1、地中海贫血分子基础及产前诊断南方医科大学徐湘民研究地中海贫血的意义研究地中海贫血的意义 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求研究背景研究背景中国需要解决的研究主题中国需要解决的研究主题 发展用于临床和预防的分子诊断技术发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查
2、高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防开展人群水平的地中海贫血预防指导制定计划指导制定计划大人群监控和预防大人群监控和预防 诊断诊断 筛查筛查 预防预防地中海贫血的研究策略地中海贫血的研究策略研究背景研究背景遗传流行病学调查遗传流行病学调查建立一系列诊断标准和诊断技术建立一系列诊断标准和诊断技术地中海贫血的临床特征地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度中、重度)黄疸黄疸肝脾肿大肝脾肿大 (脾大明显脾大明显)骨髓扩增骨髓扩增发育迟缓发育迟缓合并感染合并感染Barts Barts 水肿胎水肿胎(地贫地贫,宫内或出生后半小时内死亡宫内或
3、出生后半小时内死亡)地中海贫血的血液学表型特征地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数参数 MCV MCH 细胞形态变化细胞形态变化 Hb电泳分析电泳分析 Hb A2 ()或或 ()Hb Barts Hb H()Hb E()地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症血红蛋白电泳图谱血红蛋白电泳图谱1 2 3 4 51.正常人正常人HB2.轻型轻型 地贫地贫 3.异常异常HB E 杂合子杂合子4.新生儿新生儿HB Barts(地贫标准型地贫标准型）5.HB HNormal AA2 AE Barts AF HA+-500V,
4、25min地贫地贫发生的发生的分子病理学经典机制分子病理学经典机制 地贫地贫:基因缺失使基因功能丢失基因缺失使基因功能丢失 地贫地贫:结构基因变异使结构基因变异使转录异常转录异常 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb(-SEA)Deletion (-4.2)Deletion(-3.7)Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失 Globin genes affected by thalassemia deletionSilent carrierThalassemia traitHb H diseaseHydrops fetalisN
5、ormal 地贫疾病严重程度的单倍型顺序 2 1T 2 1 2T 1 1T Hematological data of the proposituse and her family members.Jia SQ,et al.J Clin Pathol,2019;57:164-7.Different point mutations reducing globin gene expression EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Rund.&Rachmilewitz.N.Engl.J.Med.2019,353:1135-46.世界上不同种族的常见世界上不同种族的常见地贫突
6、变地贫突变类型类型 种种 族族 突变类型突变类型 地中海人地中海人 IVS-1,position 110(G A)CD39,nonsense(CAG TAG)IVS-1,position 1(G A)IVS-2,position 745(C G)IVS-1,position 6(T C)IVS-2,position 1(G A)黑人黑人 29,(A G);88,(C T)Poly(A),(AATAAA AACAAA)东南亚人东南亚人,中国人中国人 CD 41-42,Frameshift(CTTT)IVS-2,position 654(C T)28,(A G);Hb E(G A)CD17,non
7、sense(AAG TAG)IVS-1,position 5(G C)亚洲印地安人亚洲印地安人 IVS-1,position 5(G C)619-bp deletion CD 8-9,Frameshift(+G)IVS-1,position 1(G T)CD 41-42,Frameshift(CTTT)Results of blood analysis,DNA diagnosis and Results of blood analysis,DNA diagnosis and mRNA detection in the family members.mRNA detection in the f
8、amily members.Sequencing of the -globin gene amplified from the probandHeterozygosity for the CHeterozygosity for the CT substitution T substitution at position-90 of the-globin geneat position-90 of the-globin gene近年来发现的部分中国南方新突变近年来发现的部分中国南方新突变地中海贫血的产前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的
9、诊断 -地贫的诊断地贫的诊断羊膜穿刺羊膜穿刺 (amniocentesis)抽取胎儿样品示意图抽取胎儿样品示意图 植入前基因诊断植入前基因诊断 Preimplantation genetic diagnosis(PGD)超声产前诊断超声产前诊断 Prenatal diagnosis:Ultrasound measurement 母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断 Prenatal diagnosis:Fetal cells in the maternal circulation 母体血浆或血清中胎儿母体血浆或血清中胎儿DNA分析分析 Analysis of f
10、etal DNA in maternal plasma and serum目前及今后的胎儿产前诊断新技术目前及今后的胎儿产前诊断新技术Ding C,Chiu RW,Lau TK,Leung TN,Chan LC,Chan AY,Charoenkwan P,Ng IS,Law HY,Ma ES,Xu X,Wanapirak C,Sanguansermsri T,Liao C,Ai MA,Chui DH,Cantor CR,Lo YM.MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids:Applicat
11、ion to noninvasive prenatal diagnosis.Proc Natl Acad Sci U S A.2019 20;101(29):10762-7.单碱基延伸产物的质谱分析单碱基延伸产物的质谱分析M FF父亲的突变类型父亲的突变类型SABER:single allele base extension reaction 分子量分子量FMStandard protocol SABER protocol在母血浆在母血浆DNADNA中中排除排除父亲的父亲的地贫突变地贫突变+双亲基因型不同：双亲基因型不同：鉴定母血浆鉴定母血浆DNA中的父亲中的父亲地贫突变地贫突变地中海贫血的产
