1、第八章第八章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学第1页，共45页。原位杂交组织化学（原位杂交组织化学（ISHHISHH）原理：原理：用标记的用标记的DNADNA或或RNARNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。序列的方法。特点：特点：杂交在载玻片上的细胞进行。杂交在载玻片上的细胞进行。分类：分类：根据所用探针和靶核苷酸不同根据所用探针和靶核苷酸不同-DNA-DNA DNA-DNA杂交、杂交、DNA-RNADNA-RNA杂交、杂交、RNA-RNARNA-RNA杂交杂交根据探针标记物是否直接被检测根据探针标记物是否直接被检测 直接法、间接法直接法、间
2、接法第2页，共45页。一一 原位杂交的由来与发展原位杂交的由来与发展（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术v按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种v液相杂交：液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括：液相分子杂交技术包括：吸附杂交吸附杂交 发光液相杂交发光液相杂交 液相夹心杂交液相夹心杂交 复性速率液相分子杂交复性速率液相分子杂交第3页，共45页。v固相杂交：固相杂交：是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜
3、，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交技术包括：固相杂交技术包括：菌落原位杂交菌落原位杂交 斑点杂交法斑点杂交法 Southern Southern印迹杂交印迹杂交 Northern Northern印迹杂交印迹杂交 组织原位杂交组织原位杂交第4页，共45页。（二）原位杂交技术的发展（二）原位杂交技术的发展在近在近2020年飞跃发展的突出特点：年飞跃发展的突出特点：由分子遗传学研究提供的探针大量增加；由分子遗传学研究提供的探针大量增加；探针生产的可靠性和速率大
4、大发展了；探针生产的可靠性和速率大大发展了；非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规技术和非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。临床日常应用的诊断技术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。第5页，共45页。二二 原位杂交组织化学基本技术原位杂交组织化学基本技术v原位杂交的基本方法和应用原则：原位杂交的基本方法和应用原则：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交
5、；杂交后处理；杂交后处理；显示（显示（visualizationvisualization）：）：放射性自显影显色、非放射性标记显色放射性自显影显色、非放射性标记显色第6页，共45页。（一）原位杂交的基本要求（一）原位杂交的基本要求1 1 固定固定2 2 玻片和组织切片的处理玻片和组织切片的处理3 3 杂交杂交4 4 杂交后处理杂交后处理5 5 显示显示6 6 对照实验和对照实验和ISHHISHH结果的判断结果的判断第7页，共45页。1 1 固定固定 固定剂的应用和选择原则：固定剂的应用和选择原则：保持细胞结构；保持细胞结构；最大限度地保持细胞内最大限度地保持细胞内DNADNA或或RNARNA
6、水平；水平；使探针易于进入细胞或组织。使探针易于进入细胞或组织。vDNADNA：比较稳定，对于比较稳定，对于DNADNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。十分重要。vRNARNA：易被降解，在易被降解，在RNARNA的定位上，要使的定位上，要使RNARNA的降解减少到最的降解减少到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分重要，而低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。且取材后应尽快予以冷冻或固定。第8页，共45页。v固定剂：固定剂：多聚甲醛、醋酸多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、酒精混合液、BouinsBouin
7、s固定剂、固定剂、CarnoysCarnoys液液 优缺点：优缺点：沉淀性固定剂：沉淀性固定剂：酒精酒精/醋酸混合液、醋酸混合液、BouinsBouins液、液、CarnoysCarnoys液液 能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNARNA，且对组织结构有损伤。且对组织结构有损伤。戊二醛：戊二醛：能较好地保存能较好地保存RNARNA和组织形态结构，但由于和蛋白质和组织形态结构，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。多聚甲醛：多聚甲醛：仍被公认为仍被公认为ISHHIS
8、HH较为理想的固定剂。较为理想的固定剂。第9页，共45页。多聚甲醛多聚甲醛mRNAmRNA的定位的定位 将组织固定于将组织固定于4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液中多聚甲醛磷酸缓冲液中1 12h2h，在冷冻前浸入，在冷冻前浸入15%15%蔗糖溶液中，置蔗糖溶液中，置44冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%4%多聚甲多聚甲醛约醛约10min10min，空气干燥后保存在，空气干燥后保存在-70-70。如冰箱温度恒
