、焦性没食子酸法（2）厌氧罐法（3）厌氧手套箱法厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气(N2CO2H2=801010，V/V)。厌氧手套箱3、二氧化碳培养法1）烛缸法2）二氧化碳置换法3）化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入。4）二氧化碳培养箱法二氧化碳培养法烛缸法化学
16、法二氧化碳培养箱四、微生物常规鉴定技术 1、形态结构和培养特性观察1）、在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；2）、在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等；3）、半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状
17、 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状细菌各种菌落形态细菌各种菌落形态2、染色镜检1）染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。2）、染色方法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法
18、，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。3）、革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。细菌的革兰氏染色步骤涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同；B）用草酸铵结晶紫染色1min
19、后水洗；C）加碘液媒染1min后水洗；D）斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时2030s，随即水洗；E）用蕃红染液复染30s，水洗；F）用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。革兰氏染色图解革兰氏染色试剂 步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上 步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上 步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层 步骤4：风干 步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟 步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片 步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗 步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗 步骤10：番红复染30秒，用蒸馏水轻轻冲洗 染色后镜检，油镜下的G-和G+2022-8-12693、生化鉴定试验4、血清学试验
