1、实验实验 双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的原理和方法3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法Cu2+碱性溶液碱性溶液紫红色络合紫红色络合物物（双缩脲）一一 实验原理实验原理蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生紫红色络合物。同反应，产生紫红色络合物。蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，
2、并于540560nm下比色，可以通过标准曲线法或对照法求出未知样品的蛋白质浓度。干扰物质：干扰物质：Tris缓冲液和某些氨基酸缓冲液和某些氨基酸，凡含有凡含有CONH2，CH2NH2，CSNH2等等基团的物质都会产生干扰。基团的物质都会产生干扰。缺点：缺点：灵敏度低灵敏度低1-20mg优点：优点：快速（快速（20-30min）不同蛋白质产生颜色的深浅相近不同蛋白质产生颜色的深浅相近 此法常用于需要快速，但并不需要十分此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。精确的蛋白质测定。二二 实验操作实验操作试管编号试管编号 1 2 3 标准蛋白（标准蛋白（mlml）样品（样品（mlml）H H
3、2 2O(ml)O(ml)双缩脲试剂（双缩脲试剂（mlml）1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 1.0 2.0 1.0 1.01.0 4.0 4.0 4.04.0 4.04.0 室温放置室温放置3030分钟，于分钟，于540nm540nm处比色处比色实验注意事项实验注意事项 1、试管要洗干净、试管要洗干净 2、取样要准确、取样要准确 3、加样顺序不可颠倒、加样顺序不可颠倒 4、各管试剂加完后要立即混匀、各管试剂加完后要立即混匀 5、显色后放置时间不可太短或过长、显色后放置时间不可太短或过长 6、仪器在使用前要预热和校准、仪器在使用前要预热和校准原理：原理：物质的电子结构电子结构不同，所能吸
4、收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度吸收特征和吸收强度，对物质进行定性定性和定量和定量的分析方法，常用紫外可见分光光度法。射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光三三 分光光度法分光光度法定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础 物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收A max在一定的实验条件下，在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质物质对光的吸收与物质的浓度成正比。的浓度成正比。A C增增大
5、大定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础I0I参比参比样品样品入射光入射光 I0透射光透射光 Ip 一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。p 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。LambertBeer定律定律A=CLT（透射比）=I/I0=10-CLlg(1/T)=CLA为吸光度；为吸收系数；C C为溶液浓度；L L为溶液光程的厚度应用（1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。（3）比较吸光度的比值 纯DNA8.1280260nmnmAA1.标准曲线法标准曲
6、线法p配制一系列不同浓度的标准溶液（至少5个）按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度（A），以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度（C）为横坐标，制作标准曲线。p 根据样品的A从标准曲线上查得样品含量，再计算出样品的浓度。常用方法常用方法标准系列标准系列未知样品未知样品 标准曲线与样品的测定条件必须一致。标准曲线与样品的测定条件必须一致。待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。2.标准管法标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。3.摩尔吸光系数法摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，
7、也称为摩尔吸光系数。）四四 分光光度计的使用分光光度计的使用单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 1722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色
8、皿中放入比色皿架靠近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”键调透射比为零 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A，此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿洗净比色皿，并盖好盖布。在签名本上签名。返回光路 返回光路返回比色皿的使用比色皿的使用 1.由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色
9、皿。2.同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。3.比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。6.每次使用后,应立即倒空，然后用水冲洗比色皿。空白管的作用空白管的作用 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个吸收，故设置一个空白管空白管，即其中除了待测溶质以外，其，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。它的成分完全相同。测量时，首先以空白管对准光路对仪器测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零调零，既消除，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。所测值即为待测物造成的光吸收。谢谢 谢谢