9、定，在。如冰箱温度恒定，在-70-70可保存数月之久不会影响杂交结果。可保存数月之久不会影响杂交结果。第10页，共45页。v病理学活检取材病理学活检取材 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNADNA和和mRNAmRNA有时也可获得杂交信号。有时也可获得杂交信号。v石蜡包埋切片石蜡包埋切片 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过程中可减低程中可减低mRNAmRNA的含量。的含量。v冷冻切片冷冻切片 应用多聚甲
10、醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。满意效果。第11页，共45页。2 2 玻片和组织切片的处理玻片和组织切片的处理 （1 1）玻片的处理）玻片的处理 热肥皂刷洗热肥皂刷洗 自来水清洗自来水清洗 清洁液中浸泡清洁液中浸泡24h 24h 清水洗净清水洗净 烘干烘干 95%95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h 24h 蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 烘干烘干 烘箱温度烘箱温度150150过夜以去除过夜以去除RNARNA酶酶 盖玻片硅化处理盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放第12页，共45页。（2 2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性）增强组织
11、的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长度而定。根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长度而定。常用方法：常用方法：稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100Triton X-100、酒精或某些消、酒精或某些消化酶等。化酶等。优点优点:通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交信号提高杂交信号.缺点缺点:减低减低RNARNA的保存的保存,影响组织结构形态影响组织结构形态.因此，在用量及孵育因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。时间上应慎为掌握。第13页，
12、共45页。（3 3）减低背景染色）减低背景染色 v预杂交（预杂交（PrehybridizationPrehybridization）:是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。背景染色。v杂交后洗涤杂交后洗涤:采用低浓度的采用低浓度的RNARNA酶溶液（酶溶液（20g/ml20g/ml）洗涤一次，去除残留的）洗涤一次，去除残留的和内源性的
13、和内源性的RNARNA酶，减低背景染色。酶，减低背景染色。第14页，共45页。（4 4）防止）防止RNARNA酶的污染酶的污染 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤消除消除RNARNA酶酶,亦可用消毒锅。亦可用消毒锅。要破坏要破坏RNARNA酶，最低温度必须在酶，最低温度必须在150150左右。左右。消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。时空气污染。杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。杂
14、交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。第15页，共45页。3 3 杂交（杂交（HybridisationHybridisation）杂交杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。是是ISHHISHH中关键的而且是最重要的一个环节。中关键的而且是最重要的一个环节。杂交方式杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的加盖片的目的 防止孵育过程中的高温（防止孵育过程中的高温（5050左右）导致杂交液的蒸发左右）导致杂交液的蒸发;硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑硅化的盖玻片的
15、优点是清洁无杂质，光滑,无气泡无气泡,不会影响不会影响组织切片与杂交液的接触组织切片与杂交液的接触;盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。第16页，共45页。第17页，共45页。杂交注意环节杂交注意环节 （1 1）探针的浓度）探针的浓度 原则原则:探针浓度必须给予该实验最大的信探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原噪比值。最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。度为目的。杂交液的量要适当杂交液的量要适当:以以101020l/20l/每张切片为