12、前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的诊断 -地贫的诊断地贫的诊断DNA诊断技术诊断技术 多重多重PCR（multiplex PCR）等位基因特异性性寡核苷酸杂交（等位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO）反向点杂交反向点杂交（RDB）变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLC）基于基于微孔板微孔板(microtiter well-based)高通量检测高通量检测 实时实时PCR(real-time PCR)-50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb(-SEA)Deletion (-4.2)Deletion(-3.7)
13、Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失Location of primers and detection of-SEA deletion by gap-PCRGenotyping of the-SEA alleles by Gap-PCR Chong SS,et al.Blood.2000;95(1):360-2.寡核苷酸探针杂交技术寡核苷酸探针杂交技术ASOASO探针检测探针检测 -地贫基因诊断结果地贫基因诊断结果 PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetectionStreptavidin-PODColor Signal MMem
14、braneASON M N M N MSubstrate(TMB)反反向向点点杂杂交交技技术术RDB analysis:application to rapid prenatal diagnosisRDB analysis:application to rapid prenatal diagnosisfor eight thalassaemia mutations.for eight thalassaemia mutations.GenotypeFather CDs41-42(CTTT)/N MotherIVS-2-654(C T)/N FetusCDs41-42 /IVS-2-654Norm
15、al control N /N Human Human -globin gene and the PCR amplicons-globin gene and the PCR amplicons 5UTREXON 1IVS 1EXON 2IVS 2 IVS2EXON 33UTRFA(453bp)FB(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17 cd26,cd27-28 IVS1-1,IVS1-5 cd37,cd38 cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-6666
16、8 uniquely profiled DHPLC patterns observed from 795 DNA samples实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果中国南方中国南方 和和地中海贫血的预防计划地中海贫血的预防计划人群筛查预防计划的策略人群筛查预防计划的策略 医院水平医院水平(Hospital-based)(Hospital-based)的预防计划的预防计划 社区水平社区水平(community-based)(community-based)的预防计划的预防计划 家系扩展筛查家系扩展筛查(screening extended famili
17、es)(screening extended families)Carrier screening for and thalassemia in pregnancy:the results of an 11-year prospective program in Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Liao C Li J Huang YN Li QM Feng Q Zhong HZ Cui YYSouthern Medical University Mo QH Li
18、LY Hua L Zhang JZ Zeng R Jia SQ Xu XMPrenat Diagn 2019,25:163-71地贫携带者筛查及产前诊断流程地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象被检对象（婚前或孕中期）（婚前或孕中期）血液学分析血液学分析（MCV，Hb A2变化）变化）排除地贫排除地贫地贫携带者地贫携带者遗传咨询，配偶检查遗传咨询，配偶检查血液学分析血液学分析（MCV Hb A2变化）变化）地贫携带者地贫携带者排除地贫排除地贫遗传咨询遗传咨询双亲基因分析双亲基因分析胎儿产前诊断胎儿产前诊断Outcomes of screening program in GZMNH 1993-20
19、19(contd)Prenatal diagnosis in 83 fetuses at-risk for thalassemia(contd)Results in 266 pregnancies where a precisediagnosis was achieved*Three Hb H disease involvedDetection of the-SEA/deletion by 1%agarose gelelectrophoresis of amplified fragments using gap-PCR.筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫地贫1 地贫
20、地贫 地贫地贫 地贫地贫 5.7%3.6%4.4%1.8%Total of 4503 couples screened Outcomes of screening program in GZMNH 1993-201954例例Barts水肿儿和水肿儿和Hb H病病 18例例重型重型地贫地贫 2804 1783 198对对 83对对产前诊断：产前诊断：187 例例 地贫地贫 82例例 地贫地贫 自行研制的东南亚型地贫链免疫学检测试剂盒AB产前遗传学的临床和公共卫生问题产前遗传学的临床和公共卫生问题 利用有效的公共卫生教育资源，首先使医生利用有效的公共卫生教育资源，首先使医生 和公众了解更多的地贫知
21、识和知晓选择遗传和公众了解更多的地贫知识和知晓选择遗传 服务及其对待产前诊断的态度是我们面临的服务及其对待产前诊断的态度是我们面临的 一个重要课题；一个重要课题；2.2.为满足大规模预防工作的需要，我们须大力为满足大规模预防工作的需要，我们须大力 加强专科医生加强专科医生,遗传咨询师，及其他相关专业遗传咨询师，及其他相关专业 人员的培训工作人员的培训工作;3.3.预防监测系统建立过程中，要特别注重转诊、预防监测系统建立过程中，要特别注重转诊、病例登记、实验室质量控制的把关病例登记、实验室质量控制的把关;4.4.政府在组织、基础建设、制定政策法规和行政府在组织、基础建设、制定政策法规和行 政管理上的主导作用是推动预防计划的关键政管理上的主导作用是推动预防计划的关键 因素。因素。(contd)THANK YOU