16、宜。每张切片为宜。杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量过量的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。第18页，共45页。（2 2）探针的长度）探针的长度 最佳长度应在最佳长度应在5050100100个碱基之间。个碱基之间。探针短探针短-易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。500500个碱基的探针个碱基的探针-杂交时间约需杂交时间约需20h20h左右。左右。200200500500个碱基的探针个碱基的探针-可应用可应用.超过超过500500个
17、碱基的探针个碱基的探针-在杂交前最好用碱或水解酶进在杂交前最好用碱或水解酶进 行水解，使其变成短的片段，行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。达到实验所需求的碱基数。第19页，共45页。（3 3）杂交的温度和时间）杂交的温度和时间 杂交温度：杂交温度：DNADNA或或RNARNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂交中，需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂交中，DNADNA、RNARNA探针需要的探针需要的TmTm分别是分别是9090、9595，这种高温对保存组织形态，这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交完整和保持组织切片粘附在载玻
18、片上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和液中加入盐和甲酰胺甲酰胺，减低，减低TmTm。根据探针的种类不同，温度略。根据探针的种类不同，温度略有差异。有差异。第20页，共45页。杂交时间：杂交时间：16-20h16-20h或孵育过夜或孵育过夜甲酰胺：甲酰胺：在杂交液中占在杂交液中占50%50%左右；调节杂交反应温度，利于保左右；调节杂交反应温度，利于保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但具有破持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但具有破坏氢键的不稳定作用。坏氢键的不稳定作用。硫酸葡聚糖：硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%10%左右；是一种大分
19、子左右；是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核酸探针。稠度；促进杂交率，特别是对双链核酸探针。甲酰胺和硫酸葡聚糖：甲酰胺和硫酸葡聚糖：第21页，共45页。（4 4）杂交严格度（）杂交严格度（Hybridization stringencyHybridization stringency）杂交严格度：杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。对杂交体的鉴别程度。错配对杂交的稳定性较完全配
20、对杂交体差，因此，通过控制错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。反应亦然。v低严格度：低严格度：杂交及冲洗条件在杂交及冲洗条件在Tm3540Tm3540之间，高盐或低甲酰之间，高盐或低甲酰胺浓度。大约有胺浓度。大约有70%70%90%90%的同源性核苷酸序列被结合，可导致非的同源性核苷酸序列被结合，可导致非特异性杂交信号的产生。特异性杂交信号的产
21、生。v中严格度：中严格度：Tm 20-30Tm 20-30的范围。的范围。v高严格度：高严格度：为为 Tm10-15Tm10-15，低盐和高甲酰胺浓度。只有具有，低盐和高甲酰胺浓度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。第22页，共45页。4 4 杂交后处理杂交后处理v包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。目的：目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有效地减低通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。背景染色，获得较好的反差效果。洗涤的条件：洗涤
22、的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。v注意事项：注意事项：漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法
23、测背景染色作为改善漂洗程序的指针。背景染色作为改善漂洗程序的指针。第23页，共45页。5 5 显示显示 Visualization 又称检测系统又称检测系统 Detection system根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。测系统进行不同显色处理。放射自显影：放射自显影：图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织：非放射性核酸探针杂交的细胞或组织：酶检测系统显色酶检测系统显色 显微分光光度计或图像分析仪检测。显微分光光度计或图像分析仪检
24、测。第24页，共45页。6 6 对照实验和对照实验和ISHHISHH结果的判断结果的判断 Northern Northern 和和 SouthernSouthern印迹杂交法。印迹杂交法。可用结合的免疫组织化学和可用结合的免疫组织化学和ISHHISHH法从蛋白质（或多肽）水法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应应mRNAmRNA共存于同一细胞中。共存于同一细胞中。预先将切片用预先将切片用DNADNA酶或酶或RNARNA酶消化，然后用酶消化，然后用ISHHISHH技术证明丢失的是技术证明丢失的是DNADNA
25、或或RNARNA。事先与特异性的。事先与特异性的cRNAcRNA或或cDNAcDNA进行杂交。再进行进行杂交。再进行ISHHISHH，其，其结果应为阴性。由于同一结果应为阴性。由于同一RNARNA探针和组织内探针和组织内 mRNAmRNA序列顺序是相同的，序列顺序是相同的，应用其进行应用其进行ISHHISHH，结果应为阴性。，结果应为阴性。检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。情况下进行。多因素都将影响多因素都将影响ISHHISHH的实验结果。的实验结果。第25页，共45页。（二）核酸探针（二）核酸探针v1 1 核酸探针
26、的种类核酸探针的种类v2 2 探针的标记与应用探针的标记与应用 第26页，共45页。1 1 核酸探针的种类核酸探针的种类 （1 1）按标记方式分类）按标记方式分类 直接法和间接法：直接法和间接法：）直接标记探针）直接标记探针 应用藕联异硫氰酸荧光素（应用藕联异硫氰酸荧光素（FITCFITC）或罗丹明）或罗丹明RhodamineRhodamine等荧光等荧光物质的物质的dNTPdNTP或或NTPNTP直接标记探针，杂交洗涤后即可在显微镜下检测。直接标记探针，杂交洗涤后即可在显微镜下检测。）间接标记探针）间接标记探针 采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标记探针，杂采用生物素或地高辛等半抗原分子
27、作为分子标记探针，杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体进行交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体进行检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微镜下观检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微镜下观察分析。察分析。第27页，共45页。两种方法的比较：两种方法的比较：v（1 1）直接标记的）直接标记的DNADNA探针杂交后经过简单洗涤就可显示探针杂交后经过简单洗涤就可显示杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需通过杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需通过繁琐的检测步骤；繁琐的检测步骤；v（2 2）间接标记的探针可进行多步骤信号放大，但其受配基亲和）间接标
28、记的探针可进行多步骤信号放大，但其受配基亲和力的影响。而直接标记的信号放大一般受到限制，目前多用力的影响。而直接标记的信号放大一般受到限制，目前多用DuponDupon公司的公司的TSATSA系统进行直接标记信号的放大。系统进行直接标记信号的放大。v（3 3）对于多色）对于多色FISHFISH，往往选择直接标记法标记探针。，往往选择直接标记法标记探针。第28页，共45页。（2 2）按核酸性质分类）按核酸性质分类 DNA DNA探针探针 cDNA cDNA探针探针 RNA RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针（3 3）按染色体上位置分类：）按染色体上位置分类：重复序列探针重复序列探针 涂染探
29、针涂染探针 基因探针及其它基因探针及其它第29页，共45页。2 2 探针的标记与应用探针的标记与应用 v切口平移法（切口平移法（Nick translationNick translation）v随机引物法随机引物法 (Random Primer)(Random Primer)v末端标记法末端标记法vPCRPCR标记法标记法v体外转录标记法体外转录标记法不同模板需不同标记方法不同模板需不同标记方法第30页，共45页。生物素标记生物素标记cRNAcRNA探针探针在原位杂交组织化学中的应用在原位杂交组织化学中的应用1 1 光敏生物素标记光敏生物素标记cRNAcRNA探针的应用探针的应用2 2 酶促
30、生物素标记酶促生物素标记cRNAcRNA探针的应用探针的应用第31页，共45页。v1 1 光敏生物素标记光敏生物素标记cRNAcRNA探针的应用探针的应用 光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照101020min20min，生，生物素就结合在物素就结合在DNADNA或或RNARNA分子上，属于化学修饰法，此方法简单；成分子上，属于化学修饰法，此方法简单；成本低；适用于大量制备（本低；适用于大量制备（50ug50ug）。）。v光敏生物素试剂种类：光敏生物素试剂种类：光生物素（乙酸盐）光生物素（乙酸盐）补骨脂素生物素。补骨脂素生物素。生物素生物
31、素-聚乙二醇聚乙二醇-当归素（当归素（BPABPA）：在长波）：在长波UVUV下它可与下它可与DNADNA碱基碱基共价键结合。共价键结合。BPABPA反应物与反应物与DNADNA结合比光敏生物素更特异，在可结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPABPA只标记粗制细胞裂只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。第32页，共45页。第33页，共45页。v光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：石蜡切片脱蜡入水后，石蜡切片
32、脱蜡入水后，PBSPBS洗；冰冻切片直接入洗；冰冻切片直接入PBSPBS洗。洗。0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸甘氨酸PBSPBS洗洗5min5min。0.4%Trixtion X-100 PBS0.4%Trixtion X-100 PBS洗洗15min15min。1ug/ml1ug/ml蛋白酶蛋白酶K K，3737保温保温30min30min。4%4%多聚甲醛多聚甲醛PBSPBS固定。固定。0.1mol/L PBS0.1mol/L PBS洗洗2 23min3min。0.25%0.25%乙酸酐乙酸酐10min10min。2 2SSCSSC洗洗10min10min。取取10ul10ul含相
33、应含相应探针探针的杂交液滴于标本上，如果是的杂交液滴于标本上，如果是cDNAcDNA探探针，则用前将探针于针，则用前将探针于9595水浴中保温水浴中保温10min10min，马上冰浴冷，马上冰浴冷却，然后再用。却，然后再用。10 10 盖上硅化盖玻片或蜡膜，盖上硅化盖玻片或蜡膜，4343湿盒保温湿盒保温1216h1216h。第34页，共45页。11 411 4SSCSSC洗脱盖片，并在同一液中，洗脱盖片，并在同一液中，3737漂洗漂洗10-30min10-30min。12 212 2SSCSSC（含（含20ug/mlRNaesA20ug/mlRNaesA，适于，适于RNARNA探针）探针）37
34、37洗洗30min30min。13 113 1SSCSSC，0.10.1SSCSSC，3737各漂洗各漂洗10-30min10-30min。14 0.05mol/L PBS14 0.05mol/L PBS洗洗4 45min5min。15 3%BSA15 3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS0.4%Triton X-100 PBS配）配）3737保温保温30min30min。16 16 碱性磷酸酶碱性磷酸酶室温室温13h13h。17 0.05mol/L PBS17 0.05mol/L PBS洗洗4 45min5min。18 18 缓冲液缓冲液洗洗2 25min5min。19 19
35、 缓冲液缓冲液洗洗2 25min5min。20 20 NBT/BCIPNBT/BCIP液液显色，室温，暗处显色，室温，暗处3h3h。21 20mmol/L EDTA21 20mmol/L EDTA，pH8.0pH8.0终止显色。终止显色。22 22 甘油明胶直接封片。甘油明胶直接封片。第35页，共45页。2 2 酶促生物素标记酶促生物素标记cRNAcRNA探针的应用探针的应用原理：原理：酶促生物素标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加酶促生物素标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸掺入到探针尾法等把修饰的核苷酸掺入到探针DNA DNA 中，制成标记探针，中，制成标记
36、探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。反应步骤如下：反应步骤如下：用用PBSPBS冲洗黏附有切片的载玻片。冲洗黏附有切片的载玻片。将载玻片浸入将载玻片浸入0.3%H0.3%H2 2O O2 2，以封闭内源性过氧化物酶。，以封闭内源性过氧化物酶。PBS PBS洗洗2 23min3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室温，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室温1h1h或或44过夜。过夜。PBS PBS洗洗2 23min3min。第36页，共45页。加生物素化室温加生物素化室温30min30min孵育。孵育。PBS PBS
37、洗洗2 23min3min。应用应用ABCABC复合物与等量的复合物与等量的1%1%牛血清白蛋白牛血清白蛋白-PBS-PBS液混合，室液混合，室 温孵育温孵育1h1h。PBS PBS洗洗2 23min3min。DAB DAB溶液孵育溶液孵育3-15min3-15min。水洗，复染，脱水，透明和以甘油水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS/PBS或或DPXDPX封固。封固。第37页，共45页。地高辛标记地高辛标记cRNAcRNA探针的应探针的应用用第38页，共45页。地高辛标记地高辛标记cRNAcRNA探针的应用探针的应用原理：原理：地高辛（地高辛（DigDig）为类固醇半抗原，仅存在于洋地黄类
38、植物，其）为类固醇半抗原，仅存在于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物无交叉反应，地高辛标记于脱氧抗体与其它任何固醇类似物无交叉反应，地高辛标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（尿嘧啶三磷酸核苷（dUTPdUTP）上形成）上形成Dig-11-dUTPDig-11-dUTP。通过随即引。通过随即引物或缺口平移法，将物或缺口平移法，将Dig-11-dUTPDig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构与探针的核酸分子相连，构成成Dig-Dig-配基标记的核酸探针。配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条
39、件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的抗地高辛抗体结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显素的抗地高辛抗体结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。第39页，共45页。常用的免疫酶学检测方法：常用的免疫酶学检测方法：Dig-HRPDig-HRP检测系统：检测系统：以以DAB/HDAB/H2 2O O2 2为底物，结果为棕色；为底物，结果为棕色；以以4-4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/H/H2 2O O2 2为底物，结果为蓝色。为底物，结果为蓝色。Dig-AKPDig
40、-AKP检测系统：检测系统：以以BCIP/NBTBCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。为底物，结果为蓝紫色沉淀。AKPAKP灵敏度和分辨率较灵敏度和分辨率较HRPHRP高，但高，但HRPHRP的优点为廉价、稳定。的优点为廉价、稳定。第40页，共45页。地高辛标记的核酸探针较稳定，地高辛标记的核酸探针较稳定，-20-20储存可达储存可达2 2年，随时可以年，随时可以取用，但在现实应用中，人们仍采用新鲜的地高辛标记取用，但在现实应用中，人们仍采用新鲜的地高辛标记3-63-6个个月以内的核酸探针。为节省核酸探针的用量，凡使用过的含有月以内的核酸探针。为节省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的杂交
41、液也可反复多次使用。探针的杂交液也可反复多次使用。地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。由于地高辛标记由于地高辛标记cRNAcRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，我们在基本方法中较详细的叙述其操作过程广泛的应用，我们在基本方法中较详细的叙述其操作过程 。地高辛探针
42、的应用地高辛探针的应用第41页，共45页。基本操作步骤：基本操作步骤：1 1）组织处理）组织处理 冷冻切片：冷冻切片：切片贴在预先清洁、高温处理并涂以粘附剂的载玻切片贴在预先清洁、高温处理并涂以粘附剂的载玻片上，先在片上，先在3737预干燥预干燥4h4h，然后置于，然后置于3737烤箱中过夜。经过上述烤箱中过夜。经过上述处理的切片在处理的切片在-20-20可保存周，在可保存周，在-70-70可保存数月之久，可保存数月之久，也有报告可保存数年之久的，但仍以新鲜制片为好。也有报告可保存数年之久的，但仍以新鲜制片为好。石蜡包埋切片：石蜡包埋切片：应脱蜡经梯度酒精脱水。一般不提倡浸入二甲苯溶应脱蜡经梯
43、度酒精脱水。一般不提倡浸入二甲苯溶液，但在细胞内液，但在细胞内mRNAmRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后人能显示。经水洗后含量高时应用二甲苯脱蜡后人能显示。经水洗后经经3737烤箱烤箱4h4h或者过夜，然后进行杂交前的处理。或者过夜，然后进行杂交前的处理。第42页，共45页。下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。PBS PBS洗洗2 23min3min。选择几张切片作为选择几张切片作为RNARNA酶对照片。其他切片暂放于酶对照片。其他切片暂放于PBSPBS内。内。蛋白激酶蛋白激酶K K消化：将组织切片放在消化：将组织切片放在LEDTALEDT
44、A中孵育中孵育15-20min15-20min。消化。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。0.1mol/L 0.1mol/L甘氨酸甘氨酸/PBS 5min/PBS 5min终止蛋白激酶终止蛋白激酶K K反应。反应。在在4%4%多聚甲醛多聚甲醛/PBS 3min/PBS 3min。以以PBSPBS漂洗漂洗2 23min3min。浸入新鲜配制的浸入新鲜配制的0.25%0.25%乙酸酐以封闭非特异性结合部位。乙酸酐以封闭非特异性结合部位。2 2SSCSSC漂洗漂洗15min15min。第43页，共45页。2 2）杂交）杂交 以含以含cRNAcRNA探针
45、（探针（0.5ng/ml0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片）的杂交液，按每张切片10-20ul10-20ul的量覆盖切片。的量覆盖切片。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2 2SSCSSC湿盒内在湿盒内在4242，161618h18h过夜。过夜。3 3）显示）显示 用缓冲液用缓冲液冲洗杂交后的载波片冲洗杂交后的载波片2 23min3min。浸入缓冲液浸入缓冲液中室温孵育中室温孵育10min10min，以封闭非特异性部位。，以封闭非特异性部位。加数滴抗地高辛抗血清，室温孵育加数滴抗地高辛抗血清，室温孵育2h2h。缓冲液缓冲液漂洗漂洗3 33min3m
46、in；浸入缓冲液；浸入缓冲液，室温，室温10min10min。第44页，共45页。浸入浸入BCIP/NBTBCIP/NBT中，室温孵育中，室温孵育101030min30min（或更长时间，视需要而定）。（或更长时间，视需要而定）。最好用锡箔纸包裹反映盒，使显色在黑暗中进行。定期却出切片在显微镜最好用锡箔纸包裹反映盒，使显色在黑暗中进行。定期却出切片在显微镜下检测反应强度，根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为蓝紫色。下检测反应强度，根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为蓝紫色。将切片浸入缓冲也将切片浸入缓冲也以终止反应。以终止反应。复染，可用派咯宁丫复染，可用派咯宁丫10-30s10-30s。流水洗流水洗5-10min5-10min，直至水无色为止。，直至水无色为止。以以PBS/PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可用甘油封固切片，如要永久保存，可用DPXDPX封固。封固。第45页，共45页。
